全 文 ： 韩丽荣 等/灰树花胞外多糖的结构及免疫调节活性
Chinese Journal of Biotechnology
http://journals.im.ac.cn/cjbcn May 25, 2016, 32(5): 648−656
DOI: 10.13345/j.cjb.150399 ©2016 Chin J Biotech, All rights reserved


Received: September 15, 2015; Accepted: November 30, 2015
Supported by: Key Technologies Research and Development Program of China (No. 2012BAD33B04), Key Projects of Tianjin Natural
Science Foundation (No. 13JCZDJC29800).
Corresponding author: Chunling Wang. Fax/Tel: +86-22-60912421; E-mail: wangchunling@tust.edu.cn
国家科技支撑计划 (No. 2012BAD33B04)，天津应用基础重点项目 (No. 13JCZDJC29800) 资助。
网络出版时间：2016-01-07 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160107.1443.001.html
648 生 物 工 程 学 报

灰树花胞外多糖的结构及免疫调节活性
韩丽荣，程代，王莉蕊，王春玲
天津科技大学 食品工程与生物技术学院，天津 300457
韩丽荣, 程代, 王莉蕊, 等. 灰树花胞外多糖的结构及免疫调节活性. 生物工程学报, 2016, 32(5): 648–656.
Han LR, Cheng D, Wang LR, et al. Structure and immunomodulatory activity of extracellular polysaccharide from Grifola
frondosa. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 648–656.
摘 要 : 对灰树花胞外多糖 A 组分 (EXGFP-A) 进行结构分析和免疫活性的研究。结构分析结果表明，
EXGFP-A 是一种主要含有葡萄糖的吡喃型中性多糖。气相结果说明 EXGFP-A 的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯
糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩尔比为 0.28∶0.31∶0.30∶0.06∶7.98∶0.61。MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-
2-yl)-2,5- diphenyltetrazo-lium bromide)比色实验表明，当 EXGFP-A浓度为 80 μg/mL，作用 48 h时，RAW264.7
细胞增殖指数达到最大值，为 137.5%。吖啶橙 (AO) 染色结果表明 EXGFP-A 能够激活 RAW264.7 细胞，增
强细胞内部核酸代谢水平。EXGFP-A 在一定浓度范围内，可以提高 RAW264.7 细胞中 NO 的释放量，上调细
胞内 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ细胞因子以及细胞中 iNOS的 mRNA水平的表达。结果表明，EXGFP-A
具有一定的免疫调节活性，为灰树花胞外多糖的结构分析和应用提供了科学依据。
关键词 : 灰树花多糖，结构分析，RAW264.7细胞，免疫活性


食品生物技术
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Structure and immunomodulatory activity of extracellular
polysaccharide from Grifola frondosa
Lirong Han, Dai Cheng, Lirui Wang, and Chunling Wang
College of Food Engineering and Biological Technology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China
Abstract: We aimed at analyzing the structure of extracellular polysaccharide A from Grifola frondosa (EXGFP-A) and
testing its immunomodulatory activity. Structural analysis shows that EXGFP-A was a contained α-D-glucoside bond and
pyranose ring. GC analysis reveals that EXGFP-A was mainly composed of rhamnose, arabinose, xylose, mannose, glucose,
galactose, by the molar ratio of 0.28:0.31:0.30:0.06:7.98:0.61. The results of MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay indicates when EXGFP-A was at a concentration of 80 μg/mL and treatment time
of 48 h, RAW264.7 cells proliferation index reached a maximum of 137.5%. Meanwhile, the AO staining showed that
EXGFP-A activated RAW264.7 cells and improved the level of intracellular nucleic acid metabolism. In addition, in a
certain range of concentration, EXGFP-A was able to increase the release of NO in RAW264.7 cells, and upregulate the
mRNA expression of immunological factor TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ and iNOS of RAW264.7 cells. Our results
confirm that EXGFP-A had immunomodulatory activity. Our findings provided scientific basis for the structural analysis
and application of Grifola frondosa polysaccharide.
Keywords: Grifola frondosa polysaccharide, structural analysis, RAW264.7 cells, immunomodulatory activity
灰树花 Grifola frondosa又名贝叶多孔菌、
栗蘑，俗称云蕈、日本称舞茸，属担子菌亚门
层菌纲非褶菌目多孔菌科树花菌属。灰树花是
一种药、食兼用的珍稀真菌，具有多种生理活
性[1]，如抗肿瘤[2-3]、调节血糖[4]、抗氧化[5]、抗
辐射[6]及免疫调节[7]等。近年来，灰树花的保健
功能及药用价值受到人们重视，并已证明灰树
花多糖是灰树花中主要的活性成分[8-9]，但对于
灰树花多糖单一组分的结构分析及免疫活性的
研究还相对较少。巨噬细胞作为一种重要的免疫
细胞广泛分布于机体中，参与机体的特异性和非
特异性免疫反应，可作为免疫活性的研究对象。
本文对分离纯化后的灰树花胞外多糖 A 组
分 (EXGFP-A) 进行了基本的结构分析以及免
疫活性研究，为灰树花胞外多糖的应用提供科
学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Grifola frondosa 菌种：天津科技大学菌种
保藏中心提供，编号 39025。
RAW264.7细胞株：购自中国科学院上海生
命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。
1.2 EXGFP-A 的结构分析
1.2.1 EXGFP-A的红外光谱分析
1 mg EXGFP-A样品以 KBr压片，室温条
件下进行红外扫描测定。
1.2.2 EXGFP-A的扫描电镜分析
取适量冻干的 EXGFP-A 粉末均匀轻薄地
平铺在样品台导电胶的表面，吹去浮样，置于
离子溅射仪中进行真空喷金处理，然后扫描电
镜观察[10]。
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1.2.3 EXGFP-A的单糖组成分析
采用糖醇乙酸酯衍生化方法对 EXGFP-A
的水解产物进行气相色谱测定，通过查阅相关
文献，选择鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、
葡萄糖、半乳糖 6 种单糖作为标准品单糖。气
相色谱条件：色谱柱：DB-17(30 m×0.32 mm×
0.5 m)；检测器：氢火焰离子化检测器 (FID)；
载气：N2，1 mL/min；进样口温度：280 ℃；柱
温：190 ℃；检测器温度：280 ℃。
1.3 EXGFP-A 对 RAW264.7 增殖活性的影响
本实验以小鼠巨噬细胞 RAW264.7 为研究
对象，研究 EXGFP-A 的免疫调节活性。采用
MTT法[11]：EXGFP-A作用 RAW264.7一定时间
后，使用酶标仪测定 570 nm波长处各孔的吸光
度。细胞增殖率=OD 加药/OD 对照×100%[12]。
1.4 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞中 DNA、
RNA 的影响
将无菌洁净的盖玻片置入 6 孔细胞培养板
中，每孔中加入浓度为 5×105 个 /mL 的
RAW264.7细胞悬液 1 mL，待细胞处于完全贴壁
状态后，加入终浓度分别为 0、40、80、160 μg/mL
的 EXGFP-A，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培
养 48 h。当 RAW264.7 细胞培养结束后，取出
细胞爬片，PBS缓冲液洗涤，Carony’s液 (乙醇：
冰醋酸：氯仿=6∶1∶3 (V/V/V)) 固定细胞 10 min，
以 1%醋酸进行酸化，加入 0.01% AO溶液进行
细胞染色，避光条件下室温放置 20 min，
0.1 mol/L 氯化钙溶液分色 30−60 s。PBS缓冲
液洗涤后，将细胞爬片置于洁净的载玻片上，
多功能荧光显微镜下观察并采图。
1.5 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞分泌 NO 的
影响
NO 的合成是巨噬细胞被激活的重要标志
之一。以 NO 标准品的浓度为横坐标，相应吸
光度值为纵坐标，完成标准曲线的绘制。然后
根据标准曲线来计算各组样品中 NO浓度[13]。
1.6 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞分泌细胞因
子及对细胞内 iNOS 表达的影响
1.6.1 RAW264.7细胞 RNA提取及反转录
按照北京全式金生物技术有限公司总 RNA
提取试剂 TransZol 说明书，无菌条件下进行细
胞总 RNA的提取。使用北京全式金公司反转录
试剂盒来进行 cDNA 的合成，步骤严格按照说
明书进行。体系完全混匀后，于 PCR仪上 42 ℃
孵育 30 min，85 ℃加热 5 min，然后反转录合成
cDNA，置于–20 ℃冻存。
1.6.2 聚合酶链反应 (PCR)
采用委托给上海生工生物工程公司合成的
相关系列引物，以反转录合成的 cDNA为模板，
进行聚合酶链式反应，并以 β-actin 为内参。相
关引物序列设计如表 1所示。
本实验中聚合酶链反应体系总体积为 50 μL，
加样体系：cDNA 2 μL、Forward Primer 1 μL、
Reverse Primer 1 μL、10×缓冲液 5 μL、2.5 mmol/L
dNTPs 4 μL、TransTaq HiFi DNA聚合酶 0.5 μL，
最后加入 ddH2O，使体系终体积为 50 μL。PCR
反应条件：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，
55−60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 120 s，30−35个
循环；72 ℃总延伸 10 min。
1.6.3 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶 (1%) 制备：称取 0.4 g琼脂糖
粉末，溶于 40 mL 1×TAE溶液，微波完全融化


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表 1 PCR 引物序列
Table 1 Primers sequence of PCR
Genes Forward Reverse Products (bp)
IFN-γ CACAA GGAGG AACGC TGACT CAGAG CAGGA TGGAA AGGCA 698
TNF-α AGGGG ATTAT GGCTC AGGGT CCCGT AGGGC GATTA CAGTC 626
IL-6 TGTAA CTGGC CTGCA GTAGC TATCT CACCG GCTGG AAGGA 462
IL-12 TCCTC AGGGA AGATG GAGGG GGTCA CAAGA CTACC CAGCC 365
IL-1β GTCGC TCAGG GTCAC AAGAA CAAAG CAATG TGCTG GTGCT 300
iNOS AGGTA AGGAT GGGCA GGGAT TCTCA GGGAT GGGAC TGAGG 500
β-actin GATCG ATGCC GGTGC TAAGA TCCTA TGGGA GAACG GCAGA 270

后，冷却至 50–60 ℃，加入 4 μL核酸染料，充
分摇匀。取 5 μL PCR扩增产物和 2 μL 6×DNA
上样缓冲液混匀后上样。另外，Marker 上样量
为 5 μL。电泳电压设定为 80 V，电泳结束后，
使用凝胶成像仪拍照分析。
2 结果与讨论
2.1 EXGFP-A 的结构分析
2.1.1 EXGFP-A的红外光谱分析
由图 1可知，在 3 600−3 200 cm–1出现一宽
峰是 O-H伸缩振动；2 934 cm–1为 C-H伸缩振
动；1 652 cm–1、1 400−1 200 cm–1是 C-H的变
角振动，以上这几处特征吸收峰证明该化合物
为糖类物质[14]。而在 1 700 cm–1–1 775 cm–1范
围内无明显吸收峰，表明样品中不含羧基，即
该多糖是一种中性糖。1 870–1 540 cm–1范围内
存在的特征吸收峰是属于由 C=O伸缩振动引起
的。1 069 cm–1处的吸收峰表明 EXGFP-A中存
在 3-6-内醚桥，即样品中含有 3-6-内醚-半乳
糖[15]，而 852 cm–1处形成的吸收峰表明组成的
单糖为 α-D-葡萄吡喃糖[16]，即 EXGFP-A 是属
于吡喃型多糖。此外，807 cm–1处的特征峰则说
明在多糖分子中存在甘露糖苷键[17]，619 cm–1
处的吸收峰表明多糖中含有葡萄糖残基。


图 1 EXGFP-A 红外光谱分析图谱
Fig. 1 IR spectroscopic analysis of EXGFP-A.


2.1.2 EXGFP-A的扫描电镜分析
如图 2所示，当粉末状态的 EXGFP-A平铺
在样品台上，经电镜扫描之后，显示出其形态
多为棒状、片层状，并且这些片层结构上附有
许多刺状不规则、大小不均一的碎屑。
2.1.3 EXGFP-A的单糖组成分析
六种标准单糖混合物的气相色谱图如 3A
所示，各标准单糖的分离效果很好。EXGFP-A
的气相色谱分析图如 3B 所示，对比 EXGFP-A
的出峰时间与混合标准单糖的时间，说明
EXGFP-A主要是由葡萄糖所组成，同时含有鼠
李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖以及少量的甘
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图 2 EXGFP-A 的扫描电镜分析 (×500 和×2 000)
Fig. 2 SEM analysis of EXGFP-A (magnification: 500 and 2 000).



图 3 气相色谱分析图
Fig. 3 Gas chromatography analysis. (A) Standard sugars. (B) EXGFP-A. 1: rhamnose; 2: arab sugar; 3: xylose; 4:
mannose; 5: glucose; 6: galactose; 7: inositol.

露糖。根据峰面积计算出这 6种单糖 (鼠李糖、
阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖) 的
摩尔比为 0.28∶0.31∶0.30∶0.06∶7.98∶0.61。
这与文献报道[18]的灰树花均一多糖主要含有葡
萄糖相吻合，而且本研究中的 EXGFP-A中葡萄
糖含量最高，和文献报道的研究结果也相一致。
2.2 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞增殖指数的
影响
由 MTT实验[19]检测 EXGFP-A作用浓度对
RAW264.7 细胞增殖指数的影响，结果如图 4A
所示， EXGFP-A 在一定的浓度范围内，
RAW264.7细胞的增殖活性与EXGFP-A的作用浓
度呈正相关。在 EXGFP-A作用浓度为 80 μg/mL
时，RAW264.7 细胞的增殖指数达到最大值
137.5%。如图 4B所示，当 EXGFP-A作用浓度
为 80 μg/mL时，通过不同培养时间 (0、12、24、
36、48、72 h) 作用于 RAW264.7细胞。结果表
明，在 EXGFP-A 作用 48 h 内，细胞的数量呈
现逐渐增加的趋势。当 EXGFP-A作用时间达到
48 h时，增殖效果达到最大。
以上结果说明， EXGFP-A 能够增强
RAW264.7 细胞的增殖活性。EXGFP-A 作用于
RAW264.7 细胞的最佳浓度为 80 μg/mL，最佳
作用时间为 48 h。
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图 4 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞增殖指数的影响
Fig. 4 Effects of EXGFP-A on proliferation index of
RAW264.7 cells. (A) Concentration. (B) Time. n=6,
x s , compared with the control group, *P<0.05,
**P<0. 01.

2.3 细胞形态学观察
吖啶橙 (AO) 是一种能和细胞中的核酸相
结合并产生特异性荧光的染料。当吖啶橙与细
胞核内的 DNA 和 RNA 结合，呈绿色荧光。如
图 5所示，加入 80 μg/mL的 EXGFP-A诱导细
胞 48 h之后，细胞处于激活状态，细胞体积变
大，细胞数目也增多，细胞核区的绿色荧光亮
度增强，说明 80 μg/mL的 EXGFP-A作用下，
RAW264.7细胞被激活，核酸代谢能力增强。
2.4 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞产生 NO 的
影响
巨噬细胞[20]是产生 NO 的重要的免疫细胞
之一，在免疫系统信号转导中，NO作为一个关
键介质，它的合成可作为巨噬细胞被激活的一
个重要标志。
如图 6 所示，处于正常状态的对照组细胞
产生 NO 浓度较低，而加入不同浓度的
EXGFP-A与 RAW264.7细胞共同培养 48 h后，
发现 EXGFP-A 均能够显著促进细胞分泌产生
NO。结果表明，EXGFP-A 能够诱导并且激活
RAW264.7细胞，促进 RAW264.7细胞分泌 NO，
通过增强 RAW264.7 细胞产生 NO 的能力，从
而发挥其免疫调节作用。



图 5 EXGFP-A 作用 RAW264.7 细胞的 AO 染色
(×400)
Fig. 5 AO staining of RAW264.7 treated with
EXGFP-A (×400).



图 6 EXGFP-A 作用浓度对 RAW264.7 细胞 NO 表
达量的影响
Fig. 6 Effects of EXGFP-A concentration on the
production of NO in RAW264.7 cells. n=6, x s ,
compared with the control group, *P<0.05, **P<0. 01.
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2.5 EXGFP-A 对 RAW264.7 细胞免疫因子
mRNA 表达水平的影响
由上述结果可知，EXGFP-A 可以促进
RAW264.7 细胞的增殖活性。本实验进一步从
基因水平检测了 EXGFP-A对 RAW264.7细胞中
细胞因子 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12以及 IFN-γ[21]
的影响，此外还检测了 EXGFP-A对 RAW264.7
细胞中 iNOS[22]在 mRNA水平上的影响。
RT-PCR结果如图 7所示，对照组的正常细
胞处于静息状态，TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、
IFN-γ 和 iNOS 的 mRNA 几乎不表达或表达量
极低。不同浓度的 EXGFP-A (20、40、80、
160 μg/mL) 与 RAW264.7细胞共培养 48 h后，
发现均能显著上调 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、
IFN-γ 和 iNOS 的产生，在一定的浓度范围内
(20–80 μg/mL)，随着 EXGFP-A浓度的增加，细
胞产生 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ和 iNOS
的 mRNA的表达量均相应增加，当 EXGFP-A作
用浓度达到 80 μg/mL时，表达量均达到最大值。
RT-PCR 结果表明：EXGFP-A 能够激活
RAW264.7细胞，促进 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ
和 IL-12 等细胞因子的分泌以及上调细胞中
iNOS的 mRNA表达水平，并且在一定浓度范围
内具有明显的浓度依赖性。证明 EXGFP-A可以
通过多途径激活 RAW264.7 细胞，增强机体的
免疫活性。
3 结论
灰树花作为近年来开发研究的珍贵真菌之
一，已有相关研究表明其在多种生物活性方面
均有显著功效。国内外对于灰树花的研究主要
集中在灰树花子实体多糖的功能学评价，而有
关灰树花多糖的结构和免疫活性的研究相对较
少。本文对灰树花多糖的单一组分进行结构分
析，并研究其免疫活性。





图 7 EXGFP-A 作用浓度对 RAW264.7 细胞中细胞
因子表达水平的影响
Fig. 7 Effects of EXGFP-A concentration on the
mRNA expression of cytokine in RAW264.7 cells. n=6,
x s , compared with the control group, *P<0.05,
**P<0.01.
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在本研究中，灰树花胞外多糖 EXGFP-A是
一种主要含有葡萄糖的吡喃型中性多糖，单糖
组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡
萄糖、半乳糖，摩尔比为 0.28: 0.31: 0.30: 0.06:
7.98: 0.61。EXGFP-A能够增强 RAW264.7的细
胞增殖和吞噬活性[23]，促进 TNF-α、IL-1β、IL-6、
IFN-γ 和 IL-12 等细胞因子的分泌以及上调细胞
中 iNOS 的 mRNA 表达水平，并且在一定浓度
范围内具有明显的浓度依赖关系。以上结果说
明 EXGFP-A可以通过多途径激活 RAW264.7细
胞，增强机体的免疫活性。
多糖的糖组成和糖苷键类型对生物活性有
一定的影响[24]，EXGFP-A主要由 α-D-葡萄吡喃
糖组成，这可能与其免疫活性有着密切的关系。
本文的研究结果证实了灰树花多糖 EXGFP-A
是一种以葡萄糖为主的吡喃型中性多糖，并具
有一定的体外免疫活性，为多糖的结构与活性
的研究提供了理论依据。
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(本文责编 陈宏宇)