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金钗石斛与环草石斛内生真菌对其宿主植物生长效应的影响



全 文 :第 36卷 第 1期
2008年 2月            
贵州 林 业科 技
GuizhouForestryScienceandTechnology            Vol.36, No.1Feb., 2008
金钗石斛与环草石斛内生真菌对其
宿主植物生长效应的影响
罗在柒1 乙 引2 姚柳焓 1
(1贵州省林业科学研究院林业生物工程技术中心贵阳 550011; 2贵州师范大学生物技术与工程学院 贵阳 550001)
  摘 要:实验从野生金钗石斛和环草石斛植株中分离 、 纯化得到菌株共 53株 , 与金钗石斛和环草石斛无菌
苗建立植物 -微生物共生体系 , 并观测植株生长状况 , 结果观测得到有 22株能促进金钗石斛生长的 , 18株对金
钗石斛造成伤害;有 25株明显促进环草石斛生长 , 18株对环草石斛造成伤害 , 其中对金钗石斛和环草石斛生长
都起到促进作用的共有 9株 , 尤其是菌株 037、 117和 120对金钗石斛和环草石斛生长影响显著。
关键词:内生真菌;生长效应;兰科植物
中图分类号:S718.3    文献标识码:B
EndophyticFungiandTheirGrowthEfectson
DendrobiumnobileLind.andDendrobiumloddigesiRolfe.
LuoZaiqi1 YiYin2
(1.TheCenterofForestryBio-EngineeringTechnologyinGuizhouAcademyofForestry, Guyang, 550011;2.Bio-technologyandEngineeringCol-
legeofGuizhouNormalUniversity, Guiyang, 550001)
Abstract:53isolatesofendophyticfungiwereisolatedfromthewildDendrobiumnobilelindl.andD.loddigesi
Rolfe., andtheywerethenre-inoculatedonthehostplantsfordeterminingtheirgrowthefects.Theresults
showedthattherewere22isolateshavingpositiveefectonthegrowthofDendrobiumnobilelindland25isolateson
thegrowthofD.loddigesiRolfe.Nineisolates, especialytheisolates037, 117, and120, hadsignificantinflu-
enceonthegrowthofbothDendrobiumnobilelindl.andD.loddigesiRolfe..
Keywords:Endophyticfungi;Growthefects;Dendrobiumnobilelindl.;D.loddigesiRolfe.
  石斛作为一种名贵中药在 《神农本草经 》 和
《本草纲目》 中被收录 , 列为上品 , 具有益胃生津 、
滋阴清热 、 明目利嗓等作用。我国石斛属植物中约
有 40种作药用 , 被 《中华人民共和国药典 》 (2000
年版一部)收录的药用石斛有 5种 [ 1] 。
兰科植物及其内生真菌形成特异的菌物体系 ,
植物与微生物之间的关系更为密切。郭顺星等
(1990)、潘超美等 (2002)利用超薄切片技术和
电子显微镜对细叶石斛种子消化入侵真菌萌发过
程 , 认识到真菌自胚柄处侵入种胚细胞的过程 [ 2, 3] 。
吴静萍 (1994, 2000)、 陈晓梅 (2000)、 张集慧
(1999)对通过兰科植物不同材料分离出大量内生
收稿日期:2007-10-09
作者简介:罗在柒 (1978~ ), 男 , 硕士 , 主要从事林木生物技术研究工作。
1期  罗在柒等:金钗石斛与环草石斛内生真菌对其宿主植物生长效应的影响
真菌 , 纯培养检测其代谢产物并测定了生物活性 ,
从物质角度探讨内生真菌促进其生长发育的机
制 [ 4 ~ 7] 。
在内生真菌影响植物生长发育方面 , 郭顺星和
徐锦堂 (1991, 1996)采用种子拌菌播种的方法 ,
使铁皮石斛种子发芽率达 64% [ 8] 。
另外 , 郭顺星 、 曹文芩 、 高微微 (2000)采用
平板分离法分离内生真菌的方法 , 对我国云南 、 四
川等地采集的野生铁皮石斛 (Dendrobiumcandi-
dum)和金钗石斛 (D.nobile)根中的内生真菌进
行分离并测定其生物活性 , 获得真菌 25种 , 主要
属于担子菌 (Basidiomycotina)和半知菌 (Deutero
mycotina), 分别与铁皮石斛种子 、 铁皮石斛及金钗
石斛无菌苗共同培养测定其生物活性 , 结果其中 5
种真菌可促进铁皮石斛种子萌发 , 7种真菌可与铁
皮石斛和金钗石斛幼苗形成共生关系 , 但仅有 3种
真菌对幼苗有促生作用[ 11] 。宋经元 、 郭顺星
(2004)研究认为在离体培养条件下选择合适的基
质和控制真菌的适度生长建立稳定的共生平衡系统
是促进金钗石斛生长的重要条件[ 10] 。
兰科植物与共生真菌之间的相互关系有大量的
问题需要解决 , 对金钗石斛和环草石斛内生真菌对
其宿主植物生理效应的研究报道甚少 , 还需要不断
深入研究。因此 , 本研究在野生金钗石斛和环草石
斛组织中分离出内生真菌 , 建立一个有效的实验系
统以探测两者之间的关系 , 研究内生真菌对宿主植
物生理生态影响 , 以期进一步认识石斛植物与其内
生真菌相互关系 , 为解决种质资源提供新的技术手
段和理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 金钗石斛 (DendrobiumnobileLind.)和环
草石斛 (DendrobiumloddigesiRolfe.)
野生金钗石斛和环草石斛均采自贵州省黔西南
州兴义地区则戎乡喀斯特石质碳酸盐岩山区 , 供试
无菌组培苗由采集种子经无菌播种的组织培养获
得 。
1.1.2 石斛属植物内生真菌
内生真菌从野生金钗石斛和环草石斛根 、茎和
叶等组织中分离得到 。
1.2 方法
1.2.1 内生真菌的分离与纯化
内生真菌分离方法参考有关文献改进[ 12] , 野
生金钗石斛 、 环草石斛的植株分别用流水冲洗干
净 , 并用无菌水充分洗净后切成 0.5 ~ 1.0cm小段 ,
0.1%HgCl2溶液表面清毒 8 ~ 10min, 无菌水冲净
消毒液 , 再用 75%乙醇消毒 5s, 无菌水冲洗后接种
于含有 PDA培养基的平皿内 , 25℃恒温培养。观
察到根内部 (皮层)有菌丝长入培养基时 , 及时挑
取真菌菌丝顶端并转到另一含有 PDA培养基的试
管或平皿纯化培养。
1.2.2 共生体系的建立
以于雪梅 (2000)方法为基础 [ 12] , 郭顺星
(2000)的方法加以改进 [ 11] , 将无菌植株和内生真
菌共同接入双重培养基质 , 运用植物 -微生物均适
合的双重培养基 (1 /2MS, 蔗糖 7g/L, 琼脂 10g/
L), 建立植物 -微生物共生体系 , 共同培养在 23
±2℃, 光照强度 3000Lx, 光照周期 12h的条件下 ,
观测植物和微生物的生长状况 , 筛选出对石斛幼苗
生长菌有促生作用的内生真菌菌株 , 在此建立共生
体系 , 适时检测植物各项生理指标 。
1.2.3 优良性状真菌菌株的初筛与复筛
将所分离得到的菌株分别与金钗石斛和环草石
斛建立共生体 , 以死亡 、 正常生长 、根茎或叶等器
官生长发育良好等为内生真菌的生物学效应指标 ,
观测记录植物及其内生真菌共生体系中植株的生长
状况 , 认定内生真菌对宿主植物的生物学的特性 。
2 结果与分析
2.1 石斛内生真菌的分离和筛选
从野生金钗石斛 (DendrobiumnobileLind.)和
环草石斛 (DendrobiumloddigesiRolfe.)中共分离
得到内生真菌 53株 , 其中从种子 、 茎 、 叶 、 根分
离得到菌株数分别为 10、 27、 8和 8 (表 1), 表明
茎是主要的内生菌生长的器官 。此外 , 从表 1中还
可以看到 , 绝大多数内生真菌为白色菌丝体 , 少数
褐色或其它颜色 , 有 10株内生真菌还可分泌色素
到培养基中 。
在植物 -微生物共生体系中 , 内生真菌菌株对
金钗石斛和环草石斛的生长表现出不同的作用效
果 , 具体见表 1。
在有益的内生真菌中 , 对金钗石斛和环草石斛
生长都有明显促进作用的共有 9个菌株 (菌株号分
29
贵 州 林 业 科 技 36卷
表 1 内生真菌对金钗石斛和环草石斛生长发育的影响
菌株号 来源 菌株特征         对植物生长情况          金钗石斛    环草石斛
004 金钗石斛茎段 白色菌丝布满基质 植株正常生长 , 茎膨大根发育好 植株变褐死亡
005 金钗石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株正常生长 , 茎粗壮, 植株变褐死亡
006 金钗石斛茎段 白色菌丝包裹植株 植株变褐死亡 植株正常生长 , 茎增长
017 金钗石斛茎段 褐色菌丝生长迅速 植株变褐死亡 植株正常生长 , 根增长
036 金钗石斛茎段 白色菌丝生长迅速 , 产生红色产物 植株正常生长 植株正常生长 , 茎增长
041 金钗石斛茎段 白色菌丝包裹植株 , 产生黑色代谢物 植株正常生长 , 旺盛 植株正常生长 , 粗壮
045 金钗石斛茎段 灰色菌丝生长缓慢 植株正常生长 植株正常生长 , 生长旺盛
071 金钗石斛茎段 白色菌丝包裹植株 植株正常生长 , 长势好 植株变褐死亡
077 金钗石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株正常生长 植株变褐死亡
078 金钗石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株正常生长 植株正常生长 , 生长旺盛
083 金钗石斛茎尖 白色菌丝布满基质 植株变褐死亡 植株变褐死亡
112 金钗石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株褐变死亡 植株正常生长 , 根发达
113 金钗石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株正常生长 , 茎出现分蘖 植株正常生长 , 生长旺盛
132 金钗石斛茎段 灰青色菌司长满植株 植株正常生长 , 叶增长 植株变褐死亡
046 金钗石斛叶片 白色菌丝生长缓慢 植株正常生长 , 茎粗壮 植株正常生长
052 金钗石斛叶片 白色菌丝生长迅速 , 产生红色代谢产物 植株变褐死亡 植株正常生长 , 生长旺盛
054 金钗石斛叶片 白色菌丝包裹植株 植株变褐死亡 植株正常生长 , 根发达
114 金钗石斛叶片 白色产生生长迅速 , 红褐色代谢产物 植株正常生长长势良好, 茎叶粗壮 植株变褐死亡
061 金钗石斛根 红褐色菌丝生长缓慢 植株生长正常 植株变褐死亡
063 金钗石斛根 青色菌丝生长缓慢 植株生长正常 , 茎叶粗壮 植株正常生长 , 生长旺盛
084 金钗石斛根 白色菌丝生长缓慢 植株变褐死亡 植株变褐死亡
085 金钗石斛根 白色菌丝生长缓慢 植株正常生长 , 茎叶增长 植株变褐死亡
098 金钗石斛根 白色菌丝生长迅速 植株变褐死亡 植株正常生长 , 根发达
125 金钗石斛根 白色菌丝布满基质 , 包裹植株 植株正常生长 , 茎增长 植株正常生长
126 金钗石斛根 白色菌丝生长迅速 植株正常生长 , 茎增长 植株变褐死亡
128 金钗石斛根 灰青色菌丝布满基质 , 包裹植株 植株正常生长出现分蘖, 植株正常生长
048 金钗石斛种子 灰青色菌丝生长缓慢 植株正常生长 植株正常生长 , 生长旺盛
068 金钗石斛种子 白色菌丝生长缓慢 植株正常生长 , 粗壮 植株正常生长
037 金钗石斛种子 白色菌丝生长迅速 植株正常生长 , 旺盛 植株正常生长 , 粗壮
074 金钗石斛种子 灰青色菌丝生长缓慢 植株正常生长 植株变褐死亡
115 金钗石斛种子 黄褐色菌丝生长缓慢 植株正常生长 植株正常生长
117 金钗石斛种子 白色菌丝生长迅速 , 包裹植株 植株正常生长 , 叶特长 植株正常生长 , 生长旺盛
118 金钗石斛种子 黄褐色菌丝生长迅速 植株生长正常 , 茎粗壮 植株变褐死亡
120 金钗石斛种子 褐色菌丝生长缓慢 , 产生红色产物 植株生长正常 , 茎叶增长 植株正常生长 , 生长旺盛
140 金钗石斛种子 褐色菌丝生长迅速 植株正常生长长势良好, 叶特长 植株正常生长 , 生长旺盛
145 金钗石斛种子 褐色菌丝生长迅速 植株正常生长 植株正常生长 , 生长旺盛
087 环草石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株变褐死亡 植株变褐死亡
089 环草石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株变褐死亡 植株变褐死亡
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1期  罗在柒等:金钗石斛与环草石斛内生真菌对其宿主植物生长效应的影响
  续表 1
菌株号 来源 菌株特征         对植物生长情况          金钗石斛    环草石斛
094 环草石斛茎段 灰青色菌丝生长迅速 植株正常生长 , 生长旺盛, 茎叶粗壮 植株正常生长
096 环草石斛茎段 红褐色植株被包裹 , 产生黄色代谢产物 植物正常生长 植株变褐死亡
102 环草石斛茎段 白色菌丝生长缓慢 植株正常生长 , 生长旺盛 植株正常生长 , 根发达
105 环草石斛茎段 白色菌丝生长缓慢 , 产生红色代谢产物 植株变褐死亡 植株正常生长 , 生长旺盛
108 环草石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株变褐死亡 植株正常生长
130 环草石斛茎段 白色产生紫色产物 植物变褐死亡 植株变褐死亡
131 环草石斛茎段 褐色菌丝生长缓慢 , 产生褐色代谢产物 植株生长正常 植株正常生长
134 环草石斛茎段 白色菌丝生长迅速 植株变褐死亡 植株正常生长
136 环草石斛茎段 白色植株长满菌丝 植物变褐死亡 植株正常生长 , 生长旺盛
026 环草石斛叶片 褐色菌丝生长迅速 植株生长正常 植株正常生长 , 粗壮
029 环草石斛叶片 白色菌丝生长缓慢 植株正常生长 , 茎增长 植株正常生长 , 粗壮
119 环草石斛根 褐色菌丝生长迅速 植株正常生长长势好 , 茎增长 植株正常生长
121 环草石斛根 褐色菌丝生长缓慢 , 产生红色产物 植株正常生长 植株正常生长 , 生长旺盛
129 环草石斛种子 白色菌丝生长迅速 , 产生褐色代谢产物 植物变褐死亡 植株变褐死亡
139 环草石斛种子 白色植株长满菌丝 植物变褐死亡 植株正常生长 , 生长旺盛
别为 029、 037、 041、 063、 102、 113、 117、 120、
140), 仅对金钗石斛生长有促进作用的有 14株菌
株 (菌株号分别为 004, 005, 046, 068, 071,
085, 096, 114, 118, 119, 125 , 126, 128,
132), 仅对环草石斛生长有促进作用的有 15株菌
株 (菌株号分别为 006, 017, 026, 036, 048,
052, 054 , 078, 098, 105 , 112, 121, 136, 139,
145);在无益无害的内生真菌中 , 对两种石斛都没
有明显效果的仅两株菌株 (菌株号分别为 131和
115), 仅对金钗石斛没有效果的有 13株菌株 (菌
株号分别为 026, 036, 045, 048, 061, 074, 077,
078, 096, 115, 121, 137, 145), 仅对环草石斛
没有明显效果的有 10株菌株 (菌株号分别为 046,
068, 089, 108, 115, 119, 125 , 128, 131,
134);在有害的内生真菌中 , 在对石斛生长有害的
内生真菌中 , 对金钗石斛和环草石斛生长都造成明
显伤害的共有 6个菌株 (菌株号分别为 083, 084,
087, 089 , 129, 和 130), 仅对金钗石斛造成明显
伤害的有 17株菌株 (菌株号分别为 006, 017,
052, 054 , 083, 084, 087 , 089, 098, 105, 108,
112, 129, 130, 134, 136, 139), 仅对环草石斛
造成明显伤害的有 18株菌株 (菌株号分别为 004,
005, 061 , 071, 074, 077 , 083, 084, 085, 087,
089, 096, 114, 118, 126, 129, 130, 132);在
偏利一种石斛 、 毒害另一种石斛的内生真菌中 , 对
金钗石斛起促生作用而对环草石斛造成伤害效果的
有 8株菌株 (菌株号分别为 004, 005, 071, 085 ,
114, 118, 126, 132), 反之 , 对环草石斛起促生
作用而对金钗石斛造成伤害效果的有 9株菌株 (菌
株号分别为 006, 017, 052, 054, 098, 105, 112 ,
136, 139)。
综上所述 , 在已分离到的 53株真菌中 , 对金
钗石斛和环草石斛均起促生作用的菌株占 16.98%,
对它们均造成伤害的菌株占 11.32%, 对金钗石斛
起促生而对环草石斛造成伤害的菌株占 15.09%,
对环草石斛起促生作用而对金钗石斛造成伤害的菌
株占 16.98%。这些结果表明内生真菌与宿主植物
的关系是多样性的 , 内生真菌对宿主植物的促生作
用中存在共性与种属专一性现象。因此 , 本论文从
对金钗石斛和环草石斛生长有益的 9个菌株 (菌株
号分别为 029、 037、 041、 063、 102、 113、 117、
120、 140)中 , 选择 037、 117、 120三个菌株对石
斛的生理生态作用作进一步深入研究。
2.2 内生真菌对石斛生长量化分析
2.2.1 内生真菌 032、 117和 120对金钗石斛生长
状况的影响
有益内生真菌对石斛幼苗形态建成起重要的促
进作用 。 32天时 , 内生真菌对金钗石斛生长影响明
31
贵 州 林 业 科 技 36卷
显 , 表 2的结果表明:037菌株在共生体系初期并
不表现出明显的促生效果 , 在中后期效果明显 , 它
可诱导植株茎叶粗壮 、根系发达 , 而且菌株量的多
少对植株均不会造成伤害;117菌株可以使茎明显
增粗 , 并诱发新根产生 , 此时 , 地上部分相对发
达 , 茎和叶都相对增长 (茎 max为 3.0cm, 叶长 /
宽为 3.0 /0.3), 但根系不发达 , 该菌株对植物生长
发育的阶段性促生作用效果明显 , 但是 , 当菌株生
物量增加到一定程度后对植株生长会造成一定伤
害;120菌株可诱导茎叶明显增粗 , 根系发达 , 部
分根直立向上生长形成气生根 , 根长达 5.0cm, 叶
长宽比为 3.0cm/0.5cm, 茎直径为 0.4cm, 高
2.0cm, 菌株活性较为温和 。实验中对照植株生长
正常 , 但相对处理植株比较纤细。
32天时菌株 037对环草石斛诱导植株茎叶粗
壮 、根系发达 , 出现了 2个新芽 , 部分根直立向上
生长形成气生根。 117菌株对环草石斛诱导得到茎
和叶都相对增粗 , 根发达且有腊质壳 。;120菌株对
环草石斛诱导得到茎叶明显增粗 , 新芽粗壮 , 根发
达 (具体见表 3)。
2.3 植物与微生物共生体系内生真菌对金钗石斛
和环草石斛影响的相关分析
在相同条件下 , 由于不同物种生物学特征之间
的差异 , 同种菌株与不同种石斛的共生体系生长及
其生理生化效应也不相同 。内生真菌与宿主植物之
间可能存在种属特异性 , 但同时也存在内生机制的
共性。
通过研究相同菌株与金钗石斛 、环草石斛分别
建立植物与微生物共生体系 , 其结果为分离菌株
中 , 共同促进金钗石斛和环草石斛生长共有 9个菌
株 , 对金钗石斛和环草石斛生长都造成伤害有 6
株 , 对金钗石斛起到促生而对环草石斛造成伤害效
果的有 8株菌株 , 有 9株菌株对环草石斛起到促生
作用而对金钗石斛造成伤害。
从筛选的 3株真菌菌株进一步研究 , 以生物量
为标准 , 相对环草石斛来说 , 菌株 117、 037对金
钗石斛表现出更为显著的促生效应 , 菌株 120对环
草石斛促生效应强 , 与金钗石斛 , 菌株 037对环草
石斛促生效应差异不明显 。
3 问题与展望
有关兰科植物与内生真菌之间的关系 , 需要进
一步从植物生理生态学的研究手段进行深入研究 。
内生真菌对兰科植物的作用是一种菌的作用 , 还是
多个菌的协同作用还有待于进一步深入研究。另
外 , 兰科植物内生真菌的分类鉴定对弄清兰科植物
的种类及进一步认识内生真菌对兰科植物的作用也
都具有重要意义 。
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