全 文 ：错误折叠蛋白正确折叠的作用 [ 8] 。 研究表明 , 内质网应激参与
了脑缺血再灌注损伤 ,缺血(氧)、缺氧复氧可诱导心肌细胞内质
网应激 , GRP94表达上调是内质网应激的标志之一。本研究表
明烧伤后心肌细胞存在内质网应激 , 并诱导心肌细胞凋亡 , 参与
烧伤后心肌损伤。降低烧伤后心肌细胞内质网应激程度可能是
防治严重烧伤后心肌损伤的重要途经。
研究表明 [ 9] , 烧伤动物血浆 TNF-α水平与反映心肌损伤敏
感指标血浆心肌肌钙蛋白 T(cTnT)的变化呈密切正相关 ,且血浆
TNF-α水平与心肌组织 TNF-α水平呈正相关 , 说明严重烧伤
后无论血浆及心肌组织的 TNF-α水平都是增高的 , 并发现缺血
或内毒素可促使心肌细胞合成 、释放 TNF-α。 本研究结果表
明 , 川芎嗪对烧伤后动物血浆及心肌组织中 TNF-α水平升高有
很好的抑制作用。这可能是川芎嗪对烧伤后心肌损害有保护作
用的机制之一。
研究还表明 , 适当的 ERS可诱导葡萄糖调节蛋白类
(GRPs)、蛋白质折叠酶表达上调 , 增强细胞耐受应激刺激的能
力;持续而又严重的内质网应激则会触发凋亡信号通路 , 诱导促
凋亡因子 TNF-α、caspase-12、CHOP/GADD153等表达和活化 ,
在许多疾病 [ 10]的发生发展中起重要作用。本研究结果显示 , 大
鼠心肌 Caspase-3活性在伤后 3h开始升高 , 伤后 12 h达高峰 ,
48 h后仍显著高于对照组(0.35±0.06);川芎嗪治疗组对烧伤
后心肌 Caspase-3活性较烧伤组均有显著性降低(P<0.05)。
表明烧伤后心肌细胞存在内质网应激 , 并可能介导心肌细胞凋
亡 , 参与烧伤后心肌损伤;川芎嗪对烧伤后心肌细胞 Caspase-3
活性增加有较好的拮抗作用 , 减少烧伤后心肌细胞凋亡 , 这可能
是川芎嗪对烧伤后心肌损害有保护作用的另一种机制 [ 11] 。随着
内质网应激在心血管疾病中作用的深入研究 ,利用川芎嗪干预内
质网应激有望成为今后治疗缺血(氧)/再灌注损伤等心血管疾
病的新靶点。
参考文献:
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收稿日期:2009-12-10;　修订日期:2010-06-20
基金项目:广西壮族自治区教育厅自然科学基金(No.200710MS014)
作者简介:黄权芳(1973-),女(壮族),广西南宁人 ,现任广西中医学院附属第一医院主管中药师 ,硕士学位 ,主要从事中药临床及中药鉴定研究工作.
＊通讯作者简介:林　兴(1975-),男(壮族),广西南宁人 ,现任广西医科大学讲师 ,硕士学位 ,主要从事生化药理学 、心血管药理学研究工作.
六月青含药血清对 HepG2.2.15细胞HBVcccDNA的抑制作用
黄权芳 1 ,林　兴 2＊ ,黄仁彬2 ,张士军 2
(1.广西中医学院第一附属医院 ,广西 南宁　530023;　2.广西医科大学 ,广西 南宁　530021)
摘要:目的 观察六月青(Liuyueqing, LYQ)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法 采用血清药理学方法 , 在 HBV的
体外细胞培养系统中(2.2.15细胞)进行 LYQ抗 HBVcccDNA作用观察。结果 LYQ含药血清在 HepG2.2.15细胞培养
中可有效地抑制细胞 HBVcccDNA的复制 ,其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论 LYQ在体外有明显的抑制乙肝
病毒的作用。
关键词:六月青;　乙型肝炎病毒;　HepG2.2.15细胞;　HBVcccDNA
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.011
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)11-2747-02
InhibitoryEffectoftheSerumContainingLiuyueqingonHBVcccDNAintheHepG2.2.
15Cels
HUANGQuan-fang1 , LINXing2＊ , HUANGRen-bin2 , ZHANGShi-jun2(1TheFirstAfiliatedHospitalofGuangxiTraditionalChineseMedicalUniversity, Nanning530023, China;
2.GuangxiMedicalUniversity, Nanning530021 , China)
Abstract:ObjectiveTostudytheanti-HBVactivityofLiuyueqing(LYQ)invitro.MethodsTheHBVinvitrocelculture
system(HepG2.2.15 cel)wasusedforexaminingtheanti-HBVactivityofLYQwithSerum-pharmacology.ResultsTheser-
umcontainingLYQcoulddecreasetheHBVDNAlevelinHepG2.2.15 cels, anditsinhibitoryefectsweredose-andtime-
dependent.ConclusionLYQcaninhibitHBVDNAinvitrosignificantly.
Keywords:Liuyueqing;　HBV;　HepG2.2.15cell;　HBVcccDNA
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11 时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
　　六月青(Liuyueqing, LYQ)系爵床科(Acanthaceae)植物肖鸡
笼(顶花马兰)Taraphochlamysaffinis(Griff)Bremekhu[ Strobi-
lanthesafinis(Grif)Y.C.Tang]的干燥地上部分 [ 1] 。本课题组
前期研究发现 , 六月青含药血清对 HepG2.2.15细胞系 HBsAg-
HBeAg有明显抑制作用 [ 2] , 其总皂苷对 HBV-DNA的复制有显
著的抑制作用 [ 3] 。本实验研究六月青含药血清对 HepG2.2.15
细胞 HBVcccDNA的作用 ,进一步探讨六月青抗乙肝作用机制。
1　材料与仪器
1.1 　药物 六月青(Liuyueqing, LYQ)采于广西灵山 , 由广西中
医学院一附院黄权芳中药师鉴定 ,其水提物由广西医科大学药理
学教研室和广西医学科学实验中心提取。
1.2　动物 Wistar大鼠 , 雌雄各半 ,体质量(250 ±10)g, 实验动物
使用许可证号:SYKG桂 2003-0005;实验动物生产许可证号:
SCXKG桂 2003-0003;由广西医科大学实验动物中心提供。
1.3　细胞株 HepG2.2.15细胞株(北京医科大学第一附属医院
病毒研究所),本室自行传代 , 定期用 G418筛选。
1.4　试剂 阿昔洛韦(Aciclovir, ACV湖南迪诺制药有限公司医
药工业研究所产品 , 批号:20070518);RPMI1640培养基(美国
Gibco公司 , CatNo.21202-016);胎牛血清(美国 Gibco公司 , Cat
No.21607-042);G418(美国 Sigma公司 , CatNo.228527-72);
QIAampDNAMiniKit试剂盒(Qiagen公司 , No.127141405);HBV
DNA荧光定量 PCR试剂盒(深圳匹基生物工程股份有限公司 ,
批 号:20070613);SYBR Green PCR Kit(Qiagen公 司 ,
No.127144035)。
1.5　仪器 iCyclerFQ实时荧光定量 PCR仪(美国 Bio-Rad公
司);CO
2
孵箱(美国 ThermoForma公司 , Model311)。
2　方法
2.1　 LYQ含药血清的制备 3月龄 Wistar大鼠 50只 ,随机分为
5组 ,每组 10只。 ①空白对照组:等量的生理盐水;②阳性对照
组:ACV0.1mg· kg· d-1;③LYQH组:6.6g· kg· d-1;④LYQM
组:3.3 g· kg· d-1;⑤LYQL组:1.7 g· kg· d-1。各组动物在同
样条件下饲养 , 均以 2次 /d,早晚各 1次空腹灌胃 , 连续给药 7d。
于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水 12h)后 2h,乙醚吸入麻醉 ,腹主
动脉抽血 , 低速离心分离血清 , 并将每组动物的血清混合。经
56℃ 30 min灭活处理 , 经 0.45μm的微孔滤膜 ,再经 0.22 μm微
孔滤膜过滤除菌后 , 置 -20℃冰箱保存备用。
2.2 　引物合成 P1:ACCGTGTGCACTTCGCTFC, P2:AGTAGGA-
CATGAACAAGAGATGATTAGG;另一对引物 , 其正义引物与反义
引物均位于负链缺口下游双链区域 ,可同时扩增:rcDNA和 cccD-
NA。 P3: GCCTCCAAGCTGTGCCTFG, P4: TCTGCGACGCG-
GCGATrGAG。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.3 　细胞的培养 取 HepG2.2.15细胞 1瓶 , 用胰酶消化后制
备成单细胞悬液 , 计数后调整细胞浓度至 2×104cel· ml-1 ,加入
24孔细胞培养板 , 每孔 900 μl, 置 CO2孵箱(37℃, 5%CO2)中培
养 24h后 , 分别加入各组含药血清 100 μl, 每个浓度 3个复孔。
以等量的完全培养液为空白对照。 连续培养 72 h后 , 分别吸出
上清液于 1.5 ml灭菌 Eppendor管中 , -20℃保存 , 统一待检。
再次加入上述含药血清的培养液继续培养 72 h后 , 分别吸出上
清液于 1.5 ml灭菌 Eppendorf管中 , -20℃保存 ,统一待检。
2.4 　HBV ccDNA的提取 取细胞样本 , 离心去上清液 , 用
QIAampDNAMiniKit试剂盒抽提 cccDNA, 按试剂盒说明书操
作。 cccDNA产物溶于 50 mlpH8.0的 TE溶液。测定提取物吸
光度 A260nm和 A280nm, 根据 A260和 A280的比值计算样品的 DNA
纯度。
2.5 　酶切 cccDNA 取 cccDNA提取物 10 μl, 用绿豆核酸酶酶
切。 37℃温育 25min,用 2μl100mmol· L-1的 EDTA(pH7.4)灭
活绿豆核酸酶。
2.6 　 PCR扩增 [ 4] 取 5 μl样品 , 加入 PCR试剂和引物 ,各反应
管放入 FQ-PCR仪 , 按以下条件进行扩增:94℃预变性 1 min,
95℃变性 5s, 60℃退火 、延伸 20s。共反应 42个循环。扩增过程
及荧光信号检查 、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自
动完成 。
2.7　统计学处理 采用 SPSS10.0统计软件分析数据 ,组间比较
采用方差分析。
3 　结果
与空白对照组比较 , LYQ中 、高剂量含药血清作用 72, 144 h
后 , HepG2.2.15细胞上清液中 HBVcccDNA的拷贝数明显降低
(P<0.05或 P<0.01),提示对 HBVcccDNA具有显著的抑制作
用 , 并且随着药物浓度和作用时间的增加 , 其抑制作用逐渐增强 ,
呈现一个明显的量效和时效反应关系。结果见表 1。
表 1　YLQ含药血清对 HepG2.2.15细胞 HBVcccDNA的抑制作用( x±s)
组别 72hcopies 抑制率(%)
144h
copies 抑制率(%)
空白对照 8.83±0.61 - 12.83±2.13 -
ACV 3.79±0.22＊＊ 57.1 5.07±0.97＊＊ 60.5LYQL 6.26±0.64 29.1 8.92±1.35 30.5
LYQM 5.22±0.55＊ 40.9 7.19±0.89＊ 43.9
LYQH 4.76±0.47＊ 46.1 6.21±0.93＊＊ 51.6
　　与空白对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01;n=3
4　讨论
目前慢性乙型肝炎已成为危害人类健康的主要疾病。分子
生物学研究表明 , HBV-DNA的复制机制复杂且独特 , 其复制周
期开始于共价环状闭合 DNA(covalentlyclosedcircularDNA,
cccDNA), 以其为模板利用宿主细胞的酶转录为前基因组 RNA,
逆转录为负链 DNA, 再合成正链 DNA,双链 DNA又成熟为 cccD-
NA, 是一个连续的过程。 cccDNA水平的高低与病情复发密切相
关。因此检测 cccDNA的表达 , 不仅可作为评价药物疗效的重要
指标 , 对病情的诊断及用药指导也有重要的意义。
中药是祖国医学的宝贵财富 ,其中不乏对乙肝病毒有效的药
物。本课题组之前的研究显示 ,六月青含药血清对 HepG2.2.15
细胞系 HBsAg、HBeAg有明显抑制作用 [ 2] , 其总皂苷对 HBV-
DNA的复制也有显著的抑制作用 [ 3] , 提示六月青体外有较好的
抗 HBV作用。本实验结果表明 , LYQ中 、高剂量含药血清作用
72, 144 h后 , HepG2.2.15细胞上清液中 HBVcccDNA的拷贝数
明显降低(与空白对照组比较 , P<0.05或 P<0.01), 提示对
HBVcccDNA具有明显的抑制作用 ,并且随着药物浓度和作用时
间的增加 , 其抑制作用逐渐增强 , 呈现一个明显的量效和时效反
应关系 。
本研究通过体外实验进一步证实了六月青有良好的抗乙肝
病毒活性。虽然其确切机制尚待阐明 , 但我们的研究结果表明 ,
六月青是一有良好研发前景的抗 HBV药。
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11