全 文 ：·６３２　· 中国中西医结合杂志２０１３年５月第３３卷第５期ＣＪＩＴＷＭ，Ｍａｙ　２０１３，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５
基金项目：２０１０年度甘肃省教育厅科研项目（Ｎｏ．１００６Ｂ－０６）
作者单位：１．甘肃中医学院基础课部病原生物学与免疫学教研室（兰州 ７３００００）；２．西北民族大学医学院病原生物学与免疫学教研室（兰州
７３００３０）
通讯作者：聂　蕾，Ｔｅｌ：１３６６９３４０２７７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｕｄｉｎａ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
当归红芪超滤膜提取物诱导小鼠骨髓间充质
干细胞分化为神经样细胞的实验研究
聂　蕾１　殷祎隆２　刘永琦１　樊　秦 １　苏　韫１
摘要　目的　观察并评价当归红芪超滤膜提取物（简称中药合剂）诱导小鼠骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒ－
ｒｏｗ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｒｏｍａ　ｃｅｌｓ，ＢＭＳＣｓ）分化为神经样细胞的效果。方法　体外培养小鼠ＢＭＳＣｓ后加入药物并分为
５组：空白组、６ｇ／Ｌ中药合剂组（简称低剂量组）、１２ｇ／Ｌ中药合剂组（简称高剂量组）及３ｇ／Ｌ中药合剂联合
０．５ｍｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇用药组（简称联合组）、β－巯基乙醇阳性对照组（简称对照组）。通过甲苯胺蓝染色观察
各组诱导分化为神经样细胞的效果，应用免疫组织化学及免疫荧光技术检测分化后细胞所表达的神经元特异
性烯醇化酶（ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）、巢蛋白（ｎｅｓｔｉｎ）、神经丝蛋白（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＮＦＰ）、微管结合
蛋白２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ＭＡＰ２）及神经胶质原纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ，
ＧＦＡＰ）５种神经特异性蛋白的差异，并应用流式细胞分析技术（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）检测各组细胞生长周期
的变化。结果　诱导后细胞形态发生神经样细胞改变，两个中药合剂组的形态特征性均弱于联合组和对照组；
除空白组外，上述５种蛋白在各组的表达为阳性，表达程度均为对照组最高（Ｐ＜０．０５），联合组次之（Ｐ＜０．０５）；
经流式细胞术检测细胞增殖率比较：对照组最低（Ｐ＜０．０５），高、低剂量组较高（Ｐ＜０．０５），联合组次之（Ｐ＜
０．０５）。结论　中药合剂可较为有效地诱导小鼠ＢＭＳＣｓ分化为神经样细胞，诱导能力虽弱于对照组，但对于分
化后细胞的增殖作用明显。联合组可有效诱导ＢＭＳＣｓ分化为神经样细胞并使细胞有较高的增殖能力，可能是
用于临床研究目前较为理想的用药途径。
关键词　当归红芪超滤膜提取物；骨髓间充质干细胞；分化；神经样细胞
Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　ｆｒｏｍＡｎｇｅｌｉｃａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＳＣｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ：ａｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　 ＮＩＥ　Ｌｅｉ　１，ＹＩＮ　Ｙｉ－ｌｏｎｇ２，ＬＩＵ　Ｙｏｎｇ－ｑｉ　１，ＦＡＮ　Ｑｉｎ１，ａｎｄ　ＳＵ
Ｙｕｎ１　１　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｉｃ　Ｆａｃｕｌｔｙ，Ｇａｎｓｕ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｌａｎｚｈｏｕ（７３００００），Ｃｈｉｎａ；２　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ
Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｌａｎｚｈｏｕ（７３００３０），Ｃｈｉｎａ．
ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ａｎｄ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｄｅｒｉｖｅｄ
ｓｔｒｏｍａ　ｃｅｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ｉｎｔｏ　ｎｅｒｖｅ　ｃｅｌｓ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｆｒｏｍ　Ａｎｇｅｌｉｃａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ
Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ＢＭＳＣｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔ
ｍｉｘｔｕｒｅ　ｆｒｏｍＡｎｇｅｌｉｃａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　５　ｇｒｏｕｐｓ，ｉ．ｅ．，ｔｈｅ　ｂｌａｎｋ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ
ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ（６　ｇ／Ｌ　ｍｉｘｔｕｒｅ），ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ（１　２　ｇ／Ｌ　ｍｉｘｔｕｒｅ），ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（３　ｇ／Ｌ　ｍｉｘｔｕｒｅ
＋０．５　ｍｍｏｌ／Ｌβ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｒｖｅ　ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　ｂｌｕｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｏｆ　５　ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉ．ｅ．ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ），ｎｅｓｔｉｎ，ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＦＰ），ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ　２（ＭＡＰ２），ａｎｄ　ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
（ＦＣＭ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ＢＭＳＣｓ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｙ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ｗｅｒｅ　ｗｅａｋｅｒ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ．Ｅｘｃｅｐｔ　ｔｈｅ　ｂｌａｎｋ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ
中国中西医结合杂志２０１３年５月第３３卷第５期ＣＪＩＴＷＭ，Ｍａｙ　２０１３，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５ ·６３３　·
ａｆｏｒｅｓａｉｄ　５　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｉｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎ－
ｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０　５），ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０　５）．Ａｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｄｅｔｅｃ－
ｔｅｄ　ｂｙ　ＦＣＭ，ｉｔ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ，ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｄ
ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ（ａｌ　Ｐ＜０．０　５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｆｒｏｍ
Ａｎｇｅｌｉｃａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＢＭＳＣｓ　ｉｎｔｏ　ｎｅｒｖｅ
ｃｅｌｓ．Ｉｔｓ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｗｅａｋｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｂｕｔ　ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｍａｒｋｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｃｅｌｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ａ　ｍｏｒｅ　ｉｄｅａｌ　ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ
ＢＭＳＣｓ′ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　ｎｅｒｖｅ　ｃｅｌｓ，ｗｈｉｃｈ　ｍｉｇｈｔ　ｈａｖｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ．
ＫＥＹＷ　ＯＲＤＳ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｆｒｏｍＡｎｇｅｌｉｃａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｂｏｔｒｙｓ；
ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａ　ｃｅｌ；ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｎｅｒｖｅ　ｃｅｌ
　　诱导后小鼠骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｄｅ－
ｒｉｖｅｄ　ｓｔｒｏｍａ　ｃｅｌｓ，ＢＭＳＣｓ）向神经样细胞的转化研
究，对于解决临床神经修复抑或是中枢神经系统的重
建问题具有极为重大的意义［１］。大量的实验已经证
明，多种诱导剂，如维甲酸、二甲基亚砜、β－巯基乙醇及
甘油［２，３］等的效能在基础研究领域是值得肯定的，但
是这一类化学制剂大都有极为明显的细胞毒性，并不
适合使用于临床［２，３］。因此寻找高效而又安全的诱导
剂才是此类研究的当前重点所在。
中草药提取技术的发展，使得其研究前景很为乐
观。采用超滤膜分离技术精制其水提液即当归红芪超
滤膜提取物对小鼠ＢＭＳＣｓ进行体外诱导实验，以期
对益气活血中药、甘肃道地药材———当归红芪合剂的
治疗效用进一步拓展，为临床治疗提供良好的实验
依据。
材料与方法
１　细胞株　小鼠骨髓间充质干细胞细胞株－Ｄ１
细胞（ＢＭＳＣ－Ｄ１），序列号：ＣＲＬ－１０９１５，美国ＡＴＣＣ公
司，解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所惠赠。
２　药物　中药材当归、红芪生药由甘肃中医学院
附属医院药房提供。按照文献［４］所提供的方法以生
药煎煮→粗滤→浓缩→微滤（应用陶瓷膜）→超滤（应
用聚丙烯腈中空纤维超滤膜，截留分子量为１０万的超
滤物）→浓缩后喷干，每克生药［（当归、红芪质量比１∶
５）合当归红芪超滤膜提取物（简称中药合剂）干燥粉
０．１４１ｇ，主要含有阿魏酸、芒柄花素等药用有效成
分］；β－巯基乙醇，购自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（上海）Ｔｒａｄｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｌｔｄ，产品编号：Ｍ７５２２。
３　试剂及仪器　培养基Ｄ／Ｆ１２、胰蛋白酶为美国
ＧＩＢＣＯ公司产品；胎牛血清购自兰州民海生物工程有
限公司；碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）为Ｓｉｇｍａ产品；
甲苯胺蓝为上海试剂三厂生产；兔抗小鼠神经元特异性
烯醇化酶（ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）、巢蛋白
（ｎｅｓｔｉｎ）、神 经 丝 蛋 白 （ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ，
ＮＦＰ）、微 管 结 合 蛋 白 ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ＭＡＰ２）及神经胶质原纤维酸性蛋白
（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）抗体、ＳＡＢＣ
免疫组织化学试剂盒、ＤＡＢ显色试剂盒、ＦＩＴＣ标
记的山羊抗兔ＩｇＧ试剂均购自武汉博士德生物工
程有限公司。纯净水系统，美国 Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司，型
号 Ｍｉｎｉ２ＱＢｉｏｃｅｌ；二氧化碳培养箱，德国 Ｈｅｒａｅｕｓ
公司，型号 ＢＢ１６ＵＶ；超净工作台，苏净集团苏州
安泰空气技术有限责任公司，型号 ＶＳ２１３００Ｌ；倒
置相 差 光 学 显 微 镜，日 本Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司，型 号
ＩＸ７１；数码荧光显微镜，日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，型号
ＣＸ４１；流式细胞仪，美国Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ公司，型号
ＣＯＵＬＴＥＲ　ＥＰＩＣＳ　ＸＬ－１００。
４　方法
４．１　小鼠ＢＭＳＣ－Ｄ１细胞株的培养　常规培养
于含１０％灭活胎牛血清，青、链霉素各１００Ｕ／ｍＬ的
Ｄ／Ｆ１２培养液中，置３７℃、５％ＣＯ２ 孵箱内贴壁培养，
每周更换２次培养液。细胞达８０％融合时，用０．２５％
胰酶消化传代［５］。
４．２　诱导小鼠ＢＭＳＣ－Ｄ１细胞株向神经样细胞分化
及分组方法　培养细胞以２．５×１０５／ｍＬ接种到６孔培养板
中，弃培养液，加入１ｍＬ预诱导液：终浓度分别为６、１２ｇ／Ｌ
的中药合剂（在预实验中选用１．５、３、６、１２、２４ｇ／Ｌ　５个浓度
的当归红芪膜超滤物诱导液，经过比较分析：３～１２ｇ／Ｌ当
归红芪膜超滤物均有诱导分化能力，浓度为１２ｇ／Ｌ当归红
芪膜超滤物诱导液在ＢＭＳＣｓ的神经诱导分化过程中效果
最好，因此中药合剂组最终选用６、１２ｇ／Ｌ），体积分数为
１５％胎牛血清的Ｄ／Ｆ１２完全培养液，空白组不加入药物，每
组另设２个副孔，置３７℃、５％ＣＯ２孵箱内继续培养。
·６３４　· 中国中西医结合杂志２０１３年５月第３３卷第５期ＣＪＩＴＷＭ，Ｍａｙ　２０１３，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５
２４ｈ后更换诱导液：终浓度分别为６、１２ｇ／Ｌ的中药
合剂，无血清Ｄ／Ｆ１２培养液，空白组不加入药物，于上述
ＣＯ２孵箱内诱导５ｈ。依据以上不同处理，可将培养细胞
分为：空白组、６ｇ／Ｌ中药合剂组（简称低剂量组）、１２ｇ／Ｌ
中药合剂组（简称高剂量组）。同理，设立３ｇ／Ｌ中药合剂
联合０．５ｍｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇用药组（简称联合组），１
ｍｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇阳性对照组（简称对照组）。
４．３　观察项目及检测方法
４．３．１　细胞形态学观察　取诱导５ｈ的细胞爬
片，用１％甲苯胺蓝水溶液室温下染３ｍｉｎ，自来水清
洗，倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变及神经元
细胞质的特征性结构尼氏小体的形成并拍照。
４．３．２　神经细胞标志物ＮＳＥ及ｎｅｓｔｉｎ的免疫组
织化学鉴定　取出预先放置于６孔培养板中爬满细胞
的盖玻片，用４％多聚甲醛固定，行免疫细胞化学染
色。一抗分别为ＮＳＥ抗体和ｎｅｓｔｉｎ抗体。每组均用
０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ代替作为阴性对照。参照试剂说明
书０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ冲洗后，０．５％ｔｒｉｔｉｏｎ－１００穿透，
３％ Ｈ２Ｏ２孵育以完全消除内源性过氧化物酶。滴加
封闭血清室温孵育１５ｍｉｎ，去除封闭血清后滴加一抗
置于４℃过夜孵育，再与二抗孵育０．５ｈ，ＤＡＢ显色、
脱水、透明、封片，光镜下观察，以细胞浆出现棕黄色
颗粒为阳性，未着色为阴性。
４．３．３　神经细胞标志物 ＮＦＰ、ＭＡＰ２及 ＧＦＡＰ
的免疫荧光技术检测　取出预先放置于６孔培养板中
爬满细胞的盖玻片，用４％多聚甲醛固定，行免疫细胞
化学染色。一抗分别为 ＮＦＰ抗体、ＭＡＰ２抗体及
ＧＦＡＰ抗体。每组均用０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ代替作为阴
性对照。参照试剂说明书０．０１ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ冲洗后，
０．５％ｔｒｉｔｉｏｎ－１００穿透，３％ Ｈ２Ｏ２孵育以完全消除内
源性过氧化物酶，滴加封闭血清室温孵育１５ｍｉｎ，去除
封闭血清后滴加一抗置于４℃过夜孵育，再与ＦＩＴＣ
标记的山羊抗兔ＩｇＧ（二抗）避光孵育４５ｍｉｎ，ＰＢＳ洗
涤后，荧光显微镜下观察并拍照，阳性细胞发出绿色荧
光。进行免疫组化及免疫荧光检测的细胞爬片，在高
倍镜视野下每张片连续选取１０个不重叠视野计数神
经元样阳性细胞，每组共计３张，并计算诱导后神经样
细胞平均分化率，公式为：（神经样阳性细胞数／视野内
全部细胞数）×１００％。
４．３．４　细胞周期检测　收集各组诱导后细胞，
ＰＢＳ洗涤，７５％冷乙醇固定，ＰＩ避光染色３０ｍｉｎ上
机，每组取５个样本，以流式细胞仪测定细胞周期
分布。
４．４　统计学方法　采用ＳＰＳＳ　１０．５统计学软件
进行统计分析，参数用ｘ±ｓ表示，采用多个独立样本
秩和检验，两两比较采用Ｎｅｍｅｎｙｉ法。细胞周期分
布采用单因素方差分析，两两比较采用 ＬＳＤ 法，
Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结　　果
１　小鼠ＢＭＳＣ－Ｄ１细胞株形态学观察（图１）　细
胞呈扁平梭形，少数有短小突起。
图１　未染色小鼠ＢＭＳＣ－Ｄ１细胞株　（×４００）
２　经诱导后细胞形态学观察（图２）　空白组细
胞突触不明显，尼氏小体未见；低剂量组细胞突触明
显，尼氏小体不清晰；高剂量组部分细胞胞体收缩形成
双极状或三角形，可见少量尼氏小体；联合组细胞多极
突触形成，胞体收缩明显，部分细胞突触端存在多个棒
状突起，尼氏小体不清晰；对照组细胞突触形成网格状，
图２　经诱导后各组细胞形态学观察
（甲苯胺蓝染色，×４００）
中国中西医结合杂志２０１３年５月第３３卷第５期ＣＪＩＴＷＭ，Ｍａｙ　２０１３，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５ ·６３５　·
多极突触形成，部分胞体突触端存在多个棒状突起，可
见尼氏小体，另外，细胞发生裂解，故有明显细小的碎
片形成。
３　经诱导后各组 ＮＳＥ、ｎｅｓｔｉｎ、ＮＦＰ、ＭＡＰ２及
ＧＦＡＰ免疫组化及免疫荧光检测结果（图３～７）　免
疫组化及免疫荧光显示：空白组５个指标均无明显阳
性变化；免疫组化 ＮＳＥ及ｎｅｓｔｉｎ显示：低剂量组、高
剂量组、联合组及对照组诱导细胞胞体内均有明显的
棕黄色颗粒出现（即阳性表达）。其中对照组较其他各
组阳性变化更为明显，联合组与对照组阳性细胞数量
较其他两组明显增加。免疫荧光 ＮＦＰ、ＭＡＰ２及
ＧＦＡＰ显示经诱导后各组均有阳性绿色荧光表达。其
中 ＮＦＰ的表达在上述各组呈依次增强趋势；ＭＡＰ２
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联合组与对照组阳性细胞数量较其他两组明显增加；
ＧＦＡＰ各组表达均较弱，对照组强于其他各组。
图７　各组ＧＦＡＰ免疫荧光结果　（ＦＩＴＣ标记，×１００）
４　经诱导后各组细胞平均分化率的比较（表１）
与空白组比较，各用药组的 ＮＳＥ、ｎｅｓｔｉｎ、ＮＦＰ、ＭＡＰ２
及ＧＦＡＰ神经特异性蛋白的表达均有统计学意义（Ｐ
＜０．０５），表明当归红芪超滤膜提取物和β－巯基乙醇均
能诱导ＢＭＳＣｓ分化为神经样细胞，以β－巯基乙醇诱导
效果更为明显，联合组次之；与低剂量组比较，高剂量
组仅ＮＦＰ有统计学意义（Ｐ＜０．０５），即高剂量当归红
芪超滤膜提取物比低剂量诱导ＢＭＳＣｓ分化为神经纤
维的能力略强，而联合组、对照组的５种神经特异性蛋
白的表达与低剂量组比较，差异均有统计学意义（Ｐ＜
０．０５）；与高剂量组比较，除 ＮＦＰ外，联合组 ＮＳＥ、
ｎｅｓｔｉｎ、ＭＡＰ２及 ＧＦＡＰ神经特异性蛋白的表达均有
统计学意义（Ｐ＜０．０５），表明联合组诱导ＢＭＳＣｓ
分化为神经元或神经内分泌细胞、神经上皮干细胞、表
达特异性神经细胞微管、分化为星形胶质细胞的潜能
强于高剂量组，对照组５种神经特异性蛋白的表达均
有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与联合组比较，对照组除
ＧＦＡＰ外，其余４种神经特异性蛋白的表达均有统计
学意义（Ｐ＜０．０５），表明对照组诱导ＢＭＳＣｓ分化为神
经元或神经内分泌细胞、神经上皮干细胞、神经纤维以
及表达特异性神经细胞微管的潜能比联合组要强，但
分化成星形胶质细胞的能力差异无统计学意义（Ｐ＞
０．０５）。
５　经诱导后各组细胞周期分布比较（表２）　与
空白组比较，各用药组在Ｇ０／Ｇ１ 期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ 期的
分布均有统计学意义（Ｐ＜０．０５），Ｇ０／Ｇ１ 期延长，表明
细胞因药物影响，大部分时间细胞活动停滞，Ｓ期变
短，说明细胞的ＤＮＡ复制能力变弱，细胞分裂能力降
低，Ｇ２／Ｍ期延长，说明药物一定程度上使得细胞分裂
发生相对阻滞，影响了ＤＮＡ复制后的细胞有丝分裂
过程；与低剂量组比较，高剂量组细胞周期分布无统计
学意义（Ｐ＞０．０５），说明６、１２ｇ／Ｌ当归红芪超滤膜提
取物对细胞周期影响无明显差异；与低、高剂量组比
较，联合组、对照组在Ｇ０／Ｇ１ 期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ 期的分布
均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；与联合组比较，对照组在
Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期分布有统计学意义（Ｐ＜０．０５），说明对
照组细胞因药物影响，细胞的ＤＮＡ复制能力很弱，细
胞分裂能力低，大部分时间细胞分裂阻滞，或是休眠或
是凋亡（图２－Ｅ中有细胞碎片的形成）。
表２　５组细胞周期分布比较　（％，ｘ±ｓ）
组别 ｎ　 Ｇ０／Ｇ１期 Ｓ期 Ｇ２／Ｍ期
空白 ５　 ３３．８３±１．０３　 ５８．８６±１．１５　 ７．２６±０．３６
低剂量 ５　 ４４．０７±１．２５＊ ４８．１４±１．５３＊ ７．７９±０．２６＊
高剂量 ５　 ４６．０８±１．２０＊ ４６．０２±１．３０＊ ７．９０±０．２２＊
联合 ５　 ５５．８２±２．３５＊△▲ ３６．８６±１．１７＊△▲ ８．５２±０．２６＊△▲
对照 ５　 ５５．７２±１．１８＊△▲ ２７．３０±１．０４＊△▲ ○ １６．９８±０．４９＊△▲ ○
　　注：与空白组比较，＊Ｐ＜０．０５；与低剂量组比较，△Ｐ＜０．０５；与高剂量组比
较，▲Ｐ＜０．０５；与联合组比较，○Ｐ＜０．０５
表１　５组相关神经特异性蛋白的组间表达比较　（％，ｘ±ｓ）
组别 ｎ　 ＮＳＥ　 ｎｅｓｔｉｎ　 ＮＦＰ　 ＭＡＰ２ ＧＦＡＰ
空白 ３０　 １．１３±１．３２　 ２．６６±１．５８ — — —
低剂量 ３０　 １４．００±７．５９＊ １３．３０±７．１９＊ ６．３４±２．０９＊ ４．７２±１．６７＊ １．６９±０．０６＊
高剂量 ３０　 １１．１７±６．２３＊ １０．３３±５．７７＊ １６．１２±５．６４＊△ ５．５３±２．４２＊ １．６２±０．３４＊
联合 ３０　 ２４．９２±５．８１＊△▲ ２４．０８±５．５３＊△▲ ２７．１２±６．６２＊△ １３．８２±３．４８＊△▲ ５．３６±０．８３＊△▲
对照 ３０　 ５４．９０±１１．７３＊△▲○ ５２．１８±１０．８３＊△▲○ ６０．０９±７．７２＊△▲○ ２６．６９±３．９１＊△▲○ ６．６７±１．５７＊△▲
　　注：与空白组比较，＊Ｐ＜０．０５；与低剂量组比较，△Ｐ＜０．０５；与高剂量组比较，▲Ｐ＜０．０５；与联合组比较，○Ｐ＜０．０５
中国中西医结合杂志２０１３年５月第３３卷第５期ＣＪＩＴＷＭ，Ｍａｙ　２０１３，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５ ·６３７　·
讨　　论
本实验选用中草药当归、红芪，取自当归补血汤，
是金元时代李东垣《内外伤辨惑论》中所创造的益气补
血的经典名方，由当归、黄芪按１∶５组成，临床应用广
泛，红芪作为黄芪的代用品，广泛用于临床。
ＢＭＳＣｓ可定向神经样细胞分化的研究对神经损
伤的修复价值是显而易见的。而本研究相关的体外实
验关键在于就下述问题进行探讨和说明：（１）如何判定
药物诱导后所分化的细胞的性质及诱导细胞分化率；
（２）分化细胞的活力及增殖能力。
实验选取小鼠ＢＭＳＣ－Ｄ１细胞株最终来源是美国
ＡＴＣＣ公司，这种细胞株在纯度及增殖能力等各个方
面上较原代培养细胞更好。神经样细胞的鉴定目前主
要是通过检测其特异性蛋白的表达来完成，本次试验
着 重 选 取 ＮＳＥ［６］，ｎｅｓｔｉｎ［７］，ＮＦＰ［８］，ＭＡＰ２［９］ 及
ＧＦＡＰ［１０］这５种神经样特异性相关蛋白，是从多种分
化层面探索诱导后细胞的分化结果，如：分化为神经元
或神经内分泌细胞、神经上皮干细胞、神经纤维以及表
达特异性神经细胞微管、星形胶质细胞的潜能等的强
弱。中药合剂可诱导小鼠ＢＭＳＣｓ不同程度的表达上
述５种神经特异性相关蛋白，即诱导后细胞可分化为
神经样细胞。从诱导效率来看，中药合剂组明显弱于
对照组，呈现一种低表达状态；从诱导性质来看，中药
合剂组 ＮＳＥ、ｎｅｓｔｉｎ及 ＮＦＰ的表达量要相对高于
ＭＡＰ２及ＧＦＡＰ，这说明诱导后细胞已具备少量分化
为神经元或神经内分泌细胞、神经上皮干细胞及神经
纤维的能力，但特异性神经细胞微管、星形胶质细胞的
表达效率很低。综上考虑，单纯使用中药合剂的诱导
效果有限。
从诱导后分化细胞的存活率以及增殖状况来看，
中药合剂组诱导后细胞的增殖能力强于β－巯基乙醇，
这就可以证明中药合剂具有良好的细胞维生性和促细
胞增殖能力。
故此，中药合剂与化学诱导剂的优缺点存在互补
性。从联合组实验数据来看：诱导细胞分化效果两倍
于甚至更高于中药合剂组，细胞增殖能力介于中药合
剂组和β－巯基乙醇组之间。那么是否能够利用此中和
诱导结果并服务于后续研究呢？这将受到细胞分化
率、分化程度以及分化性质等方面规范性与否的影响，
当前的国内外研究尚不足以产生此类标准定义，这也
是阻碍在体研究和临床试验的难点之一。另外，本次
试验联合用药的剂量摸索、时量效应等未充分进行也
对实验的完成度有明显的影响。从长远看，体外培养
分化细胞转入体内抑或在体细胞分化研究都需要可
靠、稳定的的诱导药物，现有的国内外研究尚不能达到
这种要求，大量的研究工作尚待开展与深入。
参 考 文 献
［１］　Ｂｒｏｈｌｉｎ　Ｍ，Ｍａｈａｙ　Ｄ，Ｎｏｖｉｋｏｖ　ＬＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｓ　ｆａｌｉｎｇ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－
ｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌ－ｌｉｋｅ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅｓ，２００９，
６４（１）：４１－４９．
［２］　Ｍａｈｙ　Ｄ，Ｔｅｒｅｎｇｈｉ　Ｇ，Ｓｈａｗｃｒｏｓｓ　ＳＧ．Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌ　ｍｅｄｉ－
ａｔｅｄ　ｔｒｏｐｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ
ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｃｅｌ　Ｒｅｓ，２００８，３１４（１４）：２６９２－２７０１．
［３］　Ｋｅｉｌｈｏｆｆ　Ｇ，Ｇｏｉｈｌ　Ａ，Ｌａｎｇｎａｓｅ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ－
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｓ　ｉｎｔｏ　Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌ－ｌｉｋｅ
ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ，２００６，８５（１）：１１－
２４．
［４］　关欣，李应东，刘 凯，等．当归黄芪超滤膜提取物预处理
对乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤保护作用的研究［Ｊ］．上
海中医药杂志，２００９，４３（４）：７０－７２．
［５］　裴晶晶，吴 润，赵红斌，等．Ｃａ２＋信号介导红景天苷促
进小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化［Ｊ］．
中国组织工程研究与临床康复，２００９，１４（１０）：１８０８
－１８１２．
［６］　Ｍａｒａｎｇｏｓ　ＰＪ，Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌ　Ｄ，Ｐａｒｍａ　ＡＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅａｓ－
ｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ
ｅｎｏｌａｓｅ　ｉｎ　ｒａｔ，ｍｏｎｋｅｙ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，３３（１）：３１９－３２９．
［７］　Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋ　Ｐ，Ｃｚｙｚ　Ｊ，Ｋａｎｉａ　Ｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
Ｐａｘ４　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｎｅｓｔｉｎ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｅｌｓ
［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，２００３，１００（３）：９９８
－１００３．
［８］　Ｎｉｘｏｎ　ＲＡ．Ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｙ－
ｎａｍｉｃｓ　ｂｙ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：ｃｌｕｅｓ　ｔｏ　ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌａｒｙ
ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ　Ｐａｔｈｏｌ，２００８，３（１）：２９
－３８．
［９］　Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ　Ｒ，Ｍａｔｕｓ　Ａ．Ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ
ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　２　ｉｎ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ：ａ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ａｎｄ
ａｘｏｎａｌ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ　Ｎｅｕｒｏｌ，２００７，２２６
（２）：２０３－２２１．
［１０］　Ｇａｒｃｉａ　ＡＤ，Ｄｏａｎ　ＮＢ，Ｉｍｕｒａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．ＧＦＡＰ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｎｅｕｒｏｇｅｎｅ－
ｓｉｓ　ｉｎ　ａｄｕｌｔ　ｍｏｕｓｅ　ｆｏｒｅｂｒａｉｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，７
（１１）：１２３３－１２４１．
（收稿：２０１２－０９－２４　修回：２０１３－０２－２８）