全 文 ：·资源与鉴定·
收稿日期:2011-04-11
作者简介:林淑芳，主管技师，研究方向为中药资源及分子生药，E-
mail:linshufang2006@ 126． com
* 通讯作者:李晓明，E-mail:amkd580@ 163． com
不同来源赶黄草的 ISSR分析
林淑芳，袁 媛，邵爱娟，李晓明* ，陈顺钦，陈 敏
(中国中医科学院中药研究所，北京 100700)
摘要:目的 对不同来源的赶黄草进行遗传多样性分析，为进一步开发利用和保护赶黄草药用资源提供
理论基础。方法 利用 ISSR分子标记方法对 7 个不同来源 110 个赶黄草样品进行 DNA分子水平的评价，采
用 PAUP 4． 0b软件处理进行聚类分析。结果 筛选出 19 个 ISSR引物，利用其中 3 条引物进行了不同来源赶
黄草样品的 ISSR-PCR分析，共获得 34 条多态性条带，多态位点百分率为 100%，同时进行了居群间遗传多样
性差异分析。结论 赶黄草四川居群与其他两个居群间存在着一定的分化。本方法在评价赶黄草遗传多样
性、亲缘关系、品种鉴别、遗传进化等方面有很好的适用性，可为赶黄草及其近缘属植物的系统学研究提供更
多信息。
关键词:赶黄草;ISSR;遗传多样性
中图分类号:Q341 文献标识码:A 文章编号:1673-6427(2012)03-0018-04
Analysis on Genetic Diversity of Penthorum chinense Pursh from
Separate Sources Based on ISSR Markers
LIN Shu － fang，YUAN Yuan，SHAO Ai － juan，LI Xiao － ming，CHEN Shun － qin，CHEN Min
(Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)
Abstract:Objectives Genetic diversity analysis of Penthorum chinense Pursh was performed in order to pro-
vide the theoretical basis of the exploitation of the medical resources of Penthorum chinense Pursh．Methods ISSR
molecular markers were used to analyze the genetic diversity of Penthorum chinense Pursh from separate sources．
PAUP 4． 0b software was used for the cluster analysis． Results 3 primers of 19 ISSR primers screened out were
used in ISSR － PCR，and 34 polymorphic bands obtained were representative of 100% polymorphism． Conclusion
There were differentiations between Sichuan population and the others Penthorum chinense Pursh tested． The
method was applicable for evaluating genetic diversity，affiliation，variety appreciation and genetic evolution of
Penthorum chinense Pursh．
Key words:Penthorum chinense Pursh;ISSR;genetic diversity;
赶黄草是一种传统药用植物，又名水泽兰、水杨
柳等，为虎耳草科植物扯根菜 Penthorum chinense
Pursh的干燥全草，始载于明代《救荒本草》，具有清
热解毒、退黄化湿，活血散瘀，利水消肿之功效，是苗
族民间治疗肝病的经验方，苗族人世代习用，称为
“神仙草”［1］。赶黄草主要生长在较潮湿的地方，分
布华北、华东、中南及陕西、四川、贵州各地［2］。目
前在分子水平上尚无有关赶黄草遗传背景、亲缘关
系、鉴别的研究报道，也无野生和栽培遗传差异的相
关研究。我国第一个获世界原产地域保护的中药品
种“古蔺肝苏”中的赶黄草主要来源于四川古蔺，本
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现代中药研究与实践 2012 年第 26 卷第 3 期
Chin Med J Res Prac，2012 May，Vol． 26 No． 3
DOI:10.13728/j.1673-6427.2012.03.009
研究利用 ISSR技术分析了该来源与其他来源赶黄
草以及野生与栽培居群间的遗传差异，为进一步开
发利用和保护赶黄草药用资源提供理论基础。
1 材料和方法
1． 1 材料
自四川、江西、吉林等地收集了 7 个居群的赶黄
草，经中国中医科学院中药研究所研究员黄璐琦鉴
定为虎耳草科植物扯根菜 Penthorum chinense Pursh
的干燥全草。取其健康幼嫩的叶片，分个体取样，置
硅胶中快速干燥。7 个居群共 110 份样品供试。样
品编号如表 1 所示。
表 1 赶黄草 ISSR分析供试样品来源
Tab． 1 The origin of materials
居群编号 类型 产地来源 (样品编号)
1 家种 四川民乐 (1 － 20)
2 家种 四川古蔺县观文凤鸣村 (21 － 40)
3 野生 四川古蔺县石宝(41 － 60)
4 野生 四川古蔺县观文回龙 (61 － 63)
5 野生 四川省德阳市罗江 (64 － 66)
6 野生 江西庐山 (67 － 83)
7 野生 吉林延吉 (84 － 110)
1． 2 仪器和试剂
ABI 9700 PCR 扩增仪(Applied Biosystems，美
国) ;Micro MB 3616 型高速离心机(IEC 公司，美
国) ;GeneQuant II RNA /DNA Calculator (Pharmacia
Biotech，英国) ;DYY － III 5 型电泳仪(北京市六一
仪器厂) ;GeneGenius凝胶紫外成像系统(SYNGENE
公司) ;rTaq DNA 聚合酶(大连宝生物工程有限公
司) ;琼脂糖(Promega) ;dNTPs(Pharmacia) ;ISSR 引
物由上海生物工程有限公司合成。其他试剂均为分
析纯。
1． 3 方法
1． 3． 1 总 DNA的提取 取干燥叶片少许用研磨仪
研磨，将磨碎的叶片粉末加入 2． 0 mL离心管中至约
1 /5，加 0． 7 mL 2% CTAB提取缓冲液，混匀后 65℃
下保温 1 h，冷却至室温后，12 000 r /min 离心 15
min，将上清液转移至一新的离心管中，加等体积的
氯仿:异戊醇(24:1)混合液，轻缓地颠倒混匀至乳
浊状，12 000 r /min 离心 10 min。取上清液转至另
一新离心管中，加入 2 倍体积异丙醇，颠倒混匀，－
20℃保存 2 h后，12 000 r /min 离心 10 min，去上清
液，用 70% 乙醇洗涤后，用无水乙醇洗涤，弃上清
液，空气干燥，将 DNA 溶于 40 μL 灭菌纯水中，4℃
下贮存。1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA，并利用核
酸定量仪对 DNA含量进行测定［3］。
1． 3． 2 ISSR 扩增 反应体系总体积 25 μL，其中
10 × Buffer(10 mmol /L Tris － HCl，pH8． 3;50
mmol /L KCl)2． 5 μL，5 U /μL 的 Taq DNA 聚合酶
0． 2 μL，25 mmol /L 的 MgCl2 2． 0 μL，10 mmol /L 的
dNTPs 2． 0 μL，15 μmol /L的引物 1． 0 μL，50 ng /μL
的模板 DNA 1． 0 μL，以及 ddH2O 11． 3 μL。扩增程
序为预变性 5 min，94 ℃30s、50℃ 30s、72 ℃1 min，
40 个循环后 72℃延伸 5 min。取 10 μL扩增产物于
1． 0%琼脂糖凝胶上用 1 × TAE 电泳缓冲液电泳，紫
外检测拍照。
1． 3． 3 数据分析 电泳图谱中的每一条带(DNA
片段)均为一个分子标记(Marker) ，并代表一个引
物结合点。根据各分子标记的有无及其迁移率统计
得到所有位点的二元数据，无带(隐性)计为 0，有带
(显性)计为 1(强带和弱带的赋值均为 1)。对于多
态位点，仅在重复实验中能清晰、稳定出现的差异带
用于数据分析。将 77 个供试品记录各多态位点的
1 /0 数据输入计算机，数据采用 PAUP 4． 0b 软件处
理，NJ聚类分析。
2 结果
2． 1 引物的筛选
从 100 个 ISSR引物中用单个模板筛出 19 个引
物，再用 7 个来自不同来源的赶黄草总 DNA模板筛
选出 3 个扩增条带清晰、呈现多态性的引物。
2． 2 赶黄草 ISSR遗传多态性
利用筛选出的 3 个引物对 7 个赶黄草居群进行
了 ISSR多态性测定，扩增结果如图 1 ～ 3。从 ISSR
扩增条带统计结果可知(表 2) ，每个引物可扩增出
11 ～ 12 条多态性带。3 个 ISSR引物共产生 34 条扩
增带，均为多态性条带。由此可见，各材料间的多态
性较高，用这 3 条引物可将它们完全区分开来。用
这些引物对 77 个样品进行扩增，结果共得到 1 114
条清晰、稳定、可重复的条带。
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表 2 所用引物扩增结果统计表
Tab． 2 PCR amplification of three ISSR primers
引物 序列 扩增条带数 多态性带数 多态位点百分率(%)
814 CTCTCTCTCTCTCTCTA 11 11 100． 0
835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 11 11 100． 0
889 DBDACACACACACACAC 12 12 100． 0
Y =(C，T) ;B =(C，G，T) (i． e． not A) ;D =(A，G，T) (i． e． not C)
2． 3 聚类分析
利用 ISSR 标记数据，采用 NJ(Neighbor － join-
ing)法构建了赶黄草个体间的遗传关系聚类图(图
4)。从图中可以看出来源于四川、江西和吉林的赶
黄草各为一类，且吉林与江西来源的赶黄草遗传差
异小于它们与四川来源赶黄草的遗传差异。在四川
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居群内，栽培与野生居群间又存在着各聚一类的趋
势，说明野生和栽培居群间存在着一定的分化。
2． 4 居群间遗传多样性差异分析
利用 VARP法分别计算了 7 个居群和全部样品
的样本总体方差，从表 3 中可以看出，居群 1 和 4 的
样本总体方差小于其他居群，说明这两个居群内的
遗传变异较小。而在四川来源居群中，栽培居群的
样本总体方差小于野生居群，说明栽培居群内的遗
传变异小于野生居群。另一方面，四川来源居群与
其他两个来源居群间的变异大于四川来源野生与栽
培居群间的遗传变异。
表 3 居群间遗传多样性差异分析
Tab． 3 Analysis of genetic diversity between populations
居群 样本总体方差
四川居群与其它居群间差异(P，t － test)
1 2 3 4 5
1 0． 0997 － － － － － － － － － － － － － － －
2 0． 2284 3． 4E － 09 － － － － － － － － － － － －
3 0． 2220 8． 0E － 15 6． 9E － 01 － － － － － － － － －
4 0． 0923 8． 2E － 01 2． 0E － 04 1． 1E － 04 － － － － － －
5 0． 2284 2． 2E － 07 1． 0 6． 0E － 01 4． 3E － 04 － － －
6 0． 2470 4． 6E － 31 4． 5E － 02 9． 9E － 07 1． 2E － 08 9． 3E － 02
7 0． 2384 1． 3E － 65 6． 5E － 07 4． 25E － 25 1． 6E － 16 3． 5E － 05
全部样品 0． 2436 － － －
四川栽培居群 0． 1370 4． 6E － 10
四川野生居群 0． 2146
图 4 赶黄草样品 ISSR聚类系统图
Fig． 4 Dendrogram of cluster analysis based on ISSR
datum of 110 P． chinense samples
3 讨论
ISSR分子标记的扩增产物受反应体系中随机
因素的影响较小，本试验筛选的 3 条 ISSR 引物，获
得 34 条多态性条带，总体水平上的多态位点百分率
为 100%，说明该方法在评价赶黄草遗传多样性、亲
缘关系、品种鉴别、遗传进化等方面有很好的适用
性，可为赶黄草及其近缘属植物的系统学研究提供
更多信息。
赶黄草的遗传变异与其地理分布有着密切的关
系。本研究表明，四川、吉林、江西三地来源的赶黄
草组间遗传变异较大，在多数一致树上均各聚一类。
且四川与另外两地的遗传距离较远，提示四川来源
赶黄草的遗传物质可能具有一定的独特性。
参考文献
［1］ 胡尚钦，邓科君，童文，等． 施氮磷钾对赶黄草产量和槲皮素含
量的影响［J］． 西南农业学报，2009，22(5) :1383 － 1387.
［2］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会． 中华本草(第 4 册)
［M］． 上海，上海科学技术出版社，1999，4，37.
［3］ 黄璐琦，王敏，周长征，等． RAPD方法在细辛类药材鉴别研究
中的问题及其对策［J］． 药学学报，1998，33(10) :778 － 784
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