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二次通用旋转组合设计优化红芪中芒柄花素和总皂苷的酶解提取工艺
王继龙， 陈方圆， 魏舒畅* ， 高建德， 范凌云， 余 琰
(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)
收稿日期:2014-10-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (81060345)
作者简介:王继龙 (1986—) ，男，硕士，从事中药制剂新剂型与新技术研究。Tel:18215123103，E-mail:drake1520@ 163． com
* 通信作者:魏舒畅 (1969—) ，男，教授，从事中药制剂新剂型与新技术研究。Tel:13893467387，E-mail:wshch006@ sina． com
摘要:目的 优化红芪中芒柄花素和总皂苷的酶解提取工艺。方法 选择复合酶用量、酶解时间、加水量和提取时间
为试验因素，以芒柄花素及总皂苷提取量为指标，采用二次通用旋转组合设计优化红芪酶解提取工艺。结果 提取芒
柄花素的最佳工艺条件为复合酶用量 340 mg，酶解时间 110 min，加水量 22 倍，提取 150 min;提取总皂苷的最佳工
艺条件为复合酶用量 280 mg，酶解时间 90 min，加水量 22 倍，提取 190 min。结论 在上述优化条件下，两者提取量
分别为 69. 99 μg /g和 1. 68 mg /g。
关键词:红芪;芒柄花素;总皂苷;酶解;二次通用旋转组合设计
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)09-1926-06
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 09. 012
Optimizing enzymatic extraction of formononetin and total saponin from Hedysa-
ri Ｒadix by quadratic general rotary unitized design
WANG Ji-long， CHEN Fang-yuan， WEI Shu-chang* ， GAO Jian-de， FAN Ling-yun， YU Yan
(Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)
ABSTＲACT:AIM To optimize the enzymatic extraction of formononetin and total saponin from Hedysari Ｒadix．
METHODS Complex enzyme concentration，enzymolysis time，water addition and extraction time were consid-
ered to be the influential experiment factors，the amounts of extracted formononetin and total saponin were taken in-
to account as the evaluation indices，and the quadratic general rotary unitized design was applied to the enzymatic
extraction process optimization． ＲESULTS The optimum conditions for formononetin were 340 mg enzyme con-
centration，110 min enzymolysis time，22 times of water addition and 150 min extraction time，while the best con-
ditions for total saponin were 280 mg enzyme concentration，90 min enzymolysis time，22 times of water addition
and 190 min extraction time． CONCLUSION In the aforementioned optimum conditions，the extraction volumes
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of formononetin and total saponin were 69. 99 μg /g and 1. 68 mg /g，respectively．
KEY WOＲDS: Hedysari Ｒadix; formononetin; total saponin; enzymolysis; quadratic general rotary
unitized design
酶解法提取中药材时，可在温和条件下通过破
坏细胞结构，从而减小成分扩散时的传质阻力，不
但有效成分提取率高，提取时间短，而且能保持天
然产物的立体构型和生物活性［1-3］。红芪为豆科植
物多序岩黄芪 Hedysarum polybotrys Hand． -Mazz 的
干燥根［4］，具有补气养血、消肿排脓、固表止汗
等功效，由于该植物属于纤维性根茎药材，富含纤
维素、半纤维素、果胶等易造成传质阻力的物质，
故适合复合酶酶解法提取，但目前相关的研究报道
较少。由于二次通用旋转组合设计具有旋转性，可
克服均匀设计、正交设计、回归正交设计等方法的
不足［5-7］，因此本实验采用该方法对红芪中芒柄花
素和总皂苷的复合酶提取工艺条件进行优化，期冀
为红芪等纤维性根茎类药材中黄酮及皂苷类成分的
提取制备提供参考。
1 仪器与材料
Waters 600E-2487 HPLC 色谱仪，包括在线脱
气机、四元泵、自动进样器、紫外检测器 (美国
Waters 公司) ;ABT100-5M 分析天平 (德国 Kern
公司) ;UV Blue Star B 紫外-可见分光光度计 (北
京莱伯泰科仪器有限公司)。
芒柄花素对照品 (纯度≥98%，批号 111703-
200602，中国食品药品检定研究院) ;果胶酶、纤维
素酶、木聚糖酶 (比活力分别为 1. 5 × 105、1. 4 ×
106、1. 0 × 107 u /g，甘肃华羚生物科技有限公司)。
红芪药材购自甘肃省武都区，经甘肃中医药大学药
学院魏舒畅教授鉴定为多序岩黄芪 Hedysarum poly-
botrys Hand． -Mazz的干燥根。甲醇为色谱纯 (德国
Merck公司) ;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 芒柄花素的测定
2. 1. 1 色谱条件 Agilent ZOＲBAX SB-C18色谱柱
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ;流动相为甲醇-0. 2%
乙酸 (60 ∶ 40) ;检测波长 255 nm;体积流量
1. 0 mL /min;柱温 31 ℃;进样量 20 μL，结果见
图 1。
1． 芒柄花素
1． formononetin
图 1 对照品和供试品的 HPLC图谱
Fig. 1 HPLC chromatograms of reference substances and samples
2. 1. 2 供试品溶液的制备 取红芪药材 100 g，加
入 4 倍量水和适量酶后混匀，50 ℃下酶解一定时
间后加热灭活 10 min，补水并回流提取 3 次，过
滤，浓缩 (每 1 mL浓缩液相当于 0. 25 g原药材)。
然后，精密吸取浓缩液 10 mL，乙酸乙酯萃取 3
次，每次 20 mL，合并萃取液，水浴挥干，残渣加
甲醇溶解，定容于 10 mL量瓶中，摇匀后过滤，取
续滤液，即得供试品溶液。
2. 1. 3 对照品溶液的制备 精密称取芒柄花素对
照品 1. 01 mg，置于 25 mL量瓶中，甲醇溶解，定
容至刻度。然后，精密吸取溶液适量，加不同体积
甲醇稀释，即得一系列质量浓度的对照品溶液。
2. 1. 4 线性关系的考察 取 “2. 1. 3”项下方法
制得的对照品溶液适量，按 “2. 1. 1”项下色谱条
件测定，以峰面积 (y)对质量浓度 (x，μg /mL)
进行线性回归，结果得到回归方程 y =1. 27 ×105 x +
1. 80 ×104，r =0. 999 9，表明芒柄花素在 0. 020 2 ～
0. 323 2 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
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2. 1. 5 精密度试验 取 “2. 1. 3”项下方法制得
的对照品溶液适量，按 “2. 1. 1”项下色谱条件重
复进样 6 次，测定 ＲSD 值。结果，芒柄花素峰面
积的 ＲSD为 0. 96%，表明仪器精密度良好。
2. 1. 6 稳定性试验 取 “2. 1. 2”项下方法制得
的供试品溶液适量，按 “2. 1. 1”项下色谱条件，
分别于 0、6、12、24、48 h 进样测定 ＲSD 值。结
果，芒柄花素峰面积的 ＲSD 为 1. 62%，表明供试
品溶液在 48 h内稳定性良好。
2. 1. 7 重复性试验 精密量取红芪浓缩液适量，
按“2. 1. 2”项下方法平行制备供试品溶液 6 份，
按“2. 1. 1”项下色谱条件分别进样测定 ＲSD 值。
结果，芒柄花素峰面积的 ＲSD 为 1. 32%，表明该
方法重复性良好。
2. 1. 8 加样回收率试验 精密量取红芪浓缩液 9
份，每份 5 mL，再分别精密加入芒柄花素对照品
适量，加水至 10 mL，按 “2. 1. 2”项下方法制备
高、中、低 3 个质量浓度的加样回收样品溶液，每
个浓度平行制备 3 份，分别按 “2. 1. 1”项下色谱
条件进样测定 ＲSD 值。结果，芒柄花素的平均回
收率为 99. 45%，ＲSD 为 1. 52%，表明回收率
良好。
2. 2 总皂苷的测定 精密量取 “2. 1. 2”项下制
得的浓缩液 10 mL，水饱和正丁醇萃取 4 次，每次
分别为 15、15、10、10 mL，合并萃取液，氨试液
反萃 2 次，每次 5 mL，弃去氨水层，水浴挥干，
残渣加甲醇溶解，定容于 25 mL量瓶中。然后，采
用差示比色法［8］，并按回归方程 ΔA = 2. 637 4 m －
0. 000 8 (r = 0. 999 3)计算总皂苷含有量。
2. 3 复合酶比例的确定 根据文献 ［9］研究报
道，固定“2. 1. 2”项下部分酶解提取条件 (酶解
2 h，回流提取 3 次，每次 80 min，总水量 24 倍) ，
应用单因素试验分别考察果胶酶、木聚糖酶和纤维
素酶的用量 (0、50、100、200、400 mg)对芒柄
花素和总皂苷提取量的影响。结果表明，两者的提
取量随着酶用量增加，均呈现先升高后下降的趋
势。当果胶酶与木聚糖酶用量均为 200 mg、纤维
素酶为 100 mg 时，提取量均达到最高，但随着酶
用量继续增加，提取量均反而下降。因此，本实验
确定复合酶的组成质量比为果胶酶 ∶ 木聚糖酶 ∶ 纤
维素酶 = 2 ∶ 2 ∶ 1。
2. 4 二次通用旋转组合设计优化试验［10-15］
2. 4. 1 数学模型的建立与显著性检验 以复合酶
用量 (x1)、酶解时间 (x2)、加水量 (x3)和提
取时间 (x4)为试验因素，采用四元 (1 /2 实施)
二次通用旋转组合设计，优化红芪中芒柄花素与总
皂苷的酶解提取工艺，试验设计及结果见表 1，方
差分析见表 2。
表 1 二次通用旋转组合试验设计及结果
Tab. 1 Design and result of quadratic general rotary unitized tests
试验号
复合酶用量
(x1)/mg
酶解时间
(x2)/min
加水量
(x3)/倍
提取时间
(x4)/min
芒柄花素提取量
(y1)/(μg·g － 1)
总皂苷提取量
(y2)/(mg·g － 1)
1 150 (－ 1) 60 (－ 1) 15 (－ 1) 90 (－ 1) 39. 51 1. 45
2 150 (－ 1) 60 (－ 1) 21 (1) 210(1) 54. 78 1. 72
3 150 (－ 1) 120(1) 15 (－ 1) 210(1) 38. 45 1. 59
4 150 (－ 1) 120(1) 21 (1) 90 (－ 1) 53. 13 1. 57
5 350(1) 60 (－ 1) 15 (－ 1) 210(1) 48. 65 1. 62
6 350(1) 60 (－ 1) 21 (1) 90 (－ 1) 57. 85 1. 67
7 350(1) 120(1) 15 (－ 1) 90 (－ 1) 61. 03 1. 50
8 350(1) 120(1) 21 (1) 210(1) 62. 66 1. 69
9 82 (－ 1. 682) 90(0) 18 (0) 150(0) 46. 82 1. 60
10 418(1. 682) 90(0) 18 (0) 150(0) 66. 32 1. 70
11 250(0) 40 (－ 1. 682) 18 (0) 150(0) 50. 98 1. 58
12 250(0) 140(1. 682) 18 (0) 150(0) 62. 93 1. 63
13 250(0) 90(0) 13 (－ 1. 682) 150(0) 42. 48 1. 56
14 250(0) 90(0) 23 (1. 682) 150(0) 61. 99 1. 65
15 250(0) 90(0) 18 (0) 50 (－ 1. 682) 60. 04 1. 51
16 250(0) 90(0) 18 (0) 250(1. 682) 62. 15 1. 71
17 250(0) 90(0) 18 (0) 150(0) 65. 01 1. 65
18 250(0) 90(0) 18 (0) 150(0) 66. 49 1. 68
19 250(0) 90(0) 18 (0) 150(0) 65. 65 1. 64
20 250(0) 90(0) 18 (0) 150(0) 66. 72 1. 66
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表 2 y1 与 y2 方差分析
Tab. 2 Variance analysis of y1 and y2
变异来源
芒柄花素提取量 (y1) 总皂苷提取量 (y2)
平方和 自由度 均方 偏相关 F值 P值 平方和 自由度 均方 偏相关 F值 P值
x1 273. 555 5 1 273. 465 8 0. 981 4 94. 528 7 0. 000 1 0. 004 5 1 0. 004 5 0. 678 2 4. 504 7 0. 062 4
x2 53. 289 9 1 53. 269 3 0. 863 3 18. 516 0 0. 002 4 0. 000 0 1 0. 000 0 － 0. 076 3 0. 029 9 0. 849 5
x3 248. 597 4 1 248. 143 5 0. 978 8 86. 068 8 0. 000 1 0. 018 8 1 0. 018 7 0. 888 2 18. 768 8 0. 002 5
x4 0. 538 6 1 0. 538 4 － 0. 189 5 0. 187 4 0. 682 1 0. 026 7 1 0. 026 8 0. 906 7 26. 650 2 0. 000 8
x21 113. 841 0 1 113. 667 9 － 0. 965 3 39. 158 4 0. 000 3 0. 000 1 1 0. 000 1 － 0. 107 8 0. 058 4 0. 810 3
x22 103. 662 4 1 103. 998 7 － 0. 941 2 36. 084 3 0. 000 3 0. 003 1 1 0. 003 1 － 0. 622 7 3. 068 4 0. 121 3
x23 227. 785 2 1 227. 171 3 － 0. 961 9 79. 025 2 0. 000 1 0. 003 0 1 0. 003 0 － 0. 611 5 2. 995 5 0. 118 5
x24 32. 536 1 1 32. 635 2 － 0. 816 9 11. 226 8 0. 009 3 0. 002 5 1 0. 002 5 － 0. 579 7 2. 517 0 0. 156 1
x1 x2 30. 721 7 1 30. 721 7 0. 820 2 10. 659 7 0. 011 2 0. 000 6 1 0. 000 6 － 0. 337 6 0. 631 5 0. 450 5
x1 x3 29. 045 8 1 29. 124 4 － 0. 833 1 10. 122 0 0. 013 8 0. 000 0 1 0. 000 0 － 0. 039 0 0. 007 7 0. 921 8
x1 x4 5. 196 3 1 5. 177 9 － 0. 511 8 1. 803 3 0. 215 4 0. 001 7 1 0. 001 7 － 0. 492 0 1. 683 3 0. 215 9
回归 1 631. 739 6 11 148. 637 2 F2 = 51. 114 7 0. 000 1 0. 095 9 11 0. 008 7 F2 = 8. 661 9 0. 000 9
剩余 23. 234 9 8 2. 887 0 0. 008 0 8 0. 001 0
失拟 21. 769 3 5 4. 331 2 F1 = 6. 850 1 0. 009 3 0. 007 1 5 0. 001 4 F1 = 4. 912 2 0. 023 6
误差 1. 881 4 3 0. 624 3 0. 000 9 3 0. 000 3
总和 1 641. 879 2 19 0. 103 3 19
注:x2 x3、x2 x4、x3 x4 分别与之前的因子 x1 x4、x1 x3、x1 x2 线性相关
根据试验结果，计算出回归系数，进而得到 y1
和 y2 的回归方程，分别为 y1 =66. 183 9 +5. 646 6x1 +
2. 531 9x2 + 5. 388 6x3 － 0. 251 3x4 － 3. 529 6x
2
1 －
3. 393 5x22 － 5. 062 3x
2
3 － 1. 929 8x
2
4 + 2. 487 5x1x2 －
2. 390 0x1x3 －1. 020 0x1x4;y2 = 1. 657 4 + 0. 023 3x1 －
0. 001 9x2 + 0. 047 0x3 + 0. 056 1x4 － 0. 002 6x
2
1 －
0. 018 5x22 － 0. 018 5x
2
3 － 0. 016 7x
2
4 － 0. 011 3x1x2 －
0. 001 3x1x3 － 0. 018 8x1x4。
由表 2 可知，y1 回归方程的失拟性检验 F1 =
6. 850 1，F0 . 05 (5，3) = 9. 01，F1 ＜ F0. 05不显著，
表明本试验无其他因素的显著影响;显著性检验
F2 = 51. 114 7，F0 . 01 (11，8) = 5. 74，F2 ＞ F0. 01
极显著，表明所建模型的预测值与测试值很吻合。
另外在单因素中，仅 x4 不显著，剔除 α = 0. 10 的不
显著项后，得到简化后的回归方程 y1 = 66. 183 9 +
5. 646 6x1 + 2. 531 9x2 + 5. 388 6x3 － 3. 529 6x
2
1 －
3. 393 5x22 － 5. 062 3x
2
3 － 1. 929 8x
2
4 + 2. 487 5x1x2 －
2. 390 0x1x3。
y2 回归方程的失拟性检验 F1 = 4. 912 2，F0 . 05
(5，3) = 9. 01，F1 ＜ F0. 05，不显著，表明本试验
无其他因素的显著影响;显著性检验 F2 = 8. 661 9，
F0 . 01 (11，8) = 5. 74，F2 ＞ F0. 01，极显著，表明
所建模型的预测值与测试值很吻合。另外在单因素
中，仅 x2 不显著，剔除 α = 0. 10 的不显著项后，
得到简化后的回归方程y2 = 1. 657 4 + 0. 023 3x1 +
0. 047 0x3 + 0. 056 1x4。
2. 4. 2 单因素效应分析 采用降维分析方法，对
各因素进行单因素效应影响分析，结果见图 2。
图 2 各单因素与芒柄花素和总皂苷提取量的关系
Fig. 2 Ｒelationships of each single factor and the extraction volumes of formononetin and total saponin
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由图 2A 可以看出，y1 随着各因素取值增加，
均呈先升高后降低的趋势，其中 x1 对 y1 影响最
大，其次是 x3，而 x4 影响最小;由图 2B 可以看
出，y2 随着各因素取值增加，均呈升高趋势，其
中 x4 对 y2 影响最大，其次是 x3，而 x2 影响最小。
2. 4. 3 y1 的交互作用效应分析 由表 2 可知，回
归方程中 x1 与 x2 和 x1 与 x3 的互作效应对 y1 有显
著影响，因此需对这二组交互作用的因素作效应分
析。将两个因素固定在零水平，通过作图即可直观
地分析另两个因素间的互作效应，结果见图 3。由
图 3A可以看出，x2 相同时，增加 x1 即可提高 y1;
但 x2 不同时，其变化趋势也不同，其中 x2 较短
时，尽管随着 x1 增加也可提高 y1，但程度不明显，
而延长 x2 时，y1 随着 x1 变化有较为明显的提高。
以上结果表明，选择适宜的 x1 和 x2 可使 y1 有较大
提高;由图 3B 可以看出，x1 相同时，y1 随着 x3
变化呈先升高后降低的趋势;当 x3 一定时，x1 对
y1 也有同样作用趋势。
图 3 x1 与 x2 和 x1 与 x3 的交互作用效应
Fig. 3 Interaction effect of x1 with x2 and x1 with x3
2. 4. 4 提取工艺的优化与验证 由于试验中不仅
存在单因素效应，还有因素间的互作效应，难以从
单因素与互作效应的分析中得到最佳工艺组合，同
时四元二次回归模型不存在提取量函数的极值。因
此，本实验采用频数分析法，分别分析各回归模型
以寻找最优提取工艺，结果见表 3，可知在 95%置
信区间内， y1 大于 56. 68 μg /g， y2 大于 1. 62
mg /g。鉴于提取量和实际操作性，确定芒柄花素
的最佳提取条件为复合酶用量 340 mg，酶解时间
110 min，加水量 22 倍，提取时间 150 min;总皂
苷的最佳提取条件为复合酶用量 280 mg，酶解时
间 90 min，加水量 22 倍，提取时间 190 min。
按照上述提取工艺方法，对优化所得的工艺进
行验证，共 5 批，按 “2. 1”和 “2. 2”项下方法
分别进行检测。结果，芒柄花素和总皂苷的平均提
取量分别为 69. 99 μg /g和 1. 68 mg /g，ＲSD分别为
1. 20%和 1. 56%，与预测值 (70. 60 μg /g 和 1. 72
mg /g)接近，表明所建立的数学模型具有良好的
预测性。
表 3 芒柄花素与总皂苷各相关变量的频率分布
Tab. 3 Probability distributions of each relative variable of formononetin and total saponin
水平
芒柄花素 总皂苷
x1 /mg x2 /min x3 /倍 x4 /min x1 /mg x2 /min x3 /倍 x4 /min
次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率 次数 频率
－ 1. 682 0 0. 000 0 0 0. 000 0 0 0. 000 0 16 0. 118 3 60 0. 151 8 81 0. 202 4 40 0. 101 7 25 0. 063 3
－ 1. 000 4 0. 030 0 10 0. 075 2 20 0. 150 1 32 0. 240 7 70 0. 176 5 81 0. 202 0 61 0. 150 3 56 0. 138 6
0. 000 39 0. 292 6 45 0. 340 4 51 0. 387 0 37 0. 278 4 79 0. 198 2 79 0. 198 3 79 0. 198 0 79 0. 198 4
1. 000 50 0. 378 2 45 0. 340 1 48 0. 361 6 32 0. 241 8 91 0. 228 7 78 0. 192 9 101 0. 252 5 111 0. 278 3
1. 682 40 0. 305 2 33 0. 251 5 14 0. 106 9 16 0. 121 2 93 0. 233 9 79 0. 195 2 113 0. 281 5 123 0. 306 7
加权均数 0. 858 0 0. 701 5 0. 392 3 0. 000 0 0. 209 4 0. 000 0 0. 434 0 0. 564 9
标准误 0. 063 3 0. 071 9 0. 072 0 0. 093 6 0. 060 7 0. 061 9 0. 058 9 0. 053 3
95%置信区间 0. 734 ～ 0. 982 0. 548 ～ 0. 824 0. 252 ～ 0. 529 － 0. 185 ～ 0. 185 0. 091 ～ 0. 328 － 0. 121 ～ 0. 121 0. 315 ～ 0. 541 0. 465 ～ 0. 676
提取条件 323. 4 ～ 348. 2 106. 4 ～ 114. 7 21. 8 ～ 22. 6 138. 9 ～ 161. 1 259. 1 ～ 282. 8 86. 4 ～ 93. 6 21. 9 ～ 22. 6 177. 9 ～ 190. 6
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第 37 卷 第 9 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
September 2015
Vol． 37 No． 9
3 讨论
皂苷与黄酮是红芪中的两类主要活性成分，鉴
于两者在分子质量大小及水中溶解度方面存在较大
差异，本实验同时以总皂苷和芒柄花素为指标，考
察酶解提取工艺各因素对其提取量的影响，由此所
得到的工艺条件对皂苷及黄酮类物质的提取将有较
高的参考价值。
课题组在前期研究［9］中，并未建立起总皂苷
的酶解提取数学模型，推测可能是由于样品中有能
与香草醛-高氯酸显色、不影响加样回收率并通过
差示法无法消除干扰的物质存在。本实验在样品处
理时，加入氨试液进行反萃，有利于进一步消除干
扰，并提高检测方法的可靠性。应用该方法时，总
皂苷的测定结果虽有所下降，但在试验方案不变的
情况下，建立起了总皂苷的酶解提取数学模型。
二次通用旋转组合设计因其精度一致和试验次
数少等优点，有利于获得理想的提取工艺条件，但
其能容纳的因素数有限。因此，本实验首先利用单
因素试验，确定了果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶的
比例，同时通过前期研究，已确定了回流提取次
数，而且由于各酶的最适 pH 均与红芪水提液的
pH接近，最适酶解温度均为 50 ℃，因此本实验不
再对其进行考察。由此可见，在该基础上进行工艺
优化时，更为简便有效。
在单因素试验中，芒柄花素和总皂苷的提取量
起初均随着酶用量增加而升高，但当提取量达到最
大值时，随着酶用量进一步增加，提取量均反而降
低，其机理有待作进一步研究。
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