全 文 ：中药蓼大青叶及其伪品的 nrDNA ITS区序列的测定
李国强　王峥涛　李晓波　徐国钧
(中国药科大学生药学研究室　南京 210038)
　　摘　要　中药蓼大青叶的基源为蓼科蓼属植物蓼蓝(Polygonum tinctorium Ait),同属植物的水蓼(辣蓼),(P.hy-
dropiper L.)的叶常作其伪品。本文采用 PCR直接测序法 ,首次测定了它们的核糖体 DNA ITS 区序列 , 结果显示 , 两
者序列长度(ITS 1 、5.8 S 、ITS 2)均为646bp , 序列间共有 28 个变异位点。本研究为产蓝植物的 DNA 分子鉴定提供
了必要的序列资料。
关键词　蓼科;蓼属;蓼蓝;水蓼 , 核糖体 DNA;ITS 区序列
Determination of nrDNA ITS Sequence of LIAODAQINGYE(FOLIUM POLYGONI TINCTORII)and its Counterfeit
Li Guoqiang , Wang Zhengtao , Li Xiaobo , Xu Guojun
(Division of Pharmacognosy , China Pharmaeutical University , Nanjing 210038)
Abstract:As the traditional Chinese Medicine , Liaodaqingye(Folium Polygoni Tinctorii)is from Polygonum tinotorium Ait.Its
counterfeit form P.hydropiper L.Their nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer(ITS)regions were first sequenced.
Sequence analysis showed that the ITS region(including 5.8S coding reion)of P.tinctorium Ait.is 646bp in length , and that of
P.hydropiper L.is 646bp.There are 28 variable sites(including 5.8 S coding region)in pairwise comparison of the sequence.This
study could provide significant data for molecular identification of indigo plant at DNA level.
Key words:Polygonaceae L.;Polygonum L.;Polygonrm tinctorium Ait.;Polygonum hydropiper L.;nrDNA;ITS sequence
　　中药蓼大青叶具有清热解毒 ,凉血消斑之功效 。
历代医家均视之为蓝中佳品 。常用于主治瘟病发
热 ,发斑发疹 ,肺热喘咳 ,喉痹 ,痄腮 ,丹毒 ,痈肿[ 1] 。
我国药典规定本品为蓼科蓼属植物蓼蓝 Polygonum
tinctorium Ait.的干燥叶[ 2] 。蓼蓝的茎叶还可用来制
成青黛 ,其所含的靛甙还可作为半合成靛玉红的前
体物 ,靛玉红被发现为抗慢性粒细胞型白血病的有
效成分[ 3] 。蓼属的水蓼广布于我国南北各省区[ 4] ,
几乎随处可见 ,也常被作为蓼蓝的伪品。由于同属
于蓼属植物 ,给中药鉴定带来不少困难。为此我们
对其进行了分子鉴定 , 测定了蓼蓝(P .tinctorium
Ait.)和水蓼(P.hydropiper L.)核糖体 DNA ITS 区的
序列 ,为该属中药材的分子鉴定技术研究打下了必
要的基础 。
1　材料和方法
1.1　材料来源
用于提取总 DNA的材料均为干叶片 ,原植物均
经作者鉴定其学名。凭证标本保存于中国药科大学
药用植物标本馆(CPU),详细情况见表 1。
表 1　实验材料来源及凭证标本
种类 产地 凭证标本
蓼蓝
Polygonrm tinctorium
山东 赵浩如　无号
水蓼
P .hydropiper 江苏南京 李国强 99085
1.2　总DNA提取
蓼大青叶干药材 50mg 、水蓼干叶片 50mg 和新
鲜叶片 200mg ,分别用蒸馏水和 70%酒精轻拭叶表 ,
液氮研磨成细粉后 ,使用 DNeasyTMPlant Mini Kit(QI-
AGEN ,德国),按其规定操作顺序进行 DNA的提取 。
1.3　总DNA的分子量测定
上述所获得的两种植物共计三种样品的总
DNA ,各取 5μ1在 1%琼脂糖凝胶中电泳测定其分子
量 。标准物用 lkb ladder (GBICO ,美国)和λHind III
digest DNA Marker(TakaRa ,日本),如图 1(Figl)。
1.4　ITS区片段的 PCR扩增
ITS 区(包括 ITS 1 、5.8 S 、ITS 2)的扩增参照
Takaiw 等[ 5]的引物 ,设计为:
43中药蓼大青叶及其伪品的 nrDNA ITS 区序列的测定
　　Fig 1.Agarose gel electrophoresis analysis of total DNA Lane
1.Total DNA from dried plant of Polygonrm tinctorium;Land 2.To-
tal DNA from dried plant of P.hydropiper;Lan 2 .Total DNA from
fresh plant of P.hydropiper;Lane M2.1kb 1adder(GBICO , USA);
Lane M1.λ-Hind digest(TaKaRa , Japan)
　　P18 S 3 :5 -CGT ,AAC ,AAG ,GTT , TCC ,GTA ,
GGT ,GAA ,G-3
P26 S 5 :5 -TTA ,TTG ,ATA ,TGC , TTA ,AAC ,
TCA ,GCG ,GG-3
以上引物所扩增的片段理论上为 3 -18S-ITS
-5 -26S(包括 5.8S编码区)。
PCR反应体系为:
10×PCR buffer 3μl;dNTP 2.5μl;MgCl2(25mmol/
L)1.8μl;Primer 1(10pmol/μl)1μl;primer 2(10pmol/μl)
1μl;Taq DNA polymerase(5U/μl)2μl;Template 约 70 ～
80ng;ddH2O加至终体积30μl。
PCR循环条件为:(1)94℃预变性 4min;(2)94℃
变性 40sec;(3)54℃退火 50sec;(4)72℃延伸 2min;
(5)重复(2)～ (4)步骤共 31个循环;(6)循环完成
后 ,72℃保温 5min ,反应结束;产物置 4℃保存 。扩
增反应在Mastercycler gradient (Eppendorf ,德国)上进
行。扩增结果见图 2(Fig.2)
Fig 2.Agarose gel electrophoresis analysis of PCR
products of ITS regions from total DNA from all samples
Lane 1.Sample from dried plant of Polygonum tinctori-
um;Lane 2.Sample from dried plant of P.hydropiper;
Lane 2 .Sample from fresh plant of P .hydropiper;Lane
M2.1kb 1adder (GBICO , USA);Lane M1.λ-Hind di-
gest (TaKaRa , Japan)
1.5　PCR产物的纯化
经 PCR法获得的目的基因的PCR产物 ,用Wiz-
zard
TM
PCR Preps DNA Purification System (Promega , 美
国)进行纯化后 ,用于碱基序列测定。
1.6　测序反应
将纯化后的 PCR产物作为测序反应的模板 ,所
用引物仍为 P18 S 3 (引物 1)和 P26 S 5 (引物 2)。
测序反应体系:
Mix(试剂盒)1μl;Buffer(试剂盒)1.5μl;DNA
(PCK产物)0.8μl(约15 ～ 45ng);Primer 1或 2 1.6μl;
ddH2O加至终体积 10 μl。
测序反应条件为:①95℃预变性 2min , ②96℃变
性 10sec , ③50℃复性5sec , ④60℃延伸 4min , ⑤重复
②～ ④步骤共35个循环 ,循环完成后 ,反应结束 ,置
4℃下保存 。
1.7　测序反应产物的纯化
①取出反应管 ,分别加入 95%乙醇 25μ1和 3M
醋酸钠 1μ1 , 混匀后 4℃μ冰箱中放置 10min;②
14000rpm下离心 20min ,取出样品管 ,小心吸取上清
液并弃之;③向反应管中再加入 70%乙醇 130μ1 ,混
匀后放置 5min , ④14000rpm下离心 10min ,取出样品
管 ,小心吸取上清液并弃之;⑤打开离心管盖 ,在
60℃恒温箱中烘 15min。
1.8　进样测序
①每个样品加 12μ1 TSR(Template Suppression
Reagent)液溶解沉淀物 ,混匀;②在 Mastercycler gra-
dient上 95℃变性 2min ,立即置于冰水中;③将样品
全部移入全自动测序专用管中 ,盖上 Septa离心。其
他 操 作 均 按 ABI PRISMTM 310Genetic Analyzer
(PERKIN ELMER公司 ,美国)的使用手册要求进行;
毛细管电泳之后 ,序列资料直接从该测定仪上得到。
2　结果与讨论
2.1　蓼属 nrDNA ITS区序列的价值
蓼蓝 、水蓼的核糖体 DNA 内转录间隔区 ITS 1
和 ITS 2与 3个编码区 18S 、5.8S 、26 S的界限的根据
登录在GenBank中的有关蓼科植物的 nrDNA 序列
(ACCESSION NO.:U51276;U51275;U51274;U51273)
确定的 ,对其 ITS 区序列进行分析比较后显示 , ITS
区分化较活跃 ,该片段对蓼属种间有很好的分辨率;
而 5.8S 编码区高度保守 ,其长度完全一致 , 均为
164bp ,且无变异位点 。因此 ,蓼属植物nrDNA ITS区
44　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中国野生植物资源　　　　　　　　　　　　　　　第 20卷第 3 期
序列资料在该属中药鉴定中特别是和近缘种区别中
具有较高的应用价值 。
2.2　分子标记的确定
进一步对蓼蓝和水蓼的序列分析显示 ,两者的
序列总长度(含 5.8S)相等 ,均为 646bp(表 2)。对位
排列比较后发现序列间有 28个变异位点 ,其中 ITS1
区有13个 ,5.8S区无变异位点。 ITS2区有 15个 ,但
无插入片段和位点缺失。各变异位点 、序列长度及
G+C含量等见表 2和图 3。
上述这些特征为蓼蓝和水蓼分子鉴定标记的确
定直接提供了依据。由此可见 ,核糖体 DNA ITS 区
序列资料用于蓼属传统中药的分子鉴定是可行的。
表 2　蓼蓝和木蓼 ITS 区(含 5.8S)序列长度及其 G+C 含量
种类 序列总长度(bp) ITS 1 长度(bp) 5.8 S 长度(bp) ITS 2长度(bp) G+C 含量(%)
P.tinctorium
P .hydropiper
646
646
241
241
164
164
241
241
61.3
61.9
　　CLUSTAL X(1.8)multiple sequence alignment
　　　　　18S　　　　　　　　　　　　　　　　ITS 1》
P.tinctorium　--------AACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCACAAGCAGAAAGACC
P.hydropiper　GGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAAACCTGCACAAGCAGAAAGACC
P.tinctorium　CGTGAACTCGTTTACAAACATCGGGCGGACGTCGTTCGGCCACAAACCGACGACGTCCCC
P.hydropiper　CGTGAACTCGTTTACAAACACCGGGGGGATGGCGTTTGGCCACAAACCAACGACGTCCCC
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊　＊　＊　＊　＊　　　　　＊
P.tinctorium　CGAGCTCGGCAGGATCCCGGCTCCTAGTGGGTCGGTCTCCTCCGAGCACGAACAAACCCC
P.hydropiper　CGAGCTCGGCAGGAGGCCGGCTCCTAGCGAGTCGGTCTCCTCCCAGCACGAACAAACCCC
　　　　　　　　　　　　　　＊＊　　　　　＊　＊　　　 　　 　　　　＊
P.tinctorium　GGCGCGGATTGCGCCAAGGACCATGAACAATAGCGCGTCCCACGCCCCTCGGTTGCCCGA
P.hydropiper　GGCGCGGATTGCGCCAAGGACCATGAACAATAGCGCGTCCCACGCCCCTCGGTTGCCCGA
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.8S
P.tinctorium　AGTGAGCGTGGGTCGTCGTGTCGTTTCGATACATTAGAACGACTCTCGGCAACGGATATC
P.hydropiper　AGTGCGCGTGGGCCGTCGTGTCGTTTCGATACATTAGAACGACTCTCGGCAACGGATATC
　　　　　　　　＊　　　　＊
P.tinctorium　TCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAAT
P.tinctorium　TCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAAT
P.tinctorium　CCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCGGGCCAAGGGCAC
P.hydropiper　CCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCGGGCCAAGGGCAC
　　　　　　　　　　　　　　　　　ITS2〉〉
P.tinctorium　GTCTGCCTGGGCGTCACGCACCGCGTCGCCCCCCACCCAAACCATTGGGATGGGGGGCGG
P.hydropiper　GTCTGCCTGGGCGTCACGCACCGCGTCGCCCCCACCCCAAACCATTGGGATGGGGGGCGG
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＊＊
P.tinctorium　ACTGTGGCCCCCCGTGCGCTCATCGCTCGCGGTCGGCCTAAACACAGACCCCGTGGCCGC
P.hydropiper　ATTGTGGCCCCCCGTGCGCTCCTCGCTCGCGGTCGGCCTAAACACAGACCCCGTGGCCGC
　　　　　　　＊　　　　　 　　　　　＊
45中药蓼大青叶及其伪品的 nrDNA ITS 区序列的测定
P.tinctorium　AAAACGCCGCGACGTTTGGTGGTTTACTCGTGGCCCTGTGCCTCGAGCATCGCGTCGTGG
P.hydropiper　GAAACGCTGCGACGTTTGGTGGTTTACTCGTGGCCTTGTGCCTCGAGCATCGCGTCGTGG
　　　　　　＊　　　＊　　　　　　　　　　　　　　　＊
P.tinctorium　CCTTGGCGGCCCATGGGAGCTCAAAGGACCCTGAGGAGGACCGTGTCACCCTTGAATGGC
P.hydropiper　CCCTGGTGGACCATGGGAGCTCAAAGGACCCTGAGGAGGACCGTGTCACCCTCGAGTGGC
　　　　 　　　＊　＊　＊　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＊ ＊
　　　　　　　　　　　　　　　　　　26S
P.tinctorium　CTGGGAACTTCTTAACCGTTGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGC
P.hydropiper　GTGGGAACCTCCTAACCGTTGCGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGC
　 　　　　　 ＊　　＊　＊
P.tinctorium　AT---------
P.hydropiper　ATATCAATAAGCGGAGG
黑体部分为 18S 3 端 , 26S 5 端的部分序列及 5.8S 全部序列;＊指示变异位点
图 3　蓼蓝和水蓼的 ITS 区序列
Fig.3 Aligned ITS sequences of Polygonum tinctorium Ait.and P.hydropiper L.from China
　　致谢:感谢中国药科大学中药制剂教研室赵浩
如先生 、南师大遗传资源研究室周开亚教授 、王义权
教授 、杨光老师和刘忠权 、沈曦 、周才权 、张保卫 、童
宗中等博士的指导与帮助 !
参 考 文 献
[ 1] 　王本祥 主编.现代中药药理学.天津:天津科学技术出版社 ,
1997:217
[ 2] 　国家药典委员会编.中华人民共和国药典 2000年版一部.北
京:化学工业出版社 ,2000:298
[ 3] 　四川省中药研究所 ,等.靛玉红.中草药通讯(专辑)1979, 17
[ 4] 　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第二十五卷第
一分册.北京:科学出版社, 1998:27
[ 5] 　Takaiwa F , Oono K , Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S～ 25S
spacer reion from rice rDNA.Plant Mol Biol , 1985 , 4:355
新一代旱地龙简介
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