全 文 ：二次通用旋转组合设计优化红芪总多糖与皂苷的酶解提取工艺
魏舒畅， 陈方圆， 闫治攀， 金 辉， 王继龙
(甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000)
收稿日期:2013-08-01
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (81060345)
作者简介:魏舒畅 (1969—) ，男，教授，硕士，从事中药制剂工艺研究。Tel: (0931)8765391，E-mail:wshch006@ sina. com
摘要:目的 采用二次通用旋转组合设计优化酶解提取红芪总多糖与皂苷的工艺。方法 在均匀设计及单因素试验的
基础上，选定生物酶用量、酶解时间、提取时间和加水倍量为试验因素，以红芪总多糖、总皂苷提取率为指标，采用
二次通用旋转组合设计对红芪酶解提取工艺进行优化。结果 优化所得红芪酶解提取的最佳工艺条件为酶用量
280 mg，酶解时间 90 min，加水量 21 倍，提取时间 180 min，在此条件下，红芪总多糖得率为 9. 58‰，总皂苷得率为
4. 20‰。结论 优化所得红芪酶解提取工艺稳定可行。
关键词:红芪;总多糖;总皂苷;酶解提取;二次通用旋转组合设计
中图分类号:Ｒ944 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2014)02-0286-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 02. 015
Optimization of technological conditions for enzymatic extraction of total poly-
saccharide and saponin from Ｒadix Hedysari by quadratic general rotary unitized
design
WEI Shu-chang， CHEN Fang-yuan， YAN Zhi-pan， JIN Hui， WANG Ji-long
(Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)
KEY WOＲDS:radix hedysari;total polysaccharide;total saponin;enzymatic extraction;quadratic general rotary
unitized design．
红芪为豆科植物多序岩黄芪 Hedysarum polybot-
rys Hand． -Mazz． 的干燥根，具有补气升阳、固表
止汗、利水消肿等功效［1］。作为中医常用传统药
物在恶性肿瘤及各种退行性疾病的临床治疗与康复
中用量较大。
酶解法提取有诸多优点［2-4］，已广泛用于中药
制药领域［5-8］，红芪属纤维性根茎类药材，适合采
用酶解法提取，但截至目前尚未见相关研究报道。
二次通用旋转组合设计，能确保与试验中心点距离
相等的试验点上的预测值方差相等，克服了其他统
计方法的不足而广泛应用于科学试验中［9-11］。因
此，本实验以红芪总多糖、总皂苷得率为指标，采
用二次通用旋转组合设计对复合酶提取红芪多糖、
皂苷的工艺条件进行优化，研究结果将为该技术用
于红芪提取物的制备提供依据，解决由于红芪精加
工基础研究薄弱所致其高品质提取物及下游产品较
少的现状。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 UV Blue Star B 型紫外-可见分光光度
计 (LabTech，北京莱伯泰科仪器有限公司) ;DD-
5M 离心机 (湘仪离心机仪器有限公司) ;AL104
型电子天平 (METTLEＲ TOLEDO，瑞士) ;电热恒
温水浴锅 (浙江省余姚市检测仪表厂) ;AKＲY-
UP-1816 超纯水机 (成都唐氏康宁科技发展有限公
司)。
1. 2 试药 纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶均由甘
肃华羚生物科技有限公司提供，红芪药材购自甘肃
武都，其他所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 红芪多糖的提取、测定与得率计算 向红芪
药材中加入 4 倍量蒸馏水，再加入一定量的酶搅
匀，于 50 ℃酶解一段时间后迅速升温至沸腾灭活
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10 min，补水并回流提取，水提液浓缩 (药液比为
1 ∶ 2)后加乙醇使含醇量为 40%，低温静置 24h
后离心，上清液加乙醇使含醇量为 75%，静置离
心，沉淀用蒸馏水溶解并定容，最后采用改良差示
酚硫法［12］测定多糖含量。红芪多糖得率计算如下:
y1 /‰ = ［(C × V) /M］ × 1000，式中:C为多糖
质量浓度 (μg /mL) ，V 为多糖液体积 (mL) ，M
为红芪质量 (g)。
2. 2 红芪皂苷的提取、测定与得率计算 精密吸
取上述浓缩液 10 mL，用水饱和正丁醇萃取 4 次
(15、15、10、10 mL) ，合并正丁醇萃取液，水浴
挥干，残渣用甲醇溶解并转移至 25 mL量瓶中。红
芪皂苷的测定采用香草醛-高氯酸法［13］，以黄芪甲
苷对照品质量 m (mg)为横坐标，以吸光度值 A
为纵坐标，得到回归方程 A = 2. 637 4 m － 0. 000 8
(r = 0. 999 3)。红芪皂苷得率计算如下:y2 /‰ =
m /M × 1 000。
2. 3 水提工艺考察 采用均匀设计法对提取时间、
加水量、提取次数三因素进行考察，以总多糖和总
皂苷得率作为评价指标，优选红芪水提工艺，因素
水平见表 1，试验方案及结果见表 2。
表 1 均匀设计因素水平
Tab. 1 Factors and levels of uniform design
因素 水平
提取时间 x1 /h 1. 5 2. 0 2. 5 3. 0 3. 5 4. 0
加水量 x2 /倍 14 16 18 20 22 24
提取次数 x3 /次 1 2 3 / / /
表 2 试验方案及结果
Tab. 2 Test scheme and results
编号 x1 x2 x3
总多糖得
率 y1 /‰
总皂苷得
率 y2 /‰
1 1 (1. 5) 2 (16) 3 (2) 2. 98 3. 01
2 2 (2. 0) 4 (20) 6 (1) 3. 17 2. 94
3 3 (2. 5) 6 (24) 2 (3) 3. 76 3. 29
4 4 (3. 0) 1 (14) 5 (1) 2. 97 2. 72
5 5 (3. 5) 3 (18) 1 (3) 4. 14 3. 13
6 6 (4. 0) 5 (22) 4 (2) 4. 09 3. 34
采用 spss 17. 0 软件进行线性回归，得总多糖
得率回归方程 y1 = 1. 840 + 0. 355x1 + 0. 350x3 (F =
10. 703，P ＜ 0. 05)及总皂苷得率回归方程 y2 =
2. 091 + 0. 052x2 (F = 9. 752，P ＜ 0. 05) ，由回归
方程可知，提取时间、提取次数对总多糖得率有显
著影响，加水量对总皂苷得率有显著影响，故确定
最优水提工艺为:总加水量 24 倍，共提取 3 次，
每次 80 min。
2. 4 单因素试验 在最优水提工艺的基础上，分
别考察纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶在用量为 0、
50、100、200、400 mg，酶解 2 h 条件下对红芪总
多糖与总皂苷得率的影响，结果见图 1。
图 1 酶用量对总多糖与总皂苷得率的影响
Fig. 1 Effect of enzyme dosage on extraction
ratio of total polysaccharide and sapo-
nin
由图 1 可知，3 种不同酶随着酶用量的增加，
红芪皂苷得率均没有明显提高，说明在现有的水提
条件下单一酶解对皂苷得率贡献不大。随着纤维素
酶用量的增加，红芪多糖得率增大，当酶用量大于
100 mg时，继续增加酶用量，多糖得率没有明显提
高，说明在该用量下酶浓度已趋于饱和，继续增加
酶用量对多糖得率没有显著影响。果胶酶与木聚糖
酶用量分别为 200 mg 时，多糖得率均达到最高，
继续增加酶用量，得率反而下降。
2. 5 二次通用旋转组合设计优化试验
2. 5. 1 数学模型的建立与显著性检验 根据单因
素试验结果，确定由此三种酶组成的复合酶的最佳
配比及酶用量的零水平，选取复合酶的酶用量
(x1)、酶解时间 (x2)、加水量 (x3)和提取时间
(x4)4 个因素，以总多糖得率 (y1)和总皂苷得
率 (y2)为指标，采用四元 (1 /2 实施)二次通用
旋转组合设计优化红芪酶解提取工艺，试验因素及
水平编码见表 3，试验设计方案及结果见表 4，4
个因素对总多糖、总皂苷得率相互作用所得结果见
表 5 ～ 6。
表 3 四元二次通用旋转组合设计因素水平
Tab. 3 Factors and levels of quadratic general rotary unit-
ized design
编码
酶用量
x1 /mg
酶解时间
x2 /min
加水量
x3 /倍
提取时间
x4 /min
1. 682 418 140 26 250
1 350 120 24 210
0 250 90 21 150
－ 1 150 60 18 90
－ 1. 682 82 40 16 50
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表 4 四元二次通用旋转组合设计方案及结果
Tab. 4 Test scheme and results in quadratic general rotary
unitized design
试验
号
x1 x2 x3 x4 y1 /‰ y2 /‰
1 － 1 － 1 － 1 － 1 6. 79 3. 34
2 － 1 － 1 1 1 7. 21 3. 87
3 － 1 1 － 1 1 7. 26 3. 58
4 － 1 1 1 － 1 6. 58 3. 59
5 1 － 1 － 1 1 6. 09 3. 64
6 1 － 1 1 － 1 9. 38 4. 06
7 1 1 － 1 － 1 7. 96 3. 96
8 1 1 1 1 7. 10 4. 24
9 － 1. 682 0 0 0 7. 39 3. 99
10 1. 682 0 0 0 7. 22 4. 20
11 0 － 1. 682 0 0 6. 24 3. 58
12 0 1. 682 0 0 6. 37 3. 63
13 0 0 － 1. 682 0 5. 60 3. 57
14 0 0 1. 682 0 4. 76 3. 74
15 0 0 0 － 1. 682 5. 16 3. 40
16 0 0 0 1. 682 7. 95 3. 82
17 0 0 0 0 6. 69 3. 70
18 0 0 0 0 6. 71 3. 77
19 0 0 0 0 6. 23 3. 60
20 0 0 0 0 6. 16 3. 96
表 5 总多糖得率方差分析
Tab. 5 Variance analysis of extraction ratio of total poly-
saccharide
变异来源 平方和 自由度 均方 偏相关 F P
x1 0. 396 9 1 0. 397 2 － 0. 382 4 0. 875 7 0. 365 2
x2 0. 027 4 1 0. 027 4 0. 109 6 0. 060 9 0. 810 1
x3 0. 581 7 1 0. 582 7 － 0. 453 2 1. 281 5 0. 288 0
x4 2. 737 1 1 2. 756 8 0. 743 1 6. 052 2 0. 039 2
x12 2. 635 5 1 2. 656 8 0. 743 8 5. 850 3 0. 043 6
x22 0. 319 3 1 0. 319 3 0. 352 8 0. 705 4 0. 429 3
x32 0. 378 7 1 0. 380 8 － 0. 377 2 0. 841 4 0. 381 3
x42 0. 683 8 1 0. 684 2 0. 479 5 1. 512 2 0. 253 5
x1x2 0. 005 1 1 0. 005 1 － 0. 047 1 0. 011 1 0. 919 5
x1x3 0. 553 4 1 0. 553 4 0. 435 1 1. 216 7 0. 289 0
x1x4 2. 187 7 1 2. 194 0 － 0. 709 0 4. 848 6 0. 062 9
x2x3与前面因子 x1x4线性相关
x2x4与前面因子 x1x3线性相关
x3x4与前面因子 x1x2线性相关
回归 16. 672 2 11 1. 518 7 F2 = 3. 355 25 0. 033 2
剩余 3. 635 6 8 0. 454 5
失拟 3. 417 7 5 0. 677 1 F1 = 7. 844 74 0. 006 1
误差 0. 258 6 3 0. 085 5
总和 20. 183 9 19
表 6 总皂苷得率方差分析
Tab. 6 Variance analysis of extraction ratio of total sapo-
nin
变异
来源
离差
平方和
自由
度
均方 偏相关 F P
x1 0. 062 4 1 0. 062 7 － 0. 397 2 0. 926 4 0. 368 5
x2 0. 006 2 1 0. 006 3 － 0. 132 5 0. 091 7 0. 742 1
x3 0. 041 9 1 0. 042 0 － 0. 333 6 0. 619 7 0. 459 6
x4 0. 004 9 1 0. 004 8 0. 118 5 0. 071 2 0. 794 4
x12 0. 158 7 1 0. 157 8 0. 576 2 2. 319 3 0. 176 7
x22 0. 015 4 1 0. 015 4 － 0. 205 3 0. 226 8 0. 627 2
x32 0. 005 4 1 0. 005 4 － 0. 127 9 0. 080 2 0. 817 6
x42 0. 014 5 1 0. 014 5 － 0. 203 9 0. 214 4 0. 664 2
x1x2 0. 022 7 1 0. 022 7 0. 250 1 0. 336 6 0. 575 6
x1x3 0. 002 0 1 0. 002 0 0. 075 2 0. 028 9 0. 852 3
x1x4 0. 033 6 1 0. 033 7 － 0. 299 0 0. 496 4 0. 492 3
x2x3与前面因子 x1x4线性相关
x2x4与前面因子 x1x3线性相关
x3x4与前面因子 x1x2线性相关
回归 0. 622 7 11 0. 056 6 F2 = 0. 8273 9 0. 601 8
剩余 0. 541 7 8 0. 067 7
失拟 0. 489 2 5 0. 097 9 F1 = 4. 097 20 0. 039 6
误差 0. 067 8 3 0. 022 5
总和 1. 201 7 19
根据试验结果计算出拟合方程的各项系数，从
而得到总多糖得率的回归方程 y1 = 6. 195 61 －
0. 217 71x1 + 0. 056 84x2 － 0. 261 51x3 + 0. 567 45x4 +
0. 542 24 x21 + 0. 188 87 x
2
2 － 0. 207 64 x
2
3 +
0. 277 43x24 － 0. 031 75 x1x2 + 0. 336 25 x1x3 －
0. 654 25x1x4
总皂苷得率的回归方程 y2 = 3. 744 99 －
0. 085 44x1 －0. 027 53x2 － 0. 069 86x3 + 0. 023 90x4 +
0. 131 30x21 － 0. 041 94x
2
2 － 0. 024 27x
2
3 － 0. 040 18x
2
4 +
0. 067 50x1x2 +0. 020 00x1x3 －0. 082 50 x1x4
由表 5 结果可知，总多糖得率回归方程的失拟
性检验 F1 = 7. 844 74 ＜ F0. 05 (5，3) = 9. 01 不显
著，从而说明未知因素对实验结果干扰很小;显著
性检验 F2 = 3. 355 25 ＞ F0. 05 (11，8) = 3. 31，说
明得到的回归方程显著。单因素中，仅提取时间
x4 达到了显著水平，其他几个因素的分析均不显
著，剔除 α = 0. 10 的不显著项后得回归方程 y1 =
6. 195 61 + 0. 567 45x4 + 0. 542 24x
2
1 － 0. 654 25x1x4。
由表 6 结果可知，总皂苷得率回归方程的失拟
性检验 F1 = 4. 097 20 ＜ F0. 05 (5，3) = 9. 01 不显
著，从而说明未知因素对实验结果干扰很小;显著
性检验 F2 = 0. 827 39 ＜ F0. 05 (11，8) = 3. 31，说
明得到的回归方程不显著。单因素中，4 个因素的
分析均不显著，剔除 α = 0. 10 的不显著项后得回
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归方程 y2 = 3. 744 99。由于在满足多糖提取条件的
各因素水平下皂苷早已提取完全，因此各因素及回
归方程均无显著性。
2. 5. 2 总多糖得率的单因素效应分析 根据试
验结果对单因素进行效应分析，结果见表 7
及图 2。
表 7 总多糖得率的单因素效应分析
Tab. 7 Analysis of the one-factor effect on extraction ratio
of total polysaccharide
水平 x1 x2 x3 x4
－ 1. 682 0 7. 868 5 6. 314 4 6. 297 3 5. 370 3
－ 1. 341 0 7. 083 9 6. 122 5 6. 132 6 5. 356 1
－ 1. 000 0 6. 602 1 6. 082 0 6. 078 6 5. 509 4
－ 0. 500 0 6. 308 9 6. 141 9 6. 139 7 5. 890 1
0. 000 0 6. 194 2 6. 183 4 6. 143 8 6. 199 7
0. 500 0 6. 354 3 6. 216 2 6. 204 6 6. 504 8
1. 000 0 6. 845 1 6. 291 8 6. 241 9 6. 805 2
1. 341 0 7. 186 3 6. 179 3 6. 227 9 6. 998 5
1. 682 0 7. 601 2 6. 150 8 6. 101 7 7. 099 4
图 2 单因素效应分析图
Fig. 2 Effect analysis of single factor
由表 7 和图 2 可知，提取时间的变化对多糖得
率影响最大，随着提取时间的增加，多糖的得率也
逐渐增加。其次是酶用量，酶解时间和加水量对多
糖得率的影响最小。
2. 5. 3 总多糖得率的交互作用效应分析 由表 5
方差分析结果可知，存在交互作用且达到显著水平
的有 x1x4，因此仅对此组交互作用的因素作效应分
析。选取二个因素的零水平，考察另两个因素的交
互作用，分别作图可以直观地分析各因子间的交互
作用效应，结果见图 3。
图 3 酶用量 (x1)与提取时间 (x4)的交互作用图
Fig. 3 Interplay of enzyme dosage (x1)and extrac-
tion time (x4)
图 3 为酶用量 (x1)与提取时间 (x4)的交互
作用图，由图可以看出，当 x1 处于低编码值 x4 处
于高编码值时，二者交互作用显著，多糖得率 y1
值处于较高水平，即低的酶用量和高的提取时间对
总多糖得率是正效应;随着 x1 编码值的增加与 x4
编码值的降低，y1 值先下降后又有上升趋势并处
于较低的水平，呈鞍型曲面，即高的酶用量和低的
提取时间对总多糖的得率也有协同作用。
2. 5. 4 提取工艺的优化与验证 由结果分析可知，
在实验中不但存在着单因素效应，而且还有因素间
的交互作用，因此很难从单因素效应和交互作用的
结果分析中找到最佳提取条件，且四元二次回归的
数学模型不存在提取率函数的极大值。本实验采用
频率分析法分析回归模型以找到最佳提取条件，结
果见表 8。
表 8 各变量取值的频率分布
Tab. 8 Probability distribution of variables
水平
x1 x2 x3 x4
次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率
－ 1. 682 0 75 0. 214 1 69 0. 200 0 70 0. 199 9 50 0. 142 3
－ 1. 000 0 50 0. 143 7 70 0. 200 9 70 0. 201 0 50 0. 143 3
0. 000 0 49 0. 139 0 68 0. 194 7 69 0. 195 8 49 0. 139 8
1. 000 0 51 0. 146 3 71 0. 204 8 72 0. 204 5 102 0. 292 4
1. 682 0 124 0. 354 6 70 0. 198 6 70 0. 198 6 99 0. 283 7
加权均数 0. 240 9 0. 000 0 0. 000 0 0. 380 3
标准误 0. 072 8 0. 066 5 0. 066 4 0. 064 4
95%置信区间 0. 098 ～ 0. 383 － 0. 130 ～ 0. 130 － 0. 130 ～ 0. 130 0. 255 ～ 0. 511
提取条件 259. 8 ～ 288. 3 56. 1 ～ 93. 9 20. 6 ～ 21. 4 165. 3 ～ 180. 7
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由表 8 可知，在 95%的置信区间总多糖得率
大于 6. 74‰各变量的取值区间分别为 0. 098 ～
0. 383、 － 0. 130 ～ 0. 130、 － 0. 130 ～ 0. 130、
0. 255 ～ 0. 511，即酶用量为 259. 8 ～ 288. 3 mg、酶
解时间为 56. 1 ～ 93. 9 min、加水量为 20. 6 ～ 21. 4
倍、提取时间为 165. 3 ～ 180. 7 min。考虑到实际操
作性，将最优提取条件定为:酶用量 280 mg、酶
解时间 90 min、加水量 21 倍、提取时间 180 min。
按此工艺条件进行验证实验，重复 3 次，结果取平
均值，实际测得多糖得率为 9. 58‰，与理论预测
值 9. 65‰接近，进一步验证了数学回归模型合理。
3 讨论
3. 1 本实验对多因素多水平的红芪酶解提取工艺
进行考察时，由于正交试验需要较多的试验次数且
因素对指标的影响有多大不能控制，而均匀设计虽
试验次数较少，但精度不能保证。二次通用旋转组
合设计试验次数少，计算简便，又具有旋转性，能
使回归预测值的方差成为在以球心为原点的球内的
一个常数，克服了二次回归的预测值的方差强烈地
依赖于实验点在因子空间中的位置这个缺点，减少
了误差的干扰［14］。因此，二次通用旋转组合设计
因一致精度和较少的试验次数等优点而有利于得到
较优的提取工艺条件。
3. 2 酶解提取过程中酶用量、酶解时间、酶解温
度、溶剂 pH值、溶剂用量、提取时间等参数都会
影响活性成分的提取，选择不当则会严重影响酶解
工艺确立。由于 3 种生物酶的最适温度均为 50 ℃，
最适 pH均与红芪水提液的 pH 较接近，因此不再
对其进行考察。由于二次通用旋转组合设计能容纳
的因素数有限，本实验先对红芪水提工艺进行优
化，筛选出有显著性的影响因素，在此基础上进行
工艺优化更简便有效。
3. 3 本实验未建立起红芪总皂苷酶解提取数学模
型，主要是因为皂苷分子量较多糖为小，提取时扩
散传质阻力较小，加上红芪皂苷在水中溶解度较
大，在本实验所设定的影响多糖提取的各因素不同
取值条件下皂苷可能均已提取完全，造成提取率无
显著差别，实验结果提示在酶解提取多糖和皂苷
时，当多糖提取条件达到最佳时皂苷的提取条件也
会处于最优状态。
3. 4 随着纤维素酶用量的增加，红芪多糖得率增
大，当酶用量大于 100mg 时，继续增加酶用量，
多糖得率没有明显提高，说明在该用量下酶浓度已
趋于饱和，继续增加酶用量对多糖得率没有显著影
响。果胶酶与木聚糖酶用量分别为 200mg 时，多
糖得率均达到最高，继续增加酶用量，得率反而下
降，其机理有待进一步研究。
3. 5 由图 3 可以看出，当 x1 处于低编码值 x4 处于
高编码值时，二者交互作用显著，多糖得率 y1 值
处于较高水平，即低的酶用量和高的提取时间对总
多糖得率是正效应;随着 x1 编码值的增加与 x4 编
码值的降低，y1 值先下降后又有上升趋势并处于
较低的水平，呈鞍型曲面，即高的酶用量和低的提
取时间对总多糖的得率也有协同作用。但考虑到多
糖得率及因酶所致的成本问题，本实验选择低的酶
用量和高的提取时间。
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2014 年 2 月
第 36 卷 第 2 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
February 2014
Vol． 36 No． 2