全 文 ：广东微量元素科学
2013 年 GUANGDONG WEILIANG YUANSU KEXUE 第 20 卷第 4 期
文章编号:1006-446X (2013)04-0010-08
新疆芍药总多糖提取工艺研究
及其对变异链球菌影响的体外研究
李 贺1 马 琴2 赵 今1
(1． 新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000;
2． 新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000)
摘 要:目的 探讨新疆芍药中总多糖的最佳提取工艺，初步研究新疆赤芍总多糖对变异链球菌
的作用。方法 采用蒽酮比色法，通过水浸提、乙醇沉淀总多糖、Sevage 脱蛋白、干燥等方法，
应用正交试验设计，测定总多糖的含量。应用连续稀释法和琼脂扩散法研究芍药总多糖对变异链
球菌的作用。结果 新疆芍药总多糖最佳提取工艺为料液比 1 ∶ 8、浸提次数为 2 次、浸提时间 1. 5
h，得总多糖含量为 51. 57%;新疆芍药总多糖对变异链球菌的抑制作用:MIC 为 110. 4
mg·mL －1。结论 新疆芍药总多糖对变异链球菌生长具有一定的抑制作用，可作为口腔疾病治疗
的参考中药。
关键词:新疆芍药;总多糖;最佳提取工艺;变异链球菌
中图分类号:Ｒ 284. 2 文献标识码:A
收稿日期:2013 -02 -15
基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号:2013211A063)
作者简介:李贺(1981—) ，女。研究方向:维族传统药物的对龋病抑龋性。
通讯作者:赵今(1968—) ，女，博士。研究方向:维汉高龋儿童及无龋儿童细菌生物膜的菌种、基因型差异。E-mail:
merryljin@ sina. com
Study on Optimization of Extraction and Effects of Polysaccharides
on Streptococcus mutans From Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan．
LI He1，MA Qin2，ZHAO Jin1
(1． The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang Urumqi 830000，China;
2． The Traditional Chinese Medical Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Xinjiang Urumqi 830000，China)
Abstract:Objective To explore the best extraction conditions of polysaccharides from Paeonia
sinjiangensis K. Y. Pan．， preliminary study the effect of polysaccharides on Streptococcus mutans．
Methods The separation procedure of precipitation with alcohol and the purification from the removing
proteins were deeply analyzed． Meanwhile the contents of polysaccharide were determined by Anthrone
colorimetry through an orthogonal experiment (L9(3
4) )． Determined antibacterial activities of
polysaccharides from Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan． by serial dilution method and agar diffusion method
(modified Kirby － Bauer method)． Ｒesults The highest yield was obtained when ratio of solvent to raw
material，extraction times，extraction time were 8 ∶ 1，2，1. 5 h，respectively． The content of soluble
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DOI:10.16755/j.cnki.issn.1006-446x.2013.04.008
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polysaccharide is 51. 57% ． Conclusions The polysaccharides from Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan．
have certain antibacterial activity for Streptococcus mutans growth．
Key words:Paeonia sinjiangensis K Y Pan;polysaccharides;the best extraction conditions;Streptococcus
mutans
新疆芍药(Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan)为牡丹科芍药属植物的干燥纺锤状块根，根入药，
性味苦、微寒，归肝经，具有清热凉血、散淤止痛作用。主要用于治疗温毒发斑，吐血，目赤肿
痛，肝郁胁痛，痛肿疮疡，跌打损伤，经闭痛经等症。产于新疆阿勒泰地区山坡及披针叶林下或
林间灌丛［1］。新疆芍药中含有多糖，单萜类成分，有芍药苷、芍药内芍酯苷、氧化芍药苷，同
时含有苯甲酸、β － 谷甾醇、糖类、蛋白质、淀粉、色素和黏液质等［2］。新疆赤芍中含有多糖类
物质，作为一类具有生物活性的天然化合物，对人体营养和健康有着重要的影响。近年来芍药在
临床上用于治疗多种疾病，有着广阔的应用前景，随着研究的深入，新疆芍药在医学、食品等行
业都具有越来越重要的作用。
新疆芍药同科同属植物 － 川赤芍作为我国传统的活血化淤类中药，有着悠久的用药历史，
现代药理学研究表明其具有广泛的生物活性，例如赤芍能明显降低血小板聚集［3］，通过影响钙
代谢调节 TXA2 /PGL2(6 －酮 －前列腺素 I2)平衡抗动脉粥样硬化，用于治疗冠心病、急性脑血
栓、肺心病［4］;芍药对吞噬细胞的吞噬功能有促进作用［5］。近年来，在新疆芍药药理学研究方
面近些年做了大量工作并取得了一定成果，国内外对新疆芍药(Paeonia sinjiangensis K. Y. Pan)的
研究主要集中在芍药苷的含量测定［6］、部分微量元素的测定［7］、理化性质与紫外光谱研究［8］，
武新华等［9］报道芍药不同溶剂的提取物对供试菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、宋内氏志贺菌和
伤寒杆菌均有一定程度的抑制作用，芍药是具有研究、开发价值的新疆抗菌药材，但抗菌作用有
效成分尚不清楚，还需进一步研究。
变异链球菌是人类最常见感染性疾病之一，龋病的公认主要致龋菌。变异链球菌在牙面黏附
和聚集，并进一步形成复杂的生物膜结构(即通常所说的牙菌斑)是其致龋的前提和基础。目前
新疆芍药成分总多糖的研究甚少，本研究探讨新疆芍药成分总多糖最佳提取工艺，探索新疆芍药
成分总多糖对变异链球菌的生长及形成的影响，为临床利用新疆芍药治疗疾病、开发利用新疆芍
药资源提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料与试剂
新疆芍药(新疆阿勒泰产)、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、蒽酮、硫酸、无水葡萄糖(D －
Glucose anhydrous，国家药品生物制定鉴定所，批号:110833)、结晶紫、蒸馏水等。对照品:氨
苄青霉素(石药集团:中诺药业有限公司，批号:017001050)。
1. 2 实验仪器
AL －204 型电子天平(梅特勒 －托利多仪器有限公司) ，SK 3300 LH型超声波发生器(上海科
导超声仪器有限公司) ，Spectra MAX 190 型生物发光仪(Molecular Devices) ，DNP － 9162 型电热
恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司) ，YXQ － LS － SⅡ型全自动立式电热压力蒸汽灭菌器
(上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ，CO2 恒温培养箱(Forma Direct heat CO2 Incubator － Thermo
Fisher Scientific，USA) ，UV － 2501 PC 型紫外分光光度计，Spectrumlab 22 型可见分光光度计(上
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海棱光技术有限公司) ，TDL － 40 B 型低速大容量离心机，ZD － 85 型气浴恒温振荡器，分液漏
斗等。
1. 3 实验菌种与培养基
变异链球菌 － Streptococcus mutants (ATCC 76100) ，由美国典型物种保藏中心(ATCC)提供。
BHI (Bacto TM Brain Heart Infusion，Fluka，Sigma － Aldrich chemie GmbH，53283)
1. 4 标准曲线的制备［10］
总多糖含量测定采用蒽酮比色法，精密称取葡萄糖约 0. 1 g，置 100 mL 容量瓶中，加蒸馏水
溶解，并稀释至刻度，即得。精密吸取葡萄糖溶 0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 8 mL，分别
置于 10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。将试管置于冷水槽中，精密移取上述溶液各 1 mL，分别加
入 0. 2%硫酸蒽酮溶液 4 mL，摇匀后，在试管口盖上玻璃塞，于沸水液中加热 30 min，取出放入
冰水浴中冷却 15 min，取出于 620 nm 波长处测定吸光度，以吸收度 A 对应浓度 y 回归，得:①
回归方程:y = 33. 77 x + 0. 162 4(r = 0. 999 9) ，绘制标准曲线，如图。② 线性范围:1. 113 ～
18. 88 μg /mL。
图 1 总多糖标准曲线
1. 5 新疆芍药总多糖提取条件的选择
在其他条件相同的情况下，分别研究不同浸提温度(65、75、85、95 ℃) ，提取时间(0. 5、
1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 h)、料液比(1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10、1 ∶ 12)和提取次数(1、2、3) ，以
上单因素对新疆芍药总多糖提取率的影响，见表 1。
表 1 新疆芍药总多糖提取的正交试验因素水平表
水 平
因 素
料液比 /倍数(A) 浸提次数 /次(B) 浸提时间 /h(C)
1 1 ∶ 8 1 1. 5
2 1 ∶ 10 2 2. 0
3 1 ∶ 12 3 2. 5
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1. 6 新疆芍药总多糖提取的正交试验
在单因素试验基础上，选定影响因素并确定因素水平，采用正交表 L9(3
4)作正交试验，以总
多糖提取率作为参考指标，确定新疆芍药总多糖提取的最佳工艺条件。
1. 7 新疆芍药总多糖对变异链球菌的作用
1. 7. 1 样品与菌液制备 取新疆芍药总多糖干粉 0. 552 g，过微孔滤膜后(0. 22 μm) ，用生理盐
水配成质量浓度为 110. 4 mg /mL的原液，并倍比稀释为 6 个浓度梯度，见表 2;用注射用水将氨
苄青霉素配置成质量浓度为 600 μg /mL的原液，并倍比稀释为 6 个质量浓度梯度见表 2。
表 2 新疆芍药总多糖、对照品氨苄青霉素的质量浓度梯度 单位:mg /mL
名 称
质量浓度梯度
1 2 3 4 5 6
芍药总多糖 110. 4 55. 2 27. 6 13. 8 6. 9 3. 45
氨苄青霉素 4. 2 0. 84 0. 42 0. 21 0. 105 0. 053
1. 7. 2 连续稀释法 最低抑菌含量(MIC)与最低杀菌含量(MBC)的测定 将校正至 0. 5 麦氏比浊
管含量的菌液，按照 1 ∶ 10(V /V)的比例加入到不同梯度的药液、对照品溶液中，轻轻摇匀置 37
℃下，在 5% CO2 恒温培养箱中孵育 24 h后，从每个试管中取出 10 μL加入到血平板培养基中，
置 37 ℃下，在 5% CO2 恒温培养箱中孵育 24 h后，计数。以上实验平行 3 次，应用平板菌落计
数法，计算菌落数的平均值。分析获得新疆芍药总多糖对变异链球菌的抑制作用:最低抑菌浓度
(MIC)与最低杀菌浓度(MBC)。
1. 7. 3 琼脂扩散法(改良 Kirby － Bauer 法)
(1)无菌药敏纸片的制备:将直径为 6. 35 mm的滤纸片进行 121 ℃，15 min高压蒸汽灭菌。
无菌药敏纸片采用逐片加样后，冷冻干燥法抽干，备用。
(2)检测方法:用无菌棉拭子蘸取制备好的菌液接种物，并在液面上的管壁内轻轻旋转挤
压，将多余的菌液挤出，分 3 次均匀的涂布在培养基表面，每次旋转平皿 60°，使细菌分布均
匀，最后用棉拭子绕平皿边缘旋转两周。盖上平皿在室温干燥几分钟，以无菌镊子夹取药敏纸片
平贴于培养基上，每皿 3 片试验样片，1 片对照片。每菌作 3 次重复，取其平均值。盖上平皿在
室温干燥至少 3 min，15 min内放入 37 ℃，5% CO2 恒温培养 16 ～ 24 h后，用游标卡尺量出抑菌
圈直径，以抑菌圈直径为抑菌活性指标，直径越大表示抑菌活性越强。
2 结果与讨论
2. 1 单因素试验
2. 1. 1 料液比对新疆芍药总多糖提取率的影响 精密称取新疆芍药样品 5. 0 g，在提取次数为 2
次、提取温度为 85 ℃、提取时间为 2 h 的条件下，研究提取料液比对新疆芍药总多糖提取率的影
响。提取后离心得上清液减压浓缩后加入一定比例的无水乙醇，静置过夜。用 Sevage 试剂除去
蛋白质，离心后得总多糖沉淀，测定总多糖的含量，结果见图 2。由图 2 可知，料液比是影响新
疆芍药总多糖含量的主要因素之一。随着料液比的增加，总多糖提取率也随着增加，但考虑到料
液比过大，使原料消耗增加，会给后续工序带来麻烦，且长时间浓缩也容易破坏新疆芍药总多糖
的活性成分，不利于实际生产，从节省原料和简化工艺等方面考虑，选择料液比为 1 ∶ 10 左右
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为宜。
2. 1. 2 提取次数对新疆芍药总多糖提取率的影响 精密称取新疆芍药 5. 0 g，在料液比为 1 ∶ 10、
温度为 85 ℃、提取时间为 2 h 的条件下，研究提取次数对新疆芍药总多糖提取率的影响。结果见
图 3，当提取次数由 1 次上升到 2 次时，总多糖提取率迅速增加，提取 3 次以后，总多糖提取率与
第 2 次差异不大。因此，提取次数选择 2 次为宜。
2. 1. 3 提取时间对新疆芍药总多糖提取率的影响 精密称取新疆赤芍样品 5. 0 g，在提取次数为
2 次、料液比为 1 ∶ 10、提取温度为 85 ℃的条件下，研究提取时间对新疆芍药总多糖提取率的影
响。结果见图 4，随着时间的延长，新疆芍药总多糖的浸出量逐渐增加，到 2 h 时达到最高值，
随后总多糖提取率无明显变化，故提取时间选择为 2 h为宜。
2. 1. 4 提取温度对新疆芍药总多糖提取率的影响 精密称取新疆赤芍样品 5. 0 g，在提取次数为
2 次、料液比为 1 ∶ 10、提取时间为 2 h 的条件下，研究提取温度对新疆芍药总多糖提取的影响。
结果见图 5，温度上升到 95 ℃时，虽然提取率也在增加，但增加幅度较小，考虑到总多糖为活性
物质，其结构与活性易受温度影响，且提取温度越高，成本费用越大，故提取温度选在 85 ℃左
右为宜。
2. 2 新疆芍药总多糖提取条件优化
根据上述单因素试验结果，在提取赤芍总多糖的过程中，不同的料液比、提取时间、提取次
数对芍药总多糖的提取率的影响较大，故试验选取以上 3 个因素作为参考因子，综合分析各因素
的影响程度，采用 L9(3
4)正交试验对新疆芍药总多糖提取工艺进行优化，结果见表 3 ～ 5。
由表 3 的正交试验方差分析可得，影响新疆芍药总多糖提取率的 3 个因素的主次顺序:料液
比 ＞提取时间 ＞提取次数，料液比对总多糖提取率的影响较为显著。故新疆芍药总多糖最佳提取
工艺为 A1B2C1，即在料液比为 1 ∶ 8、浸提次数为 2 次、浸提时间为 1. 5 h条件下，芍药总多糖的
提取率较高，为 51. 57%。
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表 3 新疆芍药总多糖提取的正交实验因素水平表
水 平
因 素
料液比 /倍数(A) 浸提次数 /次(B) 浸提时间 /h(C)
1 1 ∶ 8 1 1. 5
2 1 ∶ 10 2 2. 0
3 1 ∶ 12 3 2. 5
表 4 新疆赤芍总多糖提取正交试验 L9(3
4)结果
序 号
列 号
A B C D
评价指标
总多糖提取率 /%
1 1 1 1 1 51. 43
2 1 2 2 2 50. 64
3 1 3 3 3 51. 57
4 2 1 2 3 48. 14
5 2 2 3 1 49. 55
6 2 3 1 2 49. 26
7 3 1 3 2 41. 93
8 3 2 1 3 44. 89
9 3 3 2 1 42. 45
K1 153. 64 141. 50 145. 58 143. 43
K2 146. 95 145. 08 141. 23 141. 83
K3 129. 07 143. 08 143. 05 144. 60
Ｒ 8. 12 1. 19 1. 45 0. 92
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表 5 方差分析表
变异来源 SS V MS F P
A 105. 69 2. 00 52. 85 81. 99 ＜ 0. 05
B 2. 14 2. 00 1. 07 1. 66 ＞ 0. 05
C 3. 18 2. 00 1. 59 2. 47 ＞ 0. 05
D 1. 29 2. 00 0. 64 1. 00
误差 1. 29 2. 00 0. 64
注:F0. 05(2，2)= 19
2. 3 新疆芍药总多糖对变异链球菌的抑制作用
连续稀释法:最低抑菌浓度(MIC)与最低杀菌浓度(MBC)的测定结果。
(1)连续稀释法对新疆芍药总多糖进行抑菌实验研究，获得新疆芍药总多糖对变异链球菌
的抑菌活性:
① 新疆芍药总多糖对变异链球菌的抑制作用:在质量浓度为 110. 4 mg·mL －1时具有较好的
抑菌活性，虽然不能达到完成杀菌的效果，但能较好地抑制变异链球菌的生长，培养基菌落计数
平均为 13 个。
② 标准品氨苄青霉素对变异链球菌的抑制作用:MIC = 0. 053 mg·mL －1，MBC = 0. 105
mg·mL －1;
(2)琼脂扩散法对新疆芍药总多糖进行抑菌实验研究，获得新疆芍药总多糖对变异链球菌
的抑菌活性:测得抑菌圈与对照品比较，具有一定的抑菌活性。在质量浓度为 110. 4 mg·mL －1
时抑菌圈直径为 16. 2 cm。
2. 4 结 论
本实验旨在通过对新疆芍药总多糖提取工艺的研究，结合变异链球菌是人类最常见感染性疾
病之一，龋病的公认主要致龋菌，探讨芍药总多糖对变异链球菌的抑菌活性，提高新疆芍药的利
用率和实用价值，合理地开发利用资源。
研究发现，生物膜的存在有益于变异链球菌抵御苛刻的口腔环境变化，使变异链球菌能在复
杂多变的口腔环境中得以生存，并在条件合适时致龋［11］。生物膜状态下的细菌比浮游状态下的
同种细菌具有更强的毒力、耐药性和对抗宿主免疫防御的能力，能在宿主抑菌成分中代谢生存。
可见，生物膜对变异链球菌的生存乃至进一步发挥其毒力，都有着至关重要的意义。实验为治疗
变异链球菌从新疆特色药中筛选有效、安全的抑菌药物提供参考，促进科学有效的用药。
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