全 文 ：灰树花 !#!#启动子的克隆与表达载体的构建
王海燕 1,2 林俊芳 2,3 柳 永 1,2 郭丽琼 2,3*
（1中 国 热 带 农 业 科 学 院 热 带 生 物 技 术 研 究 所2中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 海口 571101；
3华 南 农 业 大 学 食 品 学 院 生 物 工 程 广州 510640）
摘 要 根据已经报道有强启动子活性的香菇 !# 启动子设计引物，从灰树花基因组 PCR扩增获得大小分别
为1018，615bp的2个片段 !#!GF1和 !#!GF2。通过 DNA序列测定得知二者的大小分别为 1018，615bp。
经NCBI中的 BLASTN比较，!#!GF1，!#!GF2与已报道的香菇中克隆的 gLeGPD基因上游序列的同源性分
别为 96%，98%。通过启动子预测软件分析，结果表明，!#!GF1和 !#!GF2含有多个顺式作用元件如 TATA
box，GATAbox，CAATbox等，初步证实 !#!GF1，!#!GF2可能有较强的启动子活性。将 !#!GF1，!#!GF2
分别与切除 CaMV35S启动子的 pCAMBIA1301大片段进行亚克隆，构建成表达载体 pCBgpdGF1和
pCBgpdGF2。
关键词 灰树花 启动子 基因组PCR 表达载体
中图分类号 S646.01
食用菌的转化表达效率相对比较低，开发寻找能够高效表达的启动子依然是食用菌转化研究的重
点。目前对食用菌启动子的研究主要集中于强启动子和同源启动子，使用同源启动子有利于调控因子
的识别，减少甲基化，因而对提高转化效率有利。Schuren和 Wessels在用 ble基因转化模式菌株裂褶菌
$%&’()&*++,- %)--,./ 时，使用构巢曲霉 01/2!’++,1 .’#,+3.1 的 !#启动子得不到转化子，使用裂褶菌的
!#启动子则转化效率高[1]。Chen等在转化双孢蘑菇 0!32’%,1 4’)2,1 时，分别使用双孢蘑菇的 !#启动
子、构巢曲霉的 !#启动子、花椰菜病毒的35S启动子进行转化，结果转化率分别为 15%，1%，0%。这
说明了同源启动子有利于转化[2]。GPD基因（glyceraldehyde!3!phosphatedehydrogenasegene）编码 3!
磷酸甘油醛脱氢酶，为糖酵解途径中的 1个关键酶，在酵母 $3%%&32)-*%/1 %/2/5’1’3/ 中，!# 蛋白的含量
达到细胞中可溶性蛋白总量的 5%[3，4]，并且 2%~5%的 poly（A）+RNA为 !# mRNA[5]，由此可知，!#
基因的启动子可能为一强启动子。#$ 启动子最先是从酵母中分离到，实验结果证明该启动子具有很
强的调控异源基因表达的作用[1]。目前，该启动子已用于构建转化许多丝状真菌（如构巢曲霉、裂褶菌、
双孢蘑菇等）的表达载体[6]。笔者根据已报道gLeGPD基因上游区域均有启动子活性的 2个片段（其中
1个片段是另1个片段的一部分），设计 !#!GFF1/!#!GFR和 !#!GFF2/!#!GFR2对引物。希望能够
在灰树花（62’7)+3 72).#)13）基因组中克隆到这 2个片段，构建成以 GUS基因为报告基因的表达载体，
通过GUS活性检测确定其是否具有启动子活性，并对大小片段的启动子活性进行初步比较。
$ 材料和方法
$%$ 材 料
$%$%$ 供试菌株和质粒 灰树花（62’7)+3 72).#)13）、草菇（8)+532’/++3 5)+53%/3）V34菌种购自华中农业
大学菌种实验中心；大肠杆菌 9: %)+’DH5α和质粒pCAMBIA1301为本实验室保存。
$%$%& 培养基 A.PDA培养基：马铃薯 200g/L、磷酸氢二钾 3g/L、硫酸镁 1.5g/L、葡萄糖 20g/L、琼脂
20g/L；B.液体PDA培养基:上述不含琼脂的PDA培养基。
$%$%’ 试 剂 Taq酶，dNTP，IPTG，X!Gal，氯霉素均购自北京华美生物技术有限公司；9%)RI，$/I，
;1
王海燕 女，1977年生，硕士，助研。研究方向：植物分子育种。电话：0898!66894533，E!mail:helenwish@126.com
*通讯作者，郭丽琼，E!mail:guolq@scau.edu.cn
收稿日期：2005!05!18 修回日期：2005!11!02
热 带 作 物 学 报
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第 78卷 第 9期
7<<=年 >7月
热 带 作 物 学 报 26卷
Mannheim公司；pGEM!Teasyvector购自Promega公司；其它生化试剂和常规试剂均为国产分析纯。
!# 方 法
!#! 灰树花 !#启动子的克隆
!#!! 灰树花菌丝的培养及其基因组 DNA的提取 按常规方法培养灰树花菌丝，从长满菌丝的平
板上收集1!2g灰树花菌丝体，置于预冷的研钵中，加入适当的液氮，快速研磨至粉末状并转入预先加
有3mLFDEB（50mmol/LTrisHClpH7.5，100mmol/LEDTA，0.5%SDS，0.3mol/LNaAc） 的离心管
中，缓慢颠倒混匀，于68水浴中保温30min，其间每3!5min轻轻混匀1次。12000r/min离心5min，
取上清，转入新管。加入1mL3mol/L的KAc（pH5.2），轻轻混匀，冰浴20min。10000r/min离心20min，
将上清转移至新管中。加入等体积的phenol：chloroform，混匀，12000r/min离心5min。吸取上相至1新
管中，再加入等体积的异丙醇（isopropanol）或2倍体积的乙醇，轻轻混匀，冰浴 30min。12000r/min离
心5min，弃上清，以体积分数70%的乙醇洗涤沉淀2次。真空干燥后，加入适量的 TE溶解DNA。
!#!# 引物设计 根据已报道的香菇Lentinulaedodes的 !#启动子序列设计2对引物，其核甘酸序
列分别为：!#!GFF15!CGAAGTTTGAGGTGGTTG!3和 !#!GFR5!ATTCAAGCAGTCAATGGA!3；
!#!GFF25!TATGCTGGTTATCTGAG!3和 !#!GFR5!ATTCAAGCAGTCAATGGA!3。实为设计
3条引物。
!#!$ PCR扩增及 PCR产物的回收与纯化 PCR的反应体系为：10μLPCRBufer4.0μL，MgCl2
（25mmol/L)4.0μL，dNTPs（10mmol/L）0.8μL，PrimerF（2.5μmol/L）8.0μL，PrimerR（2.5μmol/L）
8.0μL，TaqDNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA2.0μL，总体积 40.0μL。PCR循环的参数为：预变性94
5min；循环设定：变性9430s，退火5030s，延伸721min30s，35个循环；最后延伸7210min；
反应完成后放置4保存。PCR产物的回收与纯化根据产品说明书上的操作步骤进行，将 PCR扩增到
的产物分别命名为 !#!GF1和 !#!GF2。
!#!% 目的片段的连接与转化 目的片段的连接根据 pGEM!TReasyVector产品说明书上的步骤进
行；连接产物转化大肠杆菌 $% &’() DH5a获得阳性克隆，其质粒分别命名为 pLWgGF1和 pLWgGF2，根
据文献[7]的方法进行。连接产物进行PCR扩增和EcoRI酶切鉴定。
!#!& 插入片段的DNA序列测定及启动子功能分析 将 PCR鉴定和酶切鉴定无误、携带重组质粒
的大肠杆菌菌株，寄往上海联合基因有限公司测序，并借助启动子的序列分析软件对该序列进行启动
子活性分析。
!## 灰树花 !#!GF启动子的功能检测
!##! 接头的设计与合成 依据与限制性内切酶EcoRI和 SpeI酶切留下的凸出末端互补的原则，设
计 1个接头，并按照实验要求在接头中间添加酶切位点所设计的 2条 Oligo核苷酸，即：Oligo(1)5!
CTAGTATCTAGACTGCAGGC!3和Oligo(2)5!CATGGCCTGCAGTCTAGATA!3。2条 Oligo
核苷酸退火后即为接头，其中包括 SpeI，XbaI，PstI，NcoI4个酶切位点。寡核苷酸链由上海生工合成。
!### 表达载体的构建 将含有目的片段的质粒 pLWgGF1，pLWgGF2用限制酶 SpeI和 EcoRI进行
双酶切，电泳回收含目的片段的小片段，在 T4DNA连接酶的作用下，将小片段与经 NcoI和 EcoRI双酶
切pCAMBIA1301后的大片段连接成线性的载体，最后借助接头将线性载体连接成环状表达载体，分别
命名为pCBgpdGF1和pCBgpdGF2，具体构建过程见图1。
# 结果与分析
#! 灰树花 !#’()启动子的克隆
#!! 灰树花总DNA提取 本实验中采用的 FDEB提取方法比较适合于灰树花基因组DNA的提取，
简单快捷，得到的基因组DNA比较完整，没有降解（见图 2）。
#!# PCR扩增及重组质粒的鉴定 灰树花基因组分别以 !#!GFF1/!#!GFR和 !#!GFF2/!#!
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4期 王海燕等：灰树花 !#!GF启动子的克隆与表达载体的构建
图 ! 表达载体 #$%&’(!和 #$%&’()的构建程序
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热 带 作 物 学 报 26卷
GFR为引物进行 PCR扩增，得到 2个片段如图 3泳道 2、3所示，依次命名为 !#!GF1，!#!GF2，回收
该片段并将其与 pGEM R!Teasyvector连接，转化大肠杆菌，得到重组质粒。分别用引物 !#!GFF1/
!#!GFR，!#!GFF2/!#!GFR对重组质粒做 PCR鉴定以及 EcoRI酶切鉴定，结果见图 3泳道 4，5，6，
7，证明 !#!GF1和 !#!GF2已克隆到 pGEM R!Teasyvector上。重组质粒分别命名为 pLWgGF1，
pLWgGF2。
!#$ 目的片段的序列测定 将pLWgGF1，pLWgGF2送往上海联合基因有限公司测序，测序结果显示：
片段 !#!GF1的大小为1018bp，片段 !#!GF2的大小为615bp。!#!GF1和 !#!GF2的前615bp核苷
酸序列的同源性为 99%，有 8个碱基存在差异；两者与已报道的从香菇中克隆的 !# 基因的上游序列
有很高的同源性，同源率分别为：96%和98%。
!! 拟定启动子 !#%&’#和 !#%&’!的功能元件分析
采用NeuralNetworkPromoterPrediction软件对 !#!GF1和 !#!GF2进行启动子区功能分析（htp:
/www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html），分析结果见图 4和图 5。表明：这 2个序列都有基础启动子
区（图中加底纹的序列），包括起始子（加下划曲线）和TATAbox（加粗斜体部分）。TATAbox的共有
碱基序列：5!TATA(A/T)A(A/T)!3，是 RNA聚合酶Ⅱ识别的位点，也是一些反式作用因子与 DNA相
互作用的位点之一。TATAbox与CAATbox作为真核基因启动子的上游元件，能够提高基本启动子的
转录活性。采用SIGNALSCANSEARCHREQUEST软件对这 2个片段进行分析（htp:/www.dna.afrc.
go.jp/htdocs/PLACE/signalscan.html），结果表明：!#!GF1和 !#!GF2都含有比较多的顺式作用元件，
如 !#!GF1序列中含有 1个 CCAATbox，5个 CAATbox，5个 GATAbox，1个 Ibox（GATAAG）,1个
ACGTTbox，1个 IboxCORE（GATAA）；!#!GF2序列中含有 2个 CAATbox，4个 CCAATbox，3个
GATAbox，1个 Ibox，1个 IBOXCORE。具体位置见图 2，3加框序列，主要元件的功能如下：
CCAATBOX结合到 HSEs上以提高热击蛋白启动子的活性；CAAT和组织特异的启动子活性有关，它
控制转录起始的频率；GATAbox和光调节，组织特异表达有关，保守性比较强；ACGTTbox是植物
bZIP蛋白结合位点；Ibox是光调节基因序列上游的保守区，它是转录激活因子。
!$ 表达载体的构建及鉴定
表达载体的构建过程见图1，具体方法以2.2.2。分别以 !#!GFF1/!#!GFR，!#!GFF2/!#!GFR为
引物，对表达载体 0pCBgpdGF1和 pCBgpdGF2进行 PCR扩增鉴定，结果见图 6（泳道 3和 4）。以限制
1.灰树花基因组 DNA;2.200ngλ!#
图 ! 灰树花基因组 ()*的电泳图
1.DL2000;2.!#!GFF1/!#!GFR为引物的基因组PCR扩增;3.!#!GFF2/!#!GFR
为引物的基因组 PCR扩增;4.pLWgGF1的 PCR鉴定;5.pLWgGF2的 PCR鉴定;6.
pLWgGF1的 EcoRI酶切鉴定;7.pLWgGF2的 EcoRI酶切鉴定。
图 $ 灰树花基因组 +,-产物检测及质粒的 +,-、酶切鉴定电泳分析
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4期 王海燕等：灰树花 !#!GF启动子的克隆与表达载体的构建
性内切酶EcoRI和PstI对质粒pCBgpdGF1和pCBgpdGF2进行双酶切，结果如图6（泳道5，6）。证明表
达载体pCBgpdGF1和pCBgpdGF2构建成功。
001 CGAAGTTTGAGGTGGTTGCGAATACGCTCGTAAGTTGACAATACAGCATA
051 ACTGATATATCTTGTGACAAGCCATATCGGGCATATCCCCGGTCACATCG
101 TCGAGCGGAATTTTTTCTCTTTCCAGAGTGCTAGTGAGATGCGACTCTTG
151 TCGTACTAGCTTAGTGAACAATGACCAAGAAAGCTCGTGAAGAGGCCGGG
201 TCCGGTCGCGCTAATGTACAGGATAGCCTTAGCTGGAGTATAGCAGTTAA
251 CTCGGGAGTGATTATACATCGGTTGAGAGGTATTTCGTTTCAGGCCTTGC
301 CTCTAATCCCTTGCTCTGCATATGCACCAGACAAATCCGTTTTGTCGTAG
351 ATGCGGGAGTTCAGGTTTTACGCCAAACCGAAAAGAGTTGCATGAGCATC
401 CCTTTATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTG
451 CAGTCGGAGAGCCGCATGTATCACGGAAAGGACTCGAACAGGGAGTTTTA
501 TCTATTTTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGC
551 ATCCATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATGTCATGAAA
601 TGGTTGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCC
651 AGGCCAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTTTTCAA
701 AGGCACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATG
751 GGGCGATAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGA
801 CTCGGCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTCT
851 TAAGGTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATC
901 AAGATTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAGGGATCAGTTATGTTTTTC
951 GTCCGCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAA
1001 TCCATTGACTGCTTGAAT
图 ! !##$%的序列及预测功能元件（下划直线为引物序列）
001 TATGCTGGTTATCTGAGCGGGCCCGTATCCTATCGGCGTTAGAGTGCAGT
051 CGGAGAGCCGCGTGTATCACGGAAAGGACTCGGACAGGGAGTTTTATCTA
101 TTCTTATTGGTCGATATCAGTCAGATTGTCAGTGCGTCAAAGTTGCATCC
151 ATAAGGCTACTACGGTGAAACCGGTGTATCCTGGGATATCATGAAATGGT
201 TGTATGCAGAAGATAAGAATGAGAGTAGTTCTAGAACAACAAACCCAGGC
251 CAGGGAGGAAGCTGTAGCATTTGCAAGACTTTGCAGGGCTTTTCAAAGGC
301 ACTTCCATCCAAAGCTCGAGCACGGTTCCAGGCAACCTTAGTCATGGGGC
351 GACAGAACTGAAGAACGTTTGCTGATTGGCAGTCCATCCCAAAGGACTCG
401 GCCAATAAATCCTACCCAATCGCAGGTCCGAGGTACTAAAGTGTTTTAAG
451 GTCTAGACTTTTAGGGCTATTGTCGAAGTCACAACATCACGCAATCAAGA
501 TTTGACTGAAGCGCGATTATCTATAAAAGGATCAGTTGTGTTTTTCGTCC
551 GCATCTTTTCCTTGTTCCACAACCTTCGATTCTAAATACACTCCAATCCA
601 TTGACTGCTTGAATA
图 & !##$’核苷酸序列及预测功能元件（下划直线为引物序列）
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热 带 作 物 学 报 26卷
! 讨 论
本实验从灰树花基因组 DNA中同源克
隆到 !#!GF1和 !#!GF22个片段，通过启
动子序列分析发现二者同已报道的有启动
子活性、具有典型启动子特征元件的 !# 启
动子有着很高的同源性；!#!GF1和 !#!
GF2都有基础启动子区，以及对转录有重要
作用的TATAbox,CAATbox等基本的顺式
作用元件。这些初步说明从灰树花基因组中
克隆到的 !#!GF1和 !#!GF2具有较高的
启 动 子 活 性 。 将 这 2个 片 段 克 隆 在
pCAMBIA1301上以替代35S启动子，构建
成表达载体pCBgpdGF1和pCBgpdGF2。
关于上述从灰树花中克隆的 2个拟定
启动子的启动子活性还需要通过转入食用
菌尤其是灰树花中检测 GUS基因是否表达
以及表达量来加以验证。但是由于食用菌的
遗传转化体系尚未成熟，故转化实验未做成
功。因此本实验的后续工作重点是食用菌尤
其是灰树花遗传转化体系的建立。
参 考 文 献
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Genet,1994(26):179~183
2ChenX,StoneM,SchlagnhauferC,etal.AfruitingbodytissuemethodforeficientAgrobacterium!mediatedtransformationof3!(4*,2)
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3GoodwinW,PalasJA,JenlinsGI.Transcriptsofageneencodingaputativecelwal!plasmamembranelinkerproteinarespecificalycold!
inducedin54())*,( 6(2).PlantMolBiol,1996,31(2):771~781
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dehydrogenasegenepromoter.GeneDec,1984,32(3):263~274
5HiranoT, SatoT, YaegashiK,etal. Eficienttransformationoftheediblebasidiomycete8-6.*62) -#%#-) withavectorusinga
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6HiranoT,SatoT,OkawaK,etal.Isolationandcharacterizationoftheglyceraldehydes!3!phosphatedehydrogenasegeneofLentinusedodes.
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7黄培堂,J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南.第 3版.北京:科学出版社,2002.96~99
M 1 2 3 4 5 6
M,DL15000+2000;1以灰树花基因组 DNA为模板 gpd-GFF1/gpd-GFR为
引 物的 PCR扩增；2以灰树花基因组 DNA为模板 gpd-GFF2/gpd-GFR为引
物的 PCR扩增；3pCBgpdGF1的 PCR鉴定;4pCBgpdGF2的 PCR鉴定；5
以 EcoRI和 PstI双酶切 pCBgpdGF1; 6以 EcoRI和 PstI双酶切 pCBg-
pdGF2。
图 表达载体 #$%&#’()*和 #$%&#’()+的酶切、,$-鉴定电泳
分析
62
4期 王海燕等：灰树花 !#!GF启动子的克隆与表达载体的构建
!#$%$& #’ !#()* +,#-#./, ’,#- $%&’()* ’%(+#(,*
0$1 !#$2.,34.%$& #’ 567,/22%#$ 8/4.#,
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