全 文 ：罗汉果茎尖超低温保存后再生植株的遗传稳定性研究
刘华英 ,覃灵华 ,罗春玉 ,石贵玉　(广西师范大学生命科学学院 ,广西桂林 541004)
摘要　[目的 ] 检测罗汉果茎尖玻璃化法超低温保存后再生植株的遗传稳定性。 [方法] 对罗汉果玻璃化法超低温保存前后的植株进
行过氧化物酶(POD)和酯酶(EST)同工酶酶谱分析、染色体计数和随机扩增多态性 DNA(RAPD)分子标记。 [结果] 超低温保存前后 ,
POD同工酶图谱上均显示 9条酶带 ,且迁移率一致;EST同工酶图谱上均显示 8条酶带 ,迁移率也一致;POD和 EST同工酶谱 、染色体数
目和RAPD谱带均未发现差异。 [结论] 玻璃化法超低温保存罗汉果种质资源安全、稳定。
关键词　罗汉果;超低温保存;同工酶;染色体;RAPD
中图分类号　S667.9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)02-00629-03
StudiesontheGeneticStabilityofRegeneratedPlantsfromSiraitiagrosvenoriiShoot-tipsafterCryopreservation
LIUHua-yingetal　(CollegeofLifeScience, GuangxiNormalUniversity, Guilin, Guangxi541004)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtoexaminethegeneticstabilityofregeneratedplantsfromSiraitiagrosvenorishoot-tipsaftercryopr-
eservationbyvitrificationmethod.[Method] PlantsbeforecryopreservationandthoseregeneratedfromSiraitiagrosvenorishoot-tipsaftercryopr-
eservationbyvitrificationwereexaminedbyperoxidaseandesteraseisoenzymeanalysis.Thenumberofchromosomeswascountedandthemole-
culemarkersofrandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD)wasmade.[ Result] Beforeandaftercryopreservation, therewere9bandsonPOD
isoenzymepaternsandtherewere8bandsonESTisoenzymepaterns, withthesamemobility.Therewerenovariationsbeforeandaftercryopr-
eservationatperoxidaseandesteraseisozymepaterns, thenumberofchromosomesandRAPDpaterns.[ Conclusion] CryopreservationofS.gros-
venorigermplasmresourcesbyvitrificationwassafeandstable.
Keywords　Siraitiagrosvenori;Cryopreservation;Isozyme;Chromosome;RAPD
基金项目　广西自然科学基金项目(桂科自 0542032);广西师范大学博
士启动基金项目;广西研究生教育创新计划项目(20081-
06020710M255)。
作者简介　刘华英(1971-),女 ,广西桂林人 ,博士 ,副教授 , 从事植物
细胞生物学教学 、科研工作。
收稿日期　 2009-08-31
　　超低温保存是保存植物种质和生物多样性的重要途径 。
在超低温保存过程中 ,保持物种的遗传稳定性是备受关注的
重要课题。遗传稳定性研究的方法很多 ,目前应用较为广泛
的遗传标记有形态标记 、细胞标记 、生化标记和 DNA分子标
记 [ 1-2] 。对黄独 、欧洲赤松等超低温保存后材料的遗传检测
均未发现变异 [ 3-4] 。罗汉果 [ Siraitiagrosvenori(Swingle)C.
Jefrey]为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)多年生
草质藤本 、雌雄异株植物 ,广西特有的珍贵经济 、药用植物 ,
具有重要的经济价值。在长期的自然进化与栽培过程中 ,由
于长期的无性繁殖 、病虫害 、自然灾害等原因 ,使罗汉果种质
资源受到严重威胁 ,部分种濒临灭绝 [ 5] 。笔者在成功建立的
罗汉果茎尖玻璃化超低温保存体系基础上 [ 6-7] ,对其再生植
株进行染色体数目计数 、同工酶分析和随机扩增多态性 DNA
(RAPD)检测 ,以探讨材料冻存后的遗传稳定性 ,为长期 、安
全地保存罗汉果种质资源提供技术支持 ,推动罗汉果种质超
低温保存向实用化方向发展。
1　材料与方法
1.1　材料　参照刘华英等 [ 7]的方法 ,取继代 15 d生长健壮
的罗汉果试管苗茎尖进行超低温保存和植株再生。栽培苗
由广西植物研究所提供 。该试验以超低温保存再生雌株和
栽培苗雌株为研究对象。
1.2　方法
1.2.1　同工酶分析 。
1.2.1.1　酶液的制备。分别称取 1.0 g新鲜的栽培苗和再
生苗叶片 ,置于预冷的研钵中;按 1∶5(g/L)比例加入 0.2
mol/L磷酸缓冲液(pH值 7.0),冰浴研磨成匀浆;4 ℃静置 5
～10min,然后于 4 ℃、8 000r/min冷冻离心 10 min,取上清
液即为酶液 ,保存于 -20℃备用。所有取样重复 3次 。
1.2.1.2　凝胶电泳。采用垂直板状不连续聚丙烯酰胺凝胶
电泳 ,分离胶及浓缩胶的浓度分别为 7.5%(pH值 8.9)和
4.0%(pH值 6.8),电极缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH值 8.3),
凝胶大小为 13.0cm×11.0cm×0.1cm。栽培苗和再生苗过
氧化物酶(POD)上样量分别为 5和 8μl,栽培苗和再生苗酯
酶(EST)上样量分别为 30和 35 μl, 4 ℃条件下电泳 ,浓缩胶
电压为 80 V,分离胶电压为 200V,电泳时间约 3 h。
1.2.1.3　同工酶染色。POD同工酶染色采用醋酸 -联苯胺
法 , EST同工酶采用 α-醋酸萘酯 、β-醋酸萘酯和固蓝盐 B染
色 [ 8] 。凝胶进行染色后 ,用 7%HAc保存并拍照 ,所有样品
重复试验 3次以上。染色后 ,根据 Rf值(同工酶带迁移距
离 /溴酚蓝指示剂迁移距离)绘出各酶谱图并记录各酶带的
活性度 。活性度按酶带显示程度分 4个等级 ,用线条依次表
示为:
1.2.2　染色体的制备 。取超低温保存前后罗汉果试管苗根
尖 ,用 0.2%秋水仙素于常温下处理 2 h,固定液固定过夜 ,放
入 60℃浓度 1mol/L盐酸中解离 10min,将解离过的根尖放
入卡宝品红染色液内染色 。压片后用 OlympusBX51数码生
物摄影显微镜观察并拍照。
1.2.3　RAPD分析。
1.2.3.1　DNA提取。罗汉果栽培苗和再生苗叶片的总
DNA提取 ,参照萨姆布鲁克等 [ 9]的方法略加修改 ,提取的总
DNA经过酚 /氯仿 /异戊醇(25∶24∶1)抽提和 RNaseA纯化。
1.2.3.2　PCR扩增。RAPD反应体系为 25.0 μl,其中 CMg2+
为 1.5 mmol/L, dNTP为 0.2 mmol/L, 随机引物为 0.5
μmol/L, TaqDNA聚合酶单位为 1.0U,模板 DNA为 1 μl, 20
～ 100ng, 10×Bufer缓冲液 2.5 μl,用双蒸水补足至 25.0
μl。RAPD扩增在 BiometraUNOⅡPCR仪上进行 ,反应程序
为:94℃预变性 5 min, 94 ℃变性 1 min, 36℃退火 1 min, 72
℃延伸 2 min,共进行 40个循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(2):629-631, 673 责任编辑　张杨林　责任校对　张士敏
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.02.137
PCR扩增完成后 ,取 7 μl反应液和 3 μl上样缓冲液混合点
样于 1.5%琼脂糖凝胶上 ,于 1×TAE缓冲液中电泳检测 ,经
EB染色后的凝胶在复日科技 FR-200生物电泳图像分析系
统上照相。
2　结果与分析
2.1　同工酶分析结果　在罗汉果叶中 , POD同工酶酶带多 ,
活力也很强 ,尤其是栽培苗的酶活力明显高于组培苗。为了
使同工酶酶带的活性度一致 ,罗汉果栽培苗和超低温保存后
再生苗的酶液上样量分别为 5和 8 μl。从同工酶图谱上看 ,
罗汉果栽培苗和超低温保存后再生苗都显示出 9条酶带 ,迁
移率也一致 ,且表现出一致的活性度(图 1,表 1)。结果表
明 ,罗汉果茎尖玻璃化法超低温保存后 POD同工酶保持了
酶带数量和活性的一致 ,即保持了 POD同工酶的稳定。
　注:1 ～ 3为栽培苗同工酶谱;4～ 6为冻存后再生苗的同工酶谱。
图 2同。
　Note:1-3, Peroxidaseisoenzymepaternofcontrolshoots;4-6,
Peroxidaseisoenzymepaternsofregeneratedshootsaftercryo-
preservation.ThesameasFig.2.图 1　罗汉果POD同工酶图谱Fig.1　PeroxidaseisoenzymepatternofS.grosvenoriinPAGE
表 1　罗汉果 POD同工酶的迁移率
Table1　RfofPODisoenzymeofS.grosvenori
酶带编号No.ofenzymebands
Rf1 Rf2
酶带编号No.ofenzymebands
Rf1 Rf2
P1 0.056 0.056 P6 0.571 0.571P2 0.107 0.107 P7 0.611 0.611
P3 0.256 0.256 P8 0.637 0.637P4 0.395 0.395 P9 0.661 0.661
P5 0.548 0.548
　注:Rf1为栽培苗同工酶的迁移率;Rf2为超低温保存后再生苗的同工酶迁移率。下表同。　Note:Rf
1
, RfofPODisoenzymeincontrolshoots;Rf
2
, RfofPOD
isoenzymeintheregeneratedshootsaftercryopreservation.Thesame
asbelow.
　　EST同工酶是能水解酯键的一组酶 ,这组酶受到 DNA
上不同位点的控制 ,同时又受到同一位点不同等位基因的控
制 ,因而表现的酶谱很复杂 ,是多态性很高的一组同工酶。
该试验中 ,罗汉果栽培苗和超低温保存后再生苗的 EST同工
酶表现与 POD同工酶相似 ,没有酶带数量上的增减 ,都显示
了 8条酶带 ,迁移率也一致 ,活性强度无明显差别 (图 2,表
2)。这说明罗汉果茎尖玻璃化法超低温保存前后在 EST同
工酶上的遗传稳定性。
由 POD和 EST同工酶电泳结果可见 ,冻存前后罗汉果
茎尖 POD和 EST同工酶的酶谱没有明显差异 ,显示了罗汉
果茎尖超低温保存再生植株在生化水平上的遗传稳定性 ,表
明同工酶分析可作为检测其超低温保存遗传稳定性的一种
手段。
图 2　罗汉果 EST同工酶图谱
Fig.2　ESTisozymepatternofS.grosvenori
表 2　罗汉果EST同工酶的迁移率
Table2　RfofESTisozymeofS.grosvenori
酶带编号No.ofenzymebands Rf1 Rf2
酶带编号No.ofenzymebands Rf1 Rf2
E1 0.127 0.127 E5 0.633 0.633E2 0.181 0.181 E6 0.719 0.719E3 0.566 0.566 E7 0.764 0.764E4 0.605 0.605 E8 0.934 0.934
2.2　染色体数目　对罗汉果根尖染色体的观察发现(图
3),保存后的再生植株在染色体数目上与保存前的对照一
致 ,都为 2n=28,与 Darlington等 [ 10]和庄伟建等 [ 11]研究得出
的罗汉果染色体的数目一致 ,没有染色体缺失或增加现象 ,
说明玻璃化法超低温保存方法得到的再生植株在染色体水
平上可较好地保持遗传稳定 。
　注:A为冻存前试管苗的染色体;B为冻存后再生苗的染色体。
　Note:A, Chromosomeofcontrolshootsbeforecypreservation;B, Chromosomeofregeneratedshootsaftercypreservation.
图 3　罗汉果玻璃化法超低温保存前后的染色体
Fig.3　ChromosomeofS.grosvenoribeforeandaftercypreservationbyvitrification
630 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2010年
2.3　RAPD分析结果　用改良的 CTAB方法对罗汉果植株
叶片样品进行总 DNA提取 , 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,所
提取的 DNA量较一致 ,没有拖尾及弥散现象 ,纯度较高 ,达
到了 RAPD反应要求。
以栽培苗 DNA为模板 ,从 30个随机引物中筛选出了 14
个扩增条带多而亮的引物进行 PCR分析 , 14个引物分别为:
S2、S15、S31、S50、S69、S80、S87、S93、S99、S113、S235、S293、S326、
S353。随机挑选冻存后再生苗 ,提取其总 DNA,然后以筛选出
的上述 14个引物作 PCR扩增 ,所得条带中 ,每个随机引物扩
增条带在 2 ～8条 ,再生苗所得到的条带与栽培苗的扩增结果
比较 ,未发现差异带(图 4),说明玻璃化超低温保存方法能在
DNA水平上较好地保持超低温保存后植株的遗传稳定性。
注:1为栽培苗;2为冻存后再生苗;M为 LambdaDNA/HindⅢ +
EcoRⅠ Markers。
Note:1, Controlshoots;2, Regeneratedshootsaftercypreservation;M,
LambdaDNA/HindⅢ +EcoRⅠ Markers.
图 4　罗汉果DNA部分随机引物RAPD扩增结果
Fig.4　PartialRAPDamplificationresultsofDNAfromS.gros-
venoriwithrandomprimers
3　结论与讨论
(1)植物同工酶是基因的表达 、基因的变化和差异在酶
谱上的反映 ,它具有明显的种属 、组织和发育阶段的特异性 ,
既可作为生理指标 ,又是可靠的遗传标志 [ 8] 。对苹果 POD
同工酶电泳发现 ,超低温保存再生苗与对照苗同工酶的酶谱
类型几乎没有差异 ,没有酶带数目的增减 [ 12] 。该试验对罗
汉果的 POD同工酶和 EST同工酶进行电泳检测 ,所获酶谱
多且清晰 ,易于进行遗传检测分析 ,结果与苹果一致 ,即超低
温保存在蛋白质水平上保持了遗传稳定性。
　　(2)染色体数目和结构变异以及异常染色体行为在组织
培养中是很常见的现象 [ 13] 。但王子成用流式细胞仪对柑橘
超低温保存后再生植株进行倍性分析发现都为二倍体 ,染色
体压片也显示数目稳定 [ 14] 。由于罗汉果染色体小 ,给染色
体制备带来一定的困难 ,如染色体重叠现象较严重 ,染色体
不易分散 ,因而影响染色体计数 。邹琦丽曾报道罗汉果染色
体 2n=24[ 15] 。笔者对罗汉果染色体计数的结果与 Darlington
等 [ 10]和庄伟建等 [ 11]研究结果一致 ,即 2n=28,且超低温保
存前后 2n数目无差异。
　　(3)DNA分子标记很多 , RAPD技术虽然有其自身的不
足 ,但因其程序简单 ,无需 DNA探针 ,设计引物时无需预知
信息 ,快速 ,所需 DNA量少 ,能分析大量样品 ,成本低等优
点 [ 16]依然广为使用。 RAPD应用于鉴定超低温保存后再生
植株体细胞无性系的变异已有一些报道。Touchel等对稀有
濒临灭绝植物银桦的超低温再生苗应用该技术进行了基因
稳定性检验 ,没有发现变异条带 [ 17] ;Deverno等对液氮保存 3
和 4年的云杉胚性组织的再生苗进行了 RAPD分析 [ 18] ;Hely
等应用 RAPD技术对经玻璃化法超低温保存的欧洲赤松的
胚性培养物的基因稳定性进行了验证 ,未发现变异现象 [ 4] 。
该试验对罗汉果超低温保存后再生苗的 RAPD分析显示 ,未
出现变异条带 ,说明超低温保存能较好地保存 DNA的遗传
稳定性 。
(4)大部分超低温保存物种再生植株遗传稳定性检测都
没发现变异现象 [ 19-21] ,即使有变异现象 ,通常认为是试管苗
增殖而非超低温保存过程导致变异 [ 22] 。该试验从生化水
平 、细胞水平 、分子水平全面检测了罗汉果茎尖玻璃化法超
低温保存后再生植株的遗传稳定性 ,结果进一步支持了超低
温保存再生植株是遗传稳定的 ,说明该方法保存罗汉果试管
苗茎尖安全 、简便 、实用 ,是罗汉果属植物种质资源长期保存
的新途径。
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(下转第 673页)
63138卷 2期　　　　　　　　　　　　　　　　刘华英等　罗汉果茎尖超低温保存后再生植株的遗传稳定性研究
的富集能力。植物富集主要决定于生物本身的特性 ,特别是
植物体内存在的能与污染物相结合的活性物质的活性和数
量 。大豆不同部位对镉的累积能力表现为:果实 <根 <
茎叶。
表 1　大豆各部位对镉的累积能力
Table1　Cadmiumaccumulationineachpartofsoybean
部位
Part
镉平均含量∥mg/kg
AveragecontentofCd
富集系数
Enrichmentcoeficient
果实 0.50 0.23
茎叶 1.74 0.79
根 1.62 0.73
2.2　大豆不同部位镉的化学形态　分别采用亚沸水和模拟
胃液提取大豆不同部位的镉 ,并测定其含量 ,结果如表 2所
示 。用亚沸水主要提取植物中可溶于水的无机态(如游离态
的金属离子)和有机态重金属盐(如水溶性有机酸盐)[ 8] 。
研究表明 ,以可溶于水的无机态和有机态盐形式存在的镉
(即水溶态镉)活性最大 ,更容易被人和动物吸收 ,危害最大 。
由表 2可知 ,大豆各部位水溶态镉占总量的 14.20% ～
62.00%。杨居荣等研究了镉在一些植物可食用部分的形态
分布时发现 ,水溶态镉所占比例最大 ,为 45% ～ 69%[ 8] 。该
研究结果表明 ,大豆果实中水溶态镉占总量的 62.00%,说明
大豆果实中活性镉含量较高。
表 2　水和模拟胃液对大豆不同部位镉的提取量
Table2　TheextractedvolumeofCdbywaterandsimulatedgastric
juiceindiferentpartsofsoybean
部位
Parts
水Water
含量
mg/kg
Content
占总量的比例∥%
Proportionin
totalvolume
模拟胃液Simulatedgastricjuice
含量
mg/kg
Content
占总量的比例∥%
Proportionin
totalvolume
果实 0.31 62.00 0.48 96.00
茎叶 0.26 14.94 1.43 82.10
根 0.23 14.20 0.84 51.72
3　结论与讨论
众所周知 ,镉最主要的生物化学特性是它对蛋白质或其
他有机化合物中的巯基具有很强的亲和力 ,同时对蛋白质中
其他侧链也具有亲和力 ,因此在作物体内 ,镉常与蛋白质相
结合 [ 9] 。这种结合形态一方面可以减少以自由态存在的镉
含量 ,使其移动性和有效性降低 ,另一方面则由于镉可能和
体内功能蛋白相结合 ,从而对其功能发生干扰 ,造成生理 、生
化代谢过程紊乱。该试验在模拟胃液条件下 ,利用胃蛋白酶
的水解作用 ,将这些不溶于水的与 Cd结合的蛋白质水解成
溶于水的多肽或氨基酸 ,从而将这部分镉释放出来。此外 ,
在模拟胃液条件下不仅可将以可溶于水的无机盐和有机盐
形式存在的重金属提取出来 ,而且还可将以果胶盐和难溶性
碳酸以及难溶性磷酸盐和草酸盐形式存在的重金属提取出
来。由表 2可知 ,模拟胃液提取的镉明显高于水提取的镉。
因为模拟胃液呈酸性 ,为了便于与水溶态镉进行比较 ,该研
究将模拟胃液提取的镉称之为酸溶态镉 。
动物毒性试验表明 ,老鼠口服单一氯化镉的 LD50为
204.2 mg/kg,而同时口服 L2半胱氨酸(1 500 mg/kg)和氯
化镉时的 LD50为 56.3 mg/kg[ 10] 。另外 ,在半胱氨酸存在的
条件下口服氯化镉 ,会增加老鼠器官中镉的积累量 ,说明不
同形态的 Cd对动物具有不同的毒性。动物及人体消化道内
存在的胃蛋白酶主要水解芳香族或其他疏水氨基酸的羧基
或氨基形成的肽键 ,从而使与蛋白等大分子结合的镉转变成
小分子的络合物 [ 10] 。而这些小分子与镉形成的络合物对动
物和人体的毒性还有待于进一步研究。
该研究结果表明 ,大豆不同部位对土壤中镉的富集系数
均小于 1,且各部位对镉的吸收能力具有一定差异。模拟胃
液提取的镉高于水提取的镉 。大豆果实中各形态镉所占比
例最高 ,其次为茎叶 ,最后为根 。
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67338卷 2期　　　　　　　　　　　　　　　　张显龙等　大豆对镉的累积特性及形态研究