全 文 ：　 2007年 11月第 26卷　第 11期
绵阳师范学院学报
JournalofMianyangNormalUniversity
Nov., 2007
Vol.26　No.11　
收稿日期:2007-09-21
基金项目:国家自然科学基金项目(30670209);四川省科技厅应用基础项目(05JY029-107);四川省林业厅科技先导计划重点项目(06-
3-5)
作者简介:蒋炜(1982-　),男 ,硕士研究生 ,主要研究方向:组织培养。
＊通讯作者:E-mail:zxsu@mnu.edu.cn
光叶海桐愈伤组织诱导及增殖研究
蒋炜 1 ,苏智先 1, 2, ＊ ,陈光登1
(1.西华师范大学生物多样性研究中心 , 四川省环境科学与生物多样性保护重点实验室 , 四川南充　637002;
2.四川省生态学与环境保护技术重点实验室 ,四川绵阳　621000)
摘　要:以光叶海桐的叶和茎为外植体 ,进行了组织培养愈伤组织诱导的实验研究。结果表明:在以 MS培养
基和 WPM培养基为基本培养基附加不同外源激素 2, 4-D、NAA、KT、BA条件下 ,光叶海桐在一个较宽的生长范围
内 , 均可诱导产生愈伤组织。最佳诱导和增殖条件是 MS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L)光 、暗交替(光照
14h/d)。在此条件下 , 30d后 ,叶的诱导率达 90%,愈伤组织继代培养 14d后 ,平均增殖率达 198.8%。
关键词:光叶海桐;愈伤组织诱导;植物激素;增殖条件
中图分类号:Q943.1　　文献标识码:A　　文章编号:1672-612x(2007)11-0061-05
光叶海桐(PitosporumglabratumLindl.)为海桐花科植物 ,主要分布于广东 、广西 、湖南 、四川 、贵州 、山
西等地 ,香港的大帽山和嘉道理农场暨植物园也有少量分布 [ 1] 。中国医书对其种子(山枝仁)和根皮(山枝
根)的功用及用途有详细记载 ,其中山枝仁有清热 、生津止渴之功效 ,可治虚热心烦 、口渴咽痛等病症 ,山枝
根有补脾肾 、祛风湿 、活血通络之功能 ,可虚劳喘咳 、咽痛 、牙痛 、腹痛 、关节痛等[ 2] 。光叶海桐茎叶醇提取
物具有显著的镇痛作用[ 3] 。文献报道 ,从海桐花科植物提取的抗肿瘤物质与从其他植物提取的活性成分
相比 ,对变性的细胞有较好的选择性和较低的毒性 [ 4] 。但天然植物体内化学成分的含量较低 ,要提取其化
学成分就要大量开采光叶海桐植株 ,这会对生态平衡造成一定的破坏 。随着生物技术的发展 ,通过植物组
织培养方法 ,可以生产天然的植物成分并提高某些植物成分的含量 , 如通过对红豆杉 (Taxuschinensis
(Pilg)Rehd.)愈伤组织培养 ,使紫杉醇及三尖杉醇的含量均高于外植体的含量 [ 5] 。目前 ,有关光叶海桐愈
伤组织培养国内外尚未见公开报道。本研究对光叶海桐愈伤组织诱导进行了初步探索 ,获得了光叶海桐
愈伤组织诱导及增殖的适宜培养条件 ,为建立大规模细胞培养生产光叶海桐有效药用成分提供了必要前
提条件 。
1　材料与方法
1.1　材料
愈伤组织培养所用的外植体来自于西华师范大学校园内种植的光叶海桐。
1.2　愈伤组织的诱导与培养
1.2.1　外植体类型和接种方法
于 3 ～ 4月陆续从母株上采取嫩枝和嫩叶 ,自来水冲洗 1h,双蒸水清洗外植体后 ,放入培养皿内 ,酒精
擦拭后放入超净工作台。 70%乙醇浸泡消毒 30s,双蒸水清洗 4次。次氯酸钠浸泡 1 ～ 10min(视材料的幼
嫩程度而定),放入培养皿中双蒸水清洗数次。剪取茎段(0.5cm～ 1cm)、叶片(0.5cm×0.5cm)接种到培
养基上 。
1.2.2　培养基
DOI :10.16276/j.cnki.cn51-1670/g.2007.11.017
选用基本培养基 MS和 WPM,分别添加不同浓度的生长素 2, 4-D、NAA和细胞分裂素 BA、KT, 30g/L
蔗糖 , 8g/L琼脂 , 0.1mol/LNaOH和 0.1mol/LHCl调节 pH为 5.8,高压(121℃)灭菌 15min。
1.2.3　培养条件
置于 HPG-280H人工气候箱内培养 ,温度为(24±2)℃。诱导过程光照条件分两种处理:24h暗启动
培养后光 、暗交替培养(14h光照 , 10h黑暗),光照强度 2000lx;全程黑暗培养。
1.3　出愈率计算方法
在诱导过程中 ,如发现外植体染菌 ,则马上将此瓶取出人工气候箱。培养 30天后 ,将未染菌外植体计
算诱导率 ,计算公式如下:
出愈率(%)=(出愈外植体块数 ×100)÷(接种数 -染菌块数)
1.4　愈伤组织增殖率计算方法
先称量继代接种前培养瓶的重量 ,再称接种后的重量 ,从而得到接种的愈伤组织重量 。培养 14d后 ,
再次进行接种 ,按同上方法测知 14d后愈伤组织的重量 ,通过以下公式求增殖率:
接种鲜重(mg/瓶)=接种后瓶重(mg)-接种前瓶重(mg)
收获鲜重(mg/瓶)=收获前瓶重(mg)-收获后瓶重(mg)
增殖率(%)=(收获鲜重 -接种鲜重)÷接种鲜重 ×100%
2　结果与分析
2.1　培养基及其诱导条件的筛选
基本培养基的类型是愈伤组织诱导的一个重要影响因素 [ 6] ,本试验选用 MS、WPM培养基 ,分别添加
2mg/L的 2, 4-D调整 pH到 5.8,经加热溶解后 ,分装至 50ml三角瓶中 ,每瓶 20ml, 0.15MPa压强下消毒
15min后冷却 ,在超菌工作台内接种后放置于光 、暗交替培养和暗培养。 30天后观察并计算光叶海桐在两
种培养基下出愈率(表 1)。
通过试验得知 ,光叶海桐在 MS培养基光 、暗交替条件下诱导率最高(55%);在 WPM暗培养条件下次
之(35.09%);在 MS培养基暗培养条件下和在 WPM光 、暗交替培养条件下都相对很低 。因此 , MS培养基
在光 、暗交替培养条件下对光叶海桐外植体愈伤组织诱导最为有利 。
表 1　基本培养基及培养条件对比
Table1　Contrastofbasalmediumanddiferentcultureconditions
编号
Serialnumber
培养基
Basalmedium
外植体数(个)
Numberofexplants
愈伤组织数(块)
Numberofcalus
出愈率(%)
calusinducingrates
光照 14h/d 暗 光 14h/d 暗 光 14h/d 暗
1 MS+2, 4-D 60 57 33 14 55 24.56
2 WPM+2, 4-D 58 57 9 20 15.52 35.09
2.2　植物激素的筛选
2.2.1　生长素对光叶海桐愈伤组织诱导影响
选择 MS基本培养基配比以不同浓度的生长素 2, 4-D和 NAA接种外植体于光 、暗交替培养 ,以筛选
出最优化的生长素及其对光叶海桐愈伤组织诱导的最适浓度(表 2)。试验表明 ,不同生长素对光叶海桐愈
伤组织诱导具有显著差异:2, 4-D比 NAA更适合于光叶海桐愈伤组织的诱导 ,在 2, 4-D与 BA(1.0mg/
L)组合的培养基上 ,光叶海桐愈伤组织诱导率整体都较高 ,并且在一定范围内随着 2, 4-D浓度的增加 ,愈
伤组织诱导率随着增加 ,当浓度达到 1.5mg/L时 ,诱导率达到一个最大值 ,当其浓度再增加时 ,则抑制愈伤
组织诱导 ,因此 ,诱导率又呈现下降趋势。在 NAA与 BA(1.0mg/L)组合的培养基上 ,光叶海桐愈伤组织诱
导率很低 ,说明 NAA不适于光叶海桐外植体脱分化成愈伤组织 。
·62· 绵阳师范学院学报(自然科学版) 第 26卷
表 2　生长素对愈伤组织诱导影响
Table2　Efectofdifferentkindsandconcentrationsauxinoninductionofcallus
编号
Serialnumber
基本培养基
Basalmedium
激素(mg/L)
Hormone
2, 4-D NAA BA
外植体数(个)
Numberofexplants
愈伤组织数(块)
Numberofcalus
出愈率(%)
calusinducingrates
1 MS 0.5 0.5 58 26 44.83
2 MS 1.0 0.5 56 30 53.57
3 MS 1.5 0.5 57 45 78.95
4 MS 2.0 0.5 60 34 56.67
5 MS 0.1 0.5 59 5 8.47
6 MS 0.5 0.5 56 3 5.36
7 MS 1.0 0.5 57 0 0
8 MS 2.0 0.5 60 0 0
2.2.2　细胞分裂素对光叶海桐愈伤组织诱导影响
植物愈伤组织诱导的优化通常需要生长素和细胞分裂素协调 。因此 ,在 MS光 、暗交替培养 ,得出选取
2, 4-D(1.5mg/L)的最适生长素条件下 ,配比以两种不同浓度的细胞分裂素 BA、KT进行优化试验(表 3)。
试验显示 , BA和 KT都能与 2, 4-D(1.5mg/L)组合诱导出光叶海桐愈伤组织 。BA在 0 ～ 1mg/L范围内 ,
随着浓度增加 ,诱导率增大 ,当 BA浓度大于 1mg/L时 ,愈伤组织诱导率开始下降 ,说明高浓度(>1mg/L)
BA抑制愈伤组织诱导;KT则在 0.5mg/L时最为适宜 ,当大于 0.5mg/L时 ,愈伤组织诱导即受到抑制 ,低浓
度(<0.5mg/L)KT适宜于光叶海桐愈伤组织诱导。综合比较 ,光叶海桐愈伤组织诱导在 MS+2, 4-D(1.
5mg/L)+BA(1mg/L)组合的培养基条件下诱导率最高 。
表 3　细胞分裂素对愈伤组织诱导影响
Table3　Effectofdiferentkindsandconcentrationscytokininoninductionofcalus
编号
Serialnumber
基本培养基
Basalmedium
激素(mg/L)
Hormone
2, 4-D KT BA
外植体数(个)
Numberofexplants
愈伤组织数(块)
Numberofcallus
出愈率(%)
callusinducingrates
1 MS 1.5 0.2 59 45 76.27
2 MS 1.5 0.5 58 51 87.93
3 MS 1.5 1 60 40 66.67
4 MS 1.5 1.5 58 33 56.90
5 MS 1.5 0.5 59 52 88.14
6 MS 1.5 1.0 60 54 90
7 MS 1.5 1.5 58 50 86.2
8 MS 1.5 2.0 60 50 83.33
2.3　不同外植体对光叶海桐愈伤组织诱导影响
以茎段和叶片为外植体 ,接种于 MS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L)培养基上 ,试验光叶海桐愈
伤组织诱导情况(表 4)。结果显示:茎段的愈伤组织诱导率非常低 ,不适宜于光叶海桐愈伤组织的诱导;叶
诱导率达 90%,愈伤组织呈白色略黄 ,疏松(图 1)。
·63·第 11期 蒋炜等:光叶海桐愈伤组织诱导及增殖研究
图 1　光叶海桐愈伤组织
Fig.1.CallusderivedfromPittosporumglabratumLindl.
表 4　不同外植体来源对愈伤组织诱导的影响
Table4　Efectofdifferentsourceofexplantsoninductionofcallus
外植体
Explantsplant
培养基
Medium
外植体数(个)
Numberof
explants
愈伤组织数(块)
Numberof
calus
出愈率(%)
Calusinducing
rates
愈伤组织生长情况
Growthecondition
ofcallus
叶 leaf MS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L) 60 54 90 + + + +
茎 stem MS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L) 59 5 8.47 +
2.4　愈伤组织的继代培养及其增值率
选择健康愈伤组织分成小块接种于新鲜培养基上进行继代培养。 14d后 ,再次继代接种 ,记录数据 ,探
讨愈伤组织在 2, 4-D和 BA配比培养基上的增值率(表 5)。结果表明 ,光叶海桐愈伤组织增殖率较低 ,在
MS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L)培养基下 ,增殖率达到最大(198.8%),当 2 , 4 -D浓度超过 2.
0mg/L时 ,愈伤组织呈灰黄色 ,并且极易褐化。
表 5　不同激素配比对愈伤组织增殖影响
Table5　Efectofdiferentkindsandconcentrationshormonesonmultiplicationofcallus
编号
Serialnumber
基本培养基
Basalmedium
激素(mg/L)
Hormone
2, 4-D BA
均接种鲜重
(mg/瓶)
Weightofinoculation
平均收获鲜重
(mg/瓶)
Harvestofinoculation
平均增殖率(%)
Rateofmultiplication
1 MS 0.5 1.0 22.6 30.9 136.7
2 MS 1.0 1.0 19.1 28.2 147.6
3 MS 1.5 1.0 24.1 47.9 198.8
4 MS 2.0 1.0 27.2 ＊
　　注:接种瓶数 n=12;＊表示愈伤组织大部分褐化。
Notes:amountofinoculationn=12;　＊expressedcallustobecomebrown.
·64· 绵阳师范学院学报(自然科学版) 第 26卷
3　结论与讨论
通过添加以生长素 2, 4-D的基本培养基试验光叶海桐植体诱导得知:MS在光暗交替条件下和 WPM
在黑暗条件下均可诱导光叶海桐愈伤组织的形成。 MS基本培养基在植物愈伤组织诱导培养中已被广泛
的采用 ,本试验发现 , MS培养基也是光叶海桐愈伤组织诱导生长的适宜培养基 ,而以 WPM培养基诱导培
养愈伤组织的却较少 。本试验发现 ,在 WPM培养基上也能诱导出光叶海桐愈伤组织 ,但在后来的愈伤组
织培养中发现 WPM培养基中的愈伤组织生长缓慢 ,因此 ,在 WPM培养基上 ,光叶海桐愈伤组织培养条件
还需要进一步研究。
通过在 MS基本培养基光 、暗交替培养条件下植物激素的筛选实验得知:植物激素是光叶海桐外植体
脱分化为愈伤组织的重要影响因素。生长素 2, 4-D能促进光叶海桐外植体脱分化形成愈伤组织 ,而 NAA
则抑制愈伤组织的形成;细胞分裂素 KT和 BA均能促进光叶海桐愈伤组织的形成。其诱导最佳培养基是
MS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L),在此条件下以叶为外植体 ,诱导率可达 90%,但光叶海桐茎愈伤
组织诱导率却很低。
光叶海桐外植体在添加外源激素的培养基上经系列变化诱导出愈伤组织后 ,需要通过继代培养以使
愈伤组织增殖生长。光叶海桐愈伤组织增殖研究表明 ,光叶海桐愈伤组织增殖率较低 ,在 MS+2, 4-D(1.
5mg/L)+BA(1.0mg/L)培养基下 ,光叶海桐增殖效果相对较高 ,增殖率可达 198.8%,但随着 2, 4-D浓度
增大 ,愈伤组织易褐化 ,说明高浓度的 2, 4-D是胁迫脱分化细胞产生褐化死亡的重要因素。
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StudiesonCalusInductionandMultiplication
ofPitosporumGlabratumLindl
JIANGWei1 , SUZhi-Xian1, 2, ＊ , CHENGuang-Deng1
(SichuanProvincialKeyLaboratoryofEnvironmentalScienceandBiologicalDiversityConservation,
XihuaNormalUniversity, Nanchong, Sichuan　637002)
Abstract:LeavesandstemsofPitosporumglabratumLindlareusedasexplantsintissueculture.There-
sultsshowthat:theCalusofPitosporumglabratumLindlcouldbeinducedwithinalargescaleofculture, cul-
turedintheMSorWPMmediumsupplementedwithdiferentkindsofhormones:2, 4-D, NAA, KT, BA.The
optimizedconditionforinductionandmultiplicationisMS+2, 4-D(1.5mg/L)+BA(1.0mg/L)indarkness
andlightinturn(14hoursiluminationeveryday).Theinducingratesofleafcouldreach90%.Whenitiscul-
turedinthiskindofmediumfor30days, theaveragemultiplicationratescouldbeupto198.8% afterthesubcul-
turationofcalusfor14days.
Keywords:PitosporumglabratumLindl;calusinduction;hormone;multiplicationcondition
·65·第 11期 蒋炜等:光叶海桐愈伤组织诱导及增殖研究