全 文 ：肋柱花粉剂抗乙型肝炎病毒体外实验研究
白梅荣 ,高玉峰 ,巴根那
(内蒙古民族大学 ,内蒙古 通辽 028041)
　　摘要　目的:探讨肋柱花粉剂体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法:将肋柱花粉剂作用于 HepG2.2.15细
胞系 , MTT法检测样品对 HepG2.2.15细胞的毒性 , ELISA法检测细胞上清中 HBsAg、HBeAg的变化 ,实时荧光定量
PCR法检测细胞与其上清中总 HBVDNA含量 ,综合评价肋柱花粉剂及胶囊剂体外抗 HBV效果 ,并探讨其药理机
制。结果:肋柱花对 HepG2.2.15细胞毒性低 , 对细胞分泌 HBsAg、HBeAg无抑制作用 , 对细胞内 HBVDNA拷贝数
有一定的抑制作用。结论:肋柱花在体外有一定的抗乙肝病毒作用 ,可能是通过抑制 HBVDNA,诱导感染 HBV的
HepG2.2.15细胞凋亡而发挥抗病毒活性。
　　关键词　肋柱花;乙型肝炎病毒
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)05-0789-03
收稿日期:2009-08-20基金项目:内蒙古自治区教育厅资助重大项目(ZD01107)作者简介:白梅荣(1972-),女,蒙古族 ,副教授 ,博士 ,主要从事蒙药药理毒理研究。
　　肋柱花是蒙医习用的清 “协日 ”要药。 1998年
被卫生部药品标准(蒙药分册)收载 〔1〕。 “协日 ”在
脏腑中与肝胆有着最密切的关系。它的正常功能是
滋阴生阳 、振奋精神 、强智 、生志 、消化食物。体内
“协日”失常 ,出现黄疸 、口苦 、胃酸 、烦渴 、呕吐 、热
泻 、神情狂躁等热性症状。清 “协日 ”药可解除或缓
解这些症状 〔2〕。故肋柱花在临床上常用于治疗肝
胆疾病 。从目前已知的药理研究结果来看 ,肋柱花
所含口山酮类化合物 、木犀草素 、齐敦果酸等均具有
不同程度的利胆 、保肝活性 ,可在一定程度上揭示肋
柱花用于治疗肝胆疾病的物质基础。本研究观察了
肋柱花对乙型肝炎病毒的影响 ,以探索能抗乙型肝
炎病毒的蒙药新药。
1 　材料与仪器
1.1 　细胞株　HepG2.2.15细胞株 ,美国国立医学
院构建 ,王升启研究员惠赠 ,本室自行传代培养 。
1.2 　药物与试剂　肋柱花粉剂由内蒙古民族大学
蒙医药学院提供;DMEM培养液(Gbico产品),培养
液添加 10%胎牛血清(HyoloneLab产品), 380 g/
mLG418(Gbico产品), 300 g/mL谷氨酰胺(0374-
AMRESCO分装 );胰蛋白酶 (AMRESCO产品 ,
0.25%配置备用);二甲基亚砜(DMSO)(ACROS分
装);HBsAg、HBeAg诊断试剂盒(上海科华生物工
程公司产品);基因组 DNA纯化试剂盒(Promega产
品);HBVDNAPCR荧光检测试剂盒(中山大学达
安因股份有限公司产品)
1.3 　主要仪器　ABI7000序列检测仪(AppliedBi-
osystems);MULI全自动酶标仪(ThermoLabsysterms
MultiskanMK3)。
2　方法
2.1　对 HepG2.2.15细胞的药物处理　对数生长
期的 HepG2.2.15细胞 ,胰蛋白酶消化后分散成单
个细胞悬液 ,以 1×104 /孔接种 96孔板 , 180 μL/孔。
1d后待细胞贴于孔底 ,加药物 20 μL/孔。 DMSO
溶解药物 ,每孔 DMSO浓度 =1%,每个浓度重复 2
孔 ,设细胞对照孔和培养液对照孔 。加药终浓度分
别为 200、100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41、0.14、
0.05 g/mL,每 3d换新鲜培养液 ,加药。
2.2　样品对 HepG2.2.15细胞毒性的测定　样品
与细胞作用 9 d后 , 取上清 ,余下细胞加入含 MTT
0.5 mg/mL的新鲜培养液 100 μL/孔 , 37 ℃、 5%
CO2孵育 4 h,弃上清液 ,加 DMSO200 μL/孔 ,避光
振荡待紫色颗粒完全溶解后 ,单波长 540 nm检测光
密度 D(λ)值 ,拟合出半数细胞毒性浓度(TC50)。
　细胞生长抑制率(%)=
D(λ)细胞对照孔 -D(λ)加药孔D(λ)细胞对照孔 -D(λ)培养液对照孔 ×100%
2.3　HepG2.2.15细胞上清中 HBsAg、HBeAg的测
定　样品与细胞作用 9 d后 ,取上清 ,按 HBsAg、
HBeAg诊断试剂盒说明书操作 ,自动酶标仪读取
D(λ)值 ,双波长 450nm/630 nm检测 。Origin软件
进行曲线拟合 ,得出 IC50。
　细胞生长抑制率(%)=
D(λ)细胞对照孔 -D(λ)加药孔D(λ)细胞对照孔 -D(λ)培养液对照孔 ×100%
2.4　治疗指数计算
治疗指数(TI)=TC50 /IC50
2.5　HepG2.2.15培养上清和细胞内总 HBVDNA
水平检测　取在 33.33 g/mL对 HepG2.2.15细胞
几无毒性的样品 ,进一步检测其对细胞总 HBVDNA
水平的影响。按基因组 DNA纯化试剂盒说明书操
·789·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 5期 2010年 5月DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.05.045
作 ,提取培养上清和细胞内总 HBVDNA,取 2 μL,
加入 HBVDNAPCR荧光检测试剂盒中的 PCR反
应管 , 6 000 r/min离心数秒 ,放入 PCR仪中 ,设循环
参数如下:93 ℃ 2 min1 cycle;93 ℃ 45 s, 55 ℃ 1
min10cycles;93℃ 30s, 55 ℃ 45 s30 cycles,反应
约 1 h46 min。
3 　结果
3.1 　肋柱花粉剂对 HepG2.2.15细胞的毒性　结
果如表 1所示 ,肋柱花粉剂对 HepG2.2.15细胞毒
性很弱 。第一批结果细胞毒性较明显 ,可能与第一
批试验时细胞状态欠佳有关。
　表 1　　　肋柱花粉剂在体外对 HepG2.2.15
生长的抑制作用
批次 浓度 /(μg/mL) 抑制率 /%
第一批 200 68.1
100 18.3
33.33 7.9
11.11 9.8
3.70 12.0
1.23 7.8
0.41 11.1
0.14 9.0
0.05 5.3
TC50 141.30
第二批 200 10.4
100 3.0
33.33 5.5
11.11 2.8
3.70 1.7
1.23 -0.5
0.41 1.1
0.14 2.2
0.05 7.5
TC50 >200
第三批 200 5.7
100 7.1
33.33 2.3
11.11 8.3
3.70 5.9
1.23 3.3
0.41 3.2
0.14 11.6
0.05 3.2
TC50 >200
3.2　肋柱花粉剂对 HBsAg、HBeAg分泌的影响　
结果如表 2所示 ,肋柱花粉剂对 HBsAg和 HBeAg的
分泌均无明显抑制作用;在第一批试验中肋柱花粉
剂的浓度为 200 g/mL时对 HBsAg有显著的抑制作
用 ,是由于试验时细胞状态欠佳而产生了大的细胞
毒性 ,药物直接抑制了细胞的生长所致 。第一批试
验对 HBsAg的 TI较低和对 HBeAg的分泌有抑制作
用 ,是试验时细胞状态欠佳药物直接抑制了细胞的
生长所导致。
　表 2　肋柱花粉剂体外对 HBsAg、HBeAg分泌的影响
批次 浓度 /(μg/mL) HBsAg抑制率 /% HBeAg抑制率 /%
第一批 200 69.6 13.1
100 9.1 -16.2
33.33 93.9 -17.2
11.11 -19.7 -15.3
3.70 -13.4 -20.2
1.23 -12.4 -13.3
0.41 -21.5 -11.6
0.14 -12.6 -12.3
0.05 -6.6 -7.7
IC50 120.57 >200
TI 　1.17
第二批 200 31.4 -0.8
100 27.4 2.4
33.33 15.2 5.7
11.11 6.8 -1.2
3.70 6.6 -2.0
1.23 0.1 -0.5
0.41 4.2 -1.5
0.14 3.4 -5.8
0.05 5.6 3.7
IC50 >200 >200
TI
第三批 200 18.5 　5.6
100 15.3 1.8
33.33 3.6 2.8
11.11 -0.3 3.1
3.70 -1.9 1.4
1.23 -4.4 -0.6
0.41 -5.0 -3.3
0.14 -3.8 -3.3
0.05 -1.9 2.0
IC50 >200 >200
·790· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 5期 2010年 5月
3.3 　肋柱花粉剂对 HBVDNA拷贝数的影响　结
果如表 3、4所示 ,肋柱花粉剂选择低毒或无毒浓度
33.33 g/mL、 3.70 g/mL和 0.41 g/mL, 观察其对
HepG2.2.15细胞产生 HBVDNA拷贝数的影响 。
结果发现:肋柱花粉剂对细胞内 HBVDNA拷贝数
有一定的抑制作用。
　表 3　　　　肋柱花粉剂对 HepG2.2.15细胞
HBVDNA拷贝数的影响
批次 浓度 /(μg/mL)
细胞上清中HBVDNA拷贝数 /(×104copy/mL)
细胞内HBVDNA拷贝数 /(×1010copy/mg)
第二批 33.33 5.34 2.53
3.70 7.71 3.02
0.41 7.21 6.19
细胞对照 5.29 4.31
第三批 33.33 9.61 2.83
3.70 5.18 4.24
0.41 3.66 4.13
细胞对照 6.37 4.46
　表 4　　　肋柱花粉剂对 HepG2.2.15细胞
HBVDNA拷贝数抑制率的影响
批次 浓度 /(μg/mL)
细胞上清中HBVDNA拷贝数抑制率 /%
细胞内HBVDNA拷贝数抑制率 /%
第二批 33.33 -0.8 41.2
3.70 -45.6 29.9
0.41 -36.2 -43.8
第三批 33.33 -50.9 36.5
3.70 18.6 5.0
0.41 42.4 7.4
4 　讨论
　　本实验结果表明 ,肋柱花粉剂对 HepG2.2.15
细胞毒性低 ,对 HepG2.2.15细胞培养上清中 HB-
sAg和 HBeAg的水平均无明显抑制作用 ,但对细胞
内 HBVDNA拷贝数有一定的抑制作用。
　　乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBVims
HBV)感染引起 。HBV在世界范围内传播 ,估计全
世界有乙型肝炎患者及无症状乙型肝炎携带者达
3.5亿之多 ,分布于各年龄组中 。我国的感染率在
10 %以上 ,每年都有近 200万乙型肝炎患者因转变
为肝硬化或肝癌而死亡 〔3, 4〕。目前研究的抗 HBV
作用靶标包括与病毒吸附 、入胞 、脱壳以及复制环节
的转录期 、逆转录期及 DNA复制期 、病毒基因壳体
化 、出芽进入内质网和病程发展的早期阶段等有关
的病毒和细胞调节因子 〔5〕。培养上清中 HBsAg、
HBeAg水平与 HBVDNA合成的抑制有一定相关
性 ,但不成正比 ,两者不完全一致 。
　　乙型肝炎属于传统蒙医的 “肝热症 ”、“肝肿大 ”
的范畴。蒙医认为本病系由于三根(赫依 、协日 、巴
达干)相对平衡失调而 “协日”偏盛客于肝 ,与血相
搏并兼夹粘邪所致 〔6〕。肋柱花由于具有抑 “协日 ”
和清热的功效 ,而在蒙医临床上具有长期的治疗肝
胆疾病的历史 ,疗效也很确切。通过本次实验初步
发现 , 肋柱花能部分抑制 HepG2.2.15细胞内的
HBVDNA复制 , 但在表达的抗原及上清中 HBV
DNA水平未观察到变化。其机制可能通过抗 HBV
及调节免疫功能等多靶点作用而实现的 。
参 考 文 献
[ 1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国
卫生部药品标准· 蒙药分册 [ S].1998:15215.
[ 2] 内蒙古自治区卫生厅.内蒙古蒙成药标准 [ S] .赤峰:
内蒙古科学技术出版社 , 1984:401-402.
[ 3] 梁晓峰 , 陈园生 ,王晓军 , 等.中国 3岁以上人群乙型肝
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(9):655-658.
[ 4] LaiCL, GaneE, LiawYF, etal.MaximalearlyHBVsup-
pressionispredictiveofoptimalvirologicandclinicaleffe-
cacyinnucleoside-treatedhepatitisBpatients:scientific
obsertvtionsfromalargenultinationaltrial(theglobestud-
y)[ J].Hepatology, 2005, 42:232A-233A.
[ 5] 李涤尘 .乙型肝炎病毒携带者的中医药治疗探讨 [ J] .
湖北中医杂志 , 2002, 24(1):3-4.
[ 6] 郭永胜 , 宝玉 .蒙药治疗脂肪肝 52例的超声诊断评价
[ J] .中国民族医药杂志 , 2006, 5(3):19.
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·791·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 5期 2010年 5月