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收稿日期:2009-04-16
基金项目:贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目 [黔科合中药
专字(2003)45号 ] 。
作者简介:毛堂芬(1970-),女 ,副研究员 ,主要从事药用植物生物技术
研究;E-mail:maotangfen@sohu.com。
通讯作者:刘作易。
环草石斛离体培养的研究
毛堂芬 1 , 　朱国胜 1, 2 , 　刘作易 2, 3 , 　吴明开 2 , 　黄永会 1, 2
(1.贵州省生物技术研究所 , 　贵阳 550006;　2.贵州省农业生物技术重点实验室 , 　贵阳 550006;
3.贵州省农业科学院 , 　贵阳 550006)
摘要:环草石斛当年生带腋芽茎段是获得再生植株的较佳材料 , 消毒处理以 4 ～ 6 min效果最好 , 腋芽在 MS培养基上萌
发生长最好 ,芽的继代增殖培养基为 MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L,芽的增殖系数达到 3.8;1/2MS培养基中添加
NAA0.5mg/L有利于生根壮苗 , 生根率达 100%。
关键词:　环草石斛;茎段;组织培养
中图分类号:　S567.23　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2009)08-0035-03
StudiesontheCultureinVitroofDendrobiumloddigesiRolfe
MAOTang-fen1 , ZHUGuo-sheng1, 2 , LIUZuo-yi2, 3 , WUMing-kai2 , HUANGYong-hui1, 2
1.GuizhouBiotechnologyInstitute, Guiyang550006, China;
2.TheKeyLaboratoryforAgri.BiotechnologyofGuizhou, Guiyang550006, China;
3.GuizhouAcademyofAgriculturalScience, Guiyang550006 , China)
Abstract:The1 year-oldstemswithaxilarybudofDendrobiumloddigesiRolfewasthebestexplanttoin-
ducetheplantlets.Theoptimumsterilizetimeofthestemswas4-6minutes.Thesuitableculturemediumfor
theinductionofthegerminationoftheaxilarybudswasMS.ThesubculturemediumofplantletswasMS+4.0
mg/L6-BA+0.2mg/LNAA, thecoeficientofmultiplicationcouldreach3.78.OnthehalfstrengthMSme-
diumsupplementedwithNAA0.5mg/L, therootingratecanreach100%.
Keywords:　DendrobiumloddigesiRolfe;stemwithaxilarybud;tissueculture
　　环草石斛 (DendrobiumloddigesiRolfe)为兰科
石斛属多年生草本植物 ,又名粉花石斛 、美花石斛 、小
黄草等 ,是我国传统的常用名贵中药材 ,以新鲜或干燥
的茎入药 ,在 《神农本草经 》中列为上品 ,属于 《中国药
典 》(2000版)收载的药用石斛之一。环草石斛具有生
津益胃 、清热养阴 、润喉明目 、轻身延年等功效;主要分
布于贵州 、广东 、广西 、云南等省 。贵州省兴义 、安龙 、
·35·
研究报告　　毛堂芬 等:环草石斛离体培养的研究
DOI :10.16590/j.cnki.1001-4705.2009.08.069
贞丰等地分布了较多的野生资源 ,兴义在历史上曾因
资源丰富而有过 “黄草坝 ”的美称 。研究开发环草石
斛具有巨大的经济效益和社会效益 ,目前市场上以石
斛为原料加工的成品中成药有石斛夜光丸 、脉络宁注
射液 、清咽宁 、益胃汤等。作为一种药用植物 ,传统用
药均采集其野生资源 ,造成了环草石斛生境的破坏及
资源的匮乏 ,已被列为国家重点保护的野生药材品种。
随着社会的发展和人类生活水平的提高 ,人工种植开
发环草石斛成为必然 ,由于环草石斛生长环境和繁殖
的特殊性 ,利用组织培养快速繁殖种苗成为发展环草
石斛最为有效的手段 [ 1 ～ 3] 。自 2003年中药现代化项
目实施以来 ,利用其种子作为试验材料 ,诱导获得了原
球茎及组培苗等 [ 3 ～ 5] ,同时也选用茎段 、叶片等作为离
体培养材料 ,拟诱导获得愈伤组织及组培苗 ,为实现种
苗产业化生产提供繁殖材料和技术依据。本试验的结
果作为中药现代化项目 《环草石斛组培苗工厂化生产
技术研究》的一部分 ,实现种苗的快速繁殖 ,同时有利
于资源的保护和可持续利用。
1　材料与方法
1.1　材　料
环草石斛当年生带腋芽茎段 、嫩叶及气生根等。
环草石斛原植物材料采集于贵州省安龙县自然保护
区 ,栽种于实验用塑料大棚内。
1.2　方　法
剪取环草石斛当年生健壮无病虫害茎段(选用中
部 ,去掉叶片 ,不损伤茎节腋芽)、嫩叶 、气生根等 ,先
在自来水下冲洗 20min,再用软刷蘸洗衣粉水轻刷茎
上的污物 ,并在自来水下清洗干净 ,沥干水分备用。在
超净工作台上 ,先用 75%的酒精消毒 20s,再用 0.1%
氯化汞杀菌处理 ,时间分别为茎段 5min(消毒时间试
验见表 2)、嫩叶 3min、根 5min;然后用无菌水洗涤 5
次 ,用无菌滤纸吸干表面水分;用无菌的解剖刀将带节
茎段切成小段(每段带有一个腋芽),将叶片切成 0.5
cm2大小 、根切成 0.5 ～ 1.0cm长 ,分别接种在准备好
的培养基上 。培养基中均加入 3%蔗糖 、0.75%琼脂
粉和 0.05%活性炭粉 , pH5.8 ～ 5.9,在 121℃下高压
灭菌 20min。外植体初始培养的培养基用试管分装 ,
每支试管 15ml,接种 1个外植体;继代增殖培养的培
养基用 100ml三角瓶分装 ,每瓶 30ml,每瓶接种 4个
外植体 。
1.3　培养条件
接种材料的培养条件均为培养温度(25±2)℃,
光照强度 1 500 ～ 2 000lx,每天光照时间 13h。
2　结果与分析
2.1　不同外植体的诱导效果
不同外植体接种在培养基 MS+6-BA2.0mg/L+
NAA0.1mg/L+2, 4-D3.0mg/L上 ,培养 25d后统计
结果(表 1)。茎段接种培养 10d左右 ,插入培养基的
基部膨大 ,腋芽开始萌发 , 20d后芽长 0.5 ～ 1.5cm,没
有愈伤组织产生;嫩叶培养 10d后 ,颜色失绿 、变褐 ,
逐渐死亡 ,无愈伤组织发生;气生根培养一段时间仍为
白色 ,无愈伤组织产生 。因此 ,采用带腋芽茎段作为接
种材料是诱导再生植株的最佳选择。
表 1　不同外植体对诱导效果的影响
外植体 接种数(个) 诱导效果
带腋芽茎段 30 腋芽萌发 ,未见愈伤组织形成
嫩叶 30 未见愈伤组织形成 ,死亡
气生根 30 未见愈伤组织形成
2.2　不同消毒时间对茎段灭菌效果的影响
　　将消毒处理好的茎段接种在培养基 MS+6-BA
4.0mg/L+NAA0.2 mg/L上培养。试验结果表明
(表 2), 5个消毒时间处理中 ,采用 4 ～ 6min的杀菌效
果最理想 ,腋芽均萌发生长 ,外植体的成活率最高 ,达
100%;消毒时间不足(<4min)的接种材料 ,培养 4d
后就发现杂菌滋生引起污染 ,造成腋芽不能萌发;消毒
时间过长(>6min),氯化汞杀死杂菌的同时也影响腋
芽的生活力 ,茎段污染率低 ,但腋芽萌发成活率也降
低 ,甚至死亡 。
表 2　不同消毒时间对茎段灭菌效果的影响
(培养 15d统计结果)
消毒时间
(min)
接种茎段
数(个)
污染数
(个)
污染率
(%)
成活数
(个)
成活率
(%)
2 30 8 26.7 22 73.3
4 30 0 0.0 30 100
6 30 0 0.0 30 100
8 30 0 0.0 20 66.7
10 30 0 0.0 18 60.0
2.3　不同基本培养基对芽诱导的影响
茎段腋芽在 4种培养基(未加激素)上均萌发 ,但
萌发生长状况不一样(表 3)。在 MS培养基上 ,腋芽
萌发的芽长势最好 ,色绿 ,较整齐 ,长芽较多 ,最长的达
2.0cm,均长为 1.3cm,有气生根发生;在 B5培养基上
萌芽长势好 ,有的芽长达 1.5cm,也有气生根发生;在
N6和 KC上 ,萌芽长势差 ,细弱 ,有的呈萌芽状 ,少数
发根。
·36·
第 28卷　第 8期　2009年 8月　　　　　 　　 　　　　种　子　(Seed)　　　　 　　 　　　　Vol.28　No.8　August.　2009
表 3　不同基本培养基对茎段腋芽萌发的影响
(培养 30d统计)
培养基 接种茎段数(个)
平均芽长
(cm) 腋芽萌发情况
N6 30 0.7 腋芽均萌发 ,但长势差 、细弱
KC 30 0.4 腋芽均萌发 ,但长势差 、细弱
MS 30 1.3 腋芽均萌发 ,长势好 ,有气生根发生
B5 30 1.0 腋芽均萌发 ,长势中等 ,有气生根发生
2.4　激素 6-BA和 NAA对芽增殖生长的影响
将长约 1.0 cm的无菌芽转接到附加不同浓度
6-BA和 NAA的增殖培养基 MS上 ,试验结果见表 4。
激素 6-BA的添加对芽的增殖起着关键作用 ,随着浓
度的增加 ,芽的增殖系数提高 ,当 6-BA的浓度为 4.0
mg/L时 ,芽的增殖系数为最大 ,达到 3.8,且芽生长较
整齐;过高的 6-BA浓度却抑制芽的增殖生长 ,同时苗
出现生长不正常;6-BA浓度较低时 ,芽增生少 , 且细
弱 ,有气生根;在只添加 NAA的对照培养基上芽基本
不增殖 ,气生根发生较多 、较细长。
表 4　6-BA和 NAA对芽增殖的影响(培养 27d统计)
6-BA
(mg/L)
NAA
(mg/L)
接种芽数
(个)
培养后芽数
(个) 增殖系数
0.0 0.2 40 40 1.0
0.5 0.2 40 52 1.3
1.0 0.2 40 61 1.5
2.0 0.2 40 94 2.4
4.0 0.2 40 151 3.8
6.0 0.2 40 136 3.4
8.0 0.2 40 115 2.9
3.0 0.5 40 84 2.1
3.0 0.1 40 124 3.1
表 5　不同浓度 NAA对芽生根的影响
NAA
(mg/L)
接种苗数
(株)
平均生根数
(条)
平均根长
(cm)
生根率
(%)
0.1 40 1.6 1.5 83
0.2 40 2.9 2.3 94
0.5 40 3.3 3.5 100
2.5　不同 NAA浓度对组培苗生根的影响
将高为 2.0cm左右的芽苗分切成单株转接到添
加不同浓度 NAA的 1/2MS生根培养基上(表 5)。环
草石斛较容易生根 ,单芽培养约 10 d后 ,基部长出白
色的根尖 ,然后长成不定根。在 NAA0.5mg/L时 ,芽
发生的根系粗壮发达 、且长 ,生根率达 100%,植株生
长健壮 ,叶色浓绿;当 NAA0.1mg/L时 ,芽长势及根
的生长较一般;添加 NAA.01 mg/L时 ,芽的根少 、较
细弱 ,植株长势较差。当根长到 2.0cm以上即可以进
行炼苗移栽 。
3　讨　论
环草石斛的离体快繁体系的建立 ,受多种因素的
影响。选择适宜的外植体在很大程度上影响了大量组
培苗的获得 。由于环草石斛蒴果内的种子约有上万甚
至百万粒 ,种子进行无菌播种后 ,萌发成苗率高 ,从而
繁殖系数高 ,可以得到较多的原球茎或实生苗 ,通过原
球茎的增殖分化及苗的增殖均可以实现组培苗的快速
繁殖[ 3] ;选用带腋芽茎段作外植体 ,通过丛生芽的方
式快速繁殖时 ,生长周期较短 ,苗较健壮 ,可以保持遗
传特性 ,但取材时受季节及原植物材料限制 ,通常以生
长能力较强的当年生茎段腋芽为好 ,且不同的取材部
位也影响诱导效果 ,故在试验及生产时应尽量选繁殖
力相近的部分;本试验中选用叶和气生根作外植体时
未诱导出原球茎或愈伤组织 ,可能是因为培养基不适
宜 。适当的消毒时间是建立无菌繁殖系的关键 。蒴果
内的种子作接种材料时 ,只需进行蒴果表面灭菌 ,消毒
方便 ,不易污染 [ 3] 。选用茎段或其他部位作为外植体
则需要做消毒时间试验 ,时间的长短影响了接种材料
的成活 ,从而影响无菌繁殖材料的获得 ,本试验中茎段
的消毒时间以 4 ～ 6min为最好 ,既达到了理想的灭菌
效果 ,腋芽的萌发情况也较佳。适宜的基本培养基对
腋芽的萌发生长影响较大 ,本试验中腋芽的萌发以 MS
较好 ,芽长且质优 。激素是实现繁殖材料增殖生长的
关键 ,添加 6-BA4.0mg/L和 NAA0.2mg/L时 ,芽的
增殖系数达到 3.8;在 1/2MS培养基中添加 NAA0.5
mg/L时 ,苗生长势好 , 生根率达 100%,利于炼苗成
活 ,获得优质种苗 。
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