全 文 ：[ 2] 丁传林 ,吴旭东 , 金安娜 ,等 .β-胡萝卜素立体异构体对
环磷酰胺处理小鼠免疫功能的比较研究 [ J] .中国生化
药物杂志 , 1997, 18(1):19-21.
[ 3] 周永霞 ,张仲平 , 洪介民 .中药复感灵对环磷酰胺造型
小鼠免疫功能的影响 [ J] .广州中医药大学学报 , 1998,
15(2):129-130.
[ 4] 金丽琴 , 吕建新 ,李东 , 等.细脚拟青霉减轻环磷酰胺所
致免疫抑制效应的实验研究 [ J] .浙江医学 , 2001, 23
(4):216-217.
[ 5] LehnerT.SpecialregulatoryTcelreview:Theresurgence
oftheconceptofcontrasuppressioninimmunoregulation
[ J] .Immunology, 2008, 123(1):40-44.
[ 6] McgeeHS, AgrawalDK.TH2 celsinthepathogenesisof
airwayremodeling:regulatoryTcelsaplausiblepanacea
forasthma[ J].ImmunolRes, 2006, 35(3):219-232.
[ 7] WeiS, ShreinerAB, TakeshitaN, etal.Tumor-inducedim-
munesuppressionofinvivoefectorT-cellprimingismedi-
atedbytheB7-H1/PD-1 axisandtransforminggrowthfac-
torbeta[ J] .CancerRes, 2008, 68(13):5432-5438.
[ 8] AudiaS, NicolasA, CathelinD, etal.IncreaseofCD4 +
CD25+ regulatoryTcellsintheperipheralbloodofpatients
withmetastaticcarcinoma:aphaseIclinicaltrialusingcy-
clophosphamideandimmunotherapytoeliminateCD4 +
CD25+ Tlymphocytes[ J] .ClinExpImmunol, 2007, 150
(3):523-530.
[ 9] CondominesM, QuitetP, LuZY, etal.Functionalregula-
toryTcellsarecollectedinstemcellautograftsbymobili-
zationwithhigh-dosecyclophosphamideandgranulocyte
colony-stimulatingfactor[ J] .JImmunol, 2006, 176(11):
6631-6639.
收稿日期:2008-10-21基金项目:山东大学威海分校大学生科技创新项目(A08036)作者简介:许发龙(1987-),男,在读本科生;Tel:15063119915, E-mail:xfl 19@yahoo.cn。＊通讯作者:李裕强 , Tel:13455858719, E-mail:yuqiangl@sdu.edu.cn。
罗氏海盘车粘多糖的提取及其体外免疫调节作用
许发龙 ,李裕强＊ ,李菲菲 ,闫克芹 ,张 峰 ,陈申习
(山东大学威海分校海洋学院 ,山东 威海 264209)
摘要 目的:从罗氏海盘车体壁 、内脏中分别提取粘多糖 MP1和 MP2,测定其对正常小鼠脾细胞及皂苷作用后
的脾细胞免疫活性的影响。方法:罗氏海盘车内脏先经丙酮脱脂 , 根据正交实验分析确定最佳热水提取条件 ,然后
经热水提取 、去蛋白 、醇沉得内脏粘多糖 MP2。小鼠脾细胞体外培养并分为 5组:MP1组 、MP2组 、皂苷组 、MP1 +
皂苷组及 MP2+皂苷组 ,分别加入相应药物 , MTT法分别测定对脾细胞的体外增殖影响。 结果:不同浓度 MP1和
MP2对脾细胞均有一定的促进增殖作用 , 该作用随多糖剂量的升高先增高后降低;并不同程度地抑制皂苷的细胞
毒作用 , 终浓度为 25 ～ 40 mg/mL的 MP2能逆转皂苷的细胞毒作用 , 其量效关系是以 40 mg/mL(P<0.01)为顶点
的抛物线。结论:MP1和 MP2均对正常小鼠的免疫功能有促进作用 , 且以后者效果明显;MP2具有显著的逆转皂
苷脾细胞毒作用。
关键词 罗氏海盘车;粘多糖;皂苷;免疫调节;细胞毒性
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2009)09-1421-05
ExtractsofMucopolysaccharidesfromAsteriasrolestoniand
ItsImmunoregulationEfectinvitro
XUFa-long, LIYu-qiang, LIFei-fei, YANKe-qin, ZHANGFeng, CHENShen-xi
(MarineCollegeofShandongUniversityinWeihai, Weihai264209, China)
Abstract Objective:TostudyimmunoregulationefectsonnormalpulpalcellsofthemucopolysaccharidesMP1 andMP2extrac-
tedfromAsteriasrollestonibodywalandviscera, respectively.Methods:Theorthogonaldesignwasemployedtoobtainthebestpossible
combinationofthecriticalparametersformucopolysaccharideMP2.MP1, MP2, glycosides, MP1 +glycosidesandMP2 +glycosides
wereaddedrespectivelyintopulpalcellsculturemediatotesttheireffectsonspleencellsproliferationsbyMTTassay.Results:MP1
andMP2couldcertainlyincreasetheproliferationofthenormalsplenocyteandinhibitglycosidescytotoxicity.Comparedwithcontrols,
MP2 reversedthecytotoxicityofglycosidesatconcentrationof25to40mg/mL, thegreatestactivityappearingatthedoseof40mg/mL
(P<0.01), whileMP1didn′treverseit.Conclusion:MP1 andMP2 canenhanceimmunityofnormalmice, andMP2 cansignificantly
reversesthecytotoxicityofglycosidesinvitro.
Keywords Asteriasrolestoni;Mucopolysaccharides;Saponins;Immunoregulation;Cytotoxicity
·1421·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 32卷第 9期 2009年 9月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.09.051
多糖作为广谱的免疫促进剂 ,在抗肿瘤 、抗病毒
以及抗衰老等方面具有独特的功效 ,且对机体细胞
无直接细胞毒作用 〔1〕。海洋动物多糖如鲨鱼软骨
多糖 、海参多糖等的活性已得到较深入的研究 。罗
氏海盘车(Asteriasrolestoni)是一种传统中药 ,有清
热解毒 、抗疲劳及抗肿瘤等作用 ,其中皂苷生物活性
研究成果丰富 〔2, 3〕 ,但海星粘多糖(mucopolysaccha-
ride)类活性物质的研究很少。本实验从新鲜罗氏
海盘车体壁中分别提取体壁粘多糖 MP1与皂苷;内
脏中提取内脏粘多糖 MP2,并进一步分析内脏粘多
糖的最优提取工艺 ,探讨罗氏海盘车粘多糖的体外
免疫调节作用及其对皂苷细胞毒作用的逆转活性 ,以
期为海星资源的综合开发利用提供一定的实验依据。
1 材料与仪器
1.1 原料 新鲜罗氏海盘车 ,采自威海小石岛海
域 ,腕长 8 ～ 10 cm,剖开后分为罗氏海盘车体壁部
分和内脏部分 ,分别于 -18 ℃冻存备用 。
1.2 实验动物 6 ～ 8周龄雄性清洁级健康 Balb/
c小鼠 ,体质量 18 ～ 22 g,由山东大学威海分校动物
中心提供。
1.3 主要试剂 RPMI-1640培养基(添加 HEPES、
青霉素和链霉素 , InvitrogenCorporation),新生牛血
清(杭州四季青生物工程材料研究所), MTT(Sigma),
二甲基亚砜(Amresco),其余试剂均为国产分析纯 。
1.4 主要仪器 真空旋转蒸发仪(上海亚荣玻璃
仪器有限公司),大型冷冻离心机(日本日立),台式
高速离心机(上海安亭科学仪器厂),酶标仪(瑞士
TECAN), CO2培养箱(SANYOElectricCo., Ltd),倒
置显微镜(重庆光电仪器总公司)。
2 方法
2.1 罗氏海盘车内脏粘多糖 MP2的制备
2.1.1 最佳提取条件的确定:新鲜的罗氏海盘车
内脏 ,加入等量的丙酮 ,搅拌使之与丙酮充分接触 ,
静置 30 min,弃上层丙酮 ,反复几次 ,最后将丙酮减
压挥干 。采用热水提取 ,由于多糖的分离与提取次
数 、提取温度 、提取时间及加水量密切相关 ,为确定
最佳提取条件 ,本实验选用 L9(34)正交表进行正交
实验 , 用改良的苯酚 -硫酸法测定各组的多糖含
量 〔4〕 ,以多糖收率为考察指标 ,因素水平见表 1。
表 1 内脏粘多糖提取因素水平表
水平 A次数 /次 B温度 /℃ C时间 /h D溶解量 /(mg/g)
1 1 60 4 15
2 2 70 5 20
3 3 80 6 25
2.1.2 去蛋白与醇沉:调整罗氏海盘车内脏提取
液 pH=6.5,加入 1%的中性蛋白酶 , 50 ℃搅拌过
夜 ,酶解完毕后 ,水浴 90 ℃加热 15 min使酶失活 ,
5 000 r/min离心 15 min;取上清液 ,加人 5%双氧水
脱色 ,加入量约为样品液体积的 1/8, 55 ℃保温至溶
液变为浅黄色;将脱色后的溶液浓缩至合适体积 ,按
1∶4加入 95%乙醇 , 5 000 r/min离心 30 min,取沉淀
溶于适量蒸馏水中 , 水浴 60 ℃,使其充分溶解 ,将
pH调至 6.5,加人 1%枯草杆菌中性蛋白酶 , 50 ℃
搅拌过夜 ,酶解完毕后 ,水浴 90 ℃加热 15 min使酶
失活 , 5 000 r/min离心 15 min;酶解后的提取液反
复用 Sevag试剂(氯仿∶正丁醇 =4∶1)去蛋白质至氯
仿与水之间的界面无沉淀为止。将去蛋白后的多糖
提取液减压浓缩至适当体积 ,缓缓加入 4倍体积的
无水乙醇 , 4 ℃放置过夜 ,离心收集沉淀 ,五氧化二
磷真空干燥得内脏粘多糖 MP2,置 -20 ℃下保存备
用。
2.2 罗氏海盘车体壁粘多糖和皂苷的提取 参见
潘广昌等〔5〕海星体壁多糖分离纯化方法和张铮
等〔6〕的水溶性海星皂苷提取方法。
2.3 糖含量和蛋白质含量测定及皂苷性质鉴定
用苯酚-硫酸法 〔4〕测定总糖含量 ,用考马斯亮蓝法
(Bradford法)〔7〕测定蛋白质含量;参照张继杰〔8〕的
方法进行海星皂苷粗品鉴定实验:泡沫试验 、沉淀反
应 、Molish反应 、LibermannBurchard反应 。
2.4 试剂配制 精确称量 MP1、MP2各 400 mg、海
星皂苷 5 mg、ConA0.5 mg,分别溶于 Hanks液中定
容至 10、10、100、100 mL,配制成 40、40、0.05、0.005
mg/mL的溶液 ,经 0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后 4
℃保存备用。
2.5 MP及皂苷对脾细胞的增殖作用 常规制备
脾细胞悬液 ,用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养
基调整细胞浓度为 2 ×106 cfu/mL,并在 96孔培养
板中每孔加入 100 μL脾细胞悬液 。粘多糖 MP1与
MP2组均采用 5、10、20 mg/mL3个剂量;皂苷组采
用 5、20、50 μg/mL3个剂量 ,同时设空白对照孔(脾
细胞加 Hanks)。每种药物均设 6个复孔 ,震荡混匀
后 ,置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养 72 h。中止
培养前 4 h,每孔加入 MTT〔9〕 10 μL(5 mg/mL),混
匀后继续培养 4 h。培养结束后小心吸弃上清 ,每孔
加入 150 μL二甲基亚砜 ,振荡 10 min使紫色结晶
完全溶解 ,以调零复孔调零 ,酶标仪测定 570 nm波
长处的光密度 D(λ)值 ,计算增殖指数或抑制指数。
增殖指数 =D(λ)刺激孔D(λ)对照孔 -1…[ D(λ)刺激孔 >D(λ)对照孔 ] (式 1)
·1422· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 32卷第 9期 2009年 9月
抑制指数 =1-D(λ)刺激孔D(λ)对照孔…[ D(λ)刺激孔
增殖作用 方法同 “2.5”项 , MP1 +皂苷组与 MP2
+皂苷组均设 7个实验组 , 96孔培养板中脾细胞终
浓度为 1 ×106 cfu/mL,皂苷剂量均为 20 μg/mL,
MP1在各组中的剂量依次为:5、10、20、30、50、70、80
mg/mL, MP2在各组中的剂量依次为:5、10、20、25、
30、40、50 mg/mL。按式 1及式 2计算脾细胞增殖
及抑制指数 。
2.7 统计学处理 实验数据用 SPSS10.0统计软
件统计分析 。
3 结果
3.1 正交试验 结果如表 2、3所示 ,由极差值 R
和方差分析可看出影响多糖产率的因素顺序依次为
提取溶剂用量 >提取温度 >提取次数 >提取时间 。
由实验结果确定海星内脏粘多糖的最佳提取条件为
A2B2C3D1,即 15倍水 , 70 ℃提取 6 h,提取 2次 。
表 2 正交试验的直观分析结果
试验号 A B C D 多糖产率 /(mg/g)
1 1(A1) 60(B1) 4(C1) 15(D1) 19.28
2 1(A1) 70(B2) 5(C2) 20(D2) 25.78
3 1(A1) 80(B3) 6(C3) 25(D3) 13.62
4 2(A2) 60(B1) 5(C2) 25(D3) 11.34
5 2(A2) 70(B2) 6(C3) 15(D1) 38.53
6 2(A2) 80(B3) 4(C1) 20(D2) 25.16
7 3(A3) 60(B1) 6(C3) 20(D2) 24.49
8 3(A3) 70(B2) 4(C1) 25(D3) 16.52
9 3(A3) 80(B3) 5(C2) 15(D1) 30.86
PⅠ 19.56 18.37 20.32 29.56 -
PⅡ 25.01 26.94 22.66 25.14 -
PⅢ 23.96 23.21 25.55 13.83 -
R 5.45 8.57 5.23 15.73 -
表 3 正交试验的方差分析
变量来源 平方和 自由度 均方 F P
A 50.14 2 25.07 0.336 P<0.05
B 110.87 2 55.44 0.743 P<0.05
C 41.13 2 20.57 0.275 P<0.05
D 394.98 2 197.49 2.646 P<0.05
3.2 粘多糖中总糖含量 、蛋白质含量结果 苯酚-
硫酸法测得 MP1中多糖含量为 78.6%, MP2为
70.9%;考马斯亮蓝法测定 MP1 蛋白质含量
1.87%, MP2为 1.44%。
3.3 海星皂苷粗品皂苷性质鉴定结果 泡沫实验
中产生的泡沫可持续 12 h以上 ,且不因加热而消
失 ,沉淀反应中有白色沉淀产生 , Molish反应中液层
交界产生紫红色环 , 均说明有皂苷类物质存在;
LibermannBurchard反应中反应液先后发生了黄 -
红-紫的颜色变化 ,最后褪色 ,说明样品中存在的皂
苷主要为甾体类皂苷。
3.4 MP和皂苷对脾细胞增殖的影响 结果如表
4所示 ,在体外培养条件下 ,罗氏海盘车粘多糖对正
常小鼠的免疫均有促进作用 ,表现为随多糖剂量的
增加脾细胞增殖指数先升高后降低 ,内脏多糖 MP2
增殖作用更加明显 ,且 MP1和 MP2单用同与 ConA
联合使用对脾细胞增殖指数无明显影响。 MP整体
在 10 mg/mL时增殖活性显著(P<0.01),表明海星
粘多糖有体外免疫活性 ,且 MP2各剂量组对应的脾
细胞增值指数均明显高于对应的 MP1组。皂苷组
表现为抑制指数随皂苷剂量增加而增加 ,在 20、50
μg/mL对脾细胞毒作用显著(P<0.01),在 20 μg/
mL处接近 50%的抑制率。表明皂苷对脾细胞有显
著的细胞毒活性 。MP1与 ConA联合使用 ,在 5、20
mg/mL脾细胞增殖指数比单用略好 ,在 10 mg/mL
比单用整体效果略差;MP2与 ConA联用比单用增
殖指数整体略差。
表 4 MP和皂苷对脾细胞的增殖作用( x±s, n=6)
组别 剂量 /(mg/mL) D(λ)570 增殖指数 抑制指数
Hanks 0 0.325±0.022 0.00 -
MP1 5 0.371±0.012＊ 0.14 -
10 0.429±0.006＊＊ 0.32 -
20 0.348±0.014 0.07 -
MP2 5 0.475±0.008＊＊ 0.46 -
10 0.612±0.037＊＊ 0.89 -
20 0.405±0.007＊ 0.25 -
皂苷 5μg/mL 0.253±0.038 - 0.22
20μg/mL 0.172±0.018＊＊ - 0.47
50μg/mL 0.029±0.006＊＊ - 0.91
ConA 0 0.415±0.021 0.00 -
MP1+ConA 5 0.481±0.039＊ 0.16 -
10 0.535±0.010＊＊ 0.29 -
20 0.473±0.016 0.14 -
MP2+ConA 5 0.548±0.022＊＊ 0.32 -
10 0.776±0.025＊＊ 0.87 -
20 0.502±0.019＊＊ 0.21 -
注:与空白比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3.5 MP1+皂苷组和 MP2 +皂苷组对脾细胞增殖
的影响 结果如表 5所示 , 皂苷组与 Hanks组
D(λ)570值比较差异显著 ,表明皂苷有显著的细胞毒
作用 。MP1、MP2均有一定程度的抑制皂苷对脾细
·1423·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 32卷第 9期 2009年 9月
胞毒作用 ,其作用均随多糖剂量增加先上升而后下
降 ,后者的活性更加显著 ,其量效关系是以 40 mg/
mL为顶点的抛物线 ,终浓度为 25 ～ 40 mg/mL能逆
转皂苷的细胞毒作用 ,与 Hanks组比较差异显著 ,说
明在此浓度范围内 MP2能显著提高脾细胞增殖活
力 。MP1在 70 mg/mL时脾细胞抑制指数最低 ,但
仍不能逆转皂苷的细胞毒作用 , MP2在 20 mg/mL
时就已经基本消除了皂苷的细胞毒作用 ,在 40 mg/
mL时增殖指数最高 。
表 5 MP+皂苷对脾细胞的增殖作用( x±s, n=6)
组别 剂量 /(mg/mL) D(λ)570 增殖指数 抑制指数
Hanks - 0.325±0.022 1.00 -
皂苷 20μg/mL 0.172±0.018＊＊ - 0.47
MP1+皂苷 5 0.084±0.007＊ - 0.51
10 0.089±0.008＊ - 0.48
20 0.093±0.004 - 0.46
30 0.105±0.024 - 0.39
50 0.129±0.006 - 0.25
70 0.153±0.011 - 0.11
80 0.117±0.018 - 0.32
MP2+皂苷 5 0.098±0.009＊ - 0.43
10 0.122±0.020 - 0.29
20 0.191±0.004 1.11 -
25 0.280±0.009＊ 1.63 -
30 0.337±0.055＊＊ 1.96 -
40 0.327±0.005＊＊ 1.90 -
50 0.217±0.027 1.26 -
注:与空白比较 , ＊P<0.05, ＊＊ P<0.01
4 讨论
经验证影响海星多糖产率的因素顺序依次为提
取溶剂用量 >提取温度 >提取次数 >提取时间 。棘
皮动物中糙海参多糖产率的影响因素为提取溶剂用
量 >提取温度 >酶用量 >提取时间〔10〕 ,海胆中影响
海胆黄多糖产率的因素顺序为提取温度 >提取次数
>提取时间 >提取溶剂用量 〔11〕。提取温度是影响
海洋活性物质提取产率及活性的重要因素 ,从初步
的实验结果来看在相同的提取温度下海星内脏多糖
及海参多糖的产率与活性均要优于海胆黄多糖 。
去除多糖中蛋白质的方法有很多 ,其中以 Sevag
法最为常用 ,但对含有大量的蛋白质脏器 ,单纯用
Sevag法去蛋白效果较差 ,本实验采用双酶解法与
Sevag法相结合的方法去蛋白效果令人满意 ,得到的
体壁和内脏多糖粉末可溶性良好 ,且纯度较高 。
罗氏海盘车的体壁粘多糖 MP1和内脏多糖
MP2对正常小鼠脾细胞的增殖均有促进作用 ,其作
用随多糖剂量增加先升高后降低 ,且 MP2的效果显
著优于 MP1,说明 MP1和 MP2均具有有丝分裂原
作用 。
MP1和 MP2均可在一定程度上抑制皂苷对脾
细胞毒作用 ,在剂量达到一定程度后促增殖活性下
降 , MP2的抑制皂苷细胞毒作用明显 ,在较低剂量
就可以完全逆转皂苷的细胞毒作用 ,在 40 mg/mL
脾细胞增殖活性最高 ,随后降低 。表明其对脾细胞
的促增殖作用有最适剂量 ,而非越高越好。
多糖作为广谱的免疫促进剂 ,在抗肿瘤 、抗病毒
以及抗衰老等方面具有独特的功效 ,其不同于其它
抗肿瘤药的重要优点为对机体细胞无直接细胞毒作
用〔1〕。在本实验中 MP2有较好的逆转皂苷对小鼠
脾脏细胞毒作用 ,而 MP1仅微弱的抑制了其细胞毒
作用 ,表明特定的多糖可以与对正常有细胞毒作用
的肿瘤药物联合使用 ,可以体外消除后者对正常细
胞的损伤 ,其具体机制有待探索。
参 考 文 献
[ 1] 张天民 , 冯优 , 王凤山 , 等 .多糖类药物的研究进
展 [ J].中国生化药物杂志 , 2008, 29(2):129-139.
[ 2] 张金鼎 .海洋药物与效方 [ M] .北京:中国古籍出版
社 , 1998:192-199.
[ 3] 韩力挥 ,袁文鹏 , 丛日山 ,等 .海星生物活性物质研究进
展 [ J] .海洋湖沼通报 , 2006, (2):106-107.
[ 4] 董群 , 郑丽伊 ,方积年 .改良的苯酚-硫酸法测定多糖和
寡糖含量的研究 [ J] .中国药学杂志 , 1996, 31(9):550-
553.
[ 5] 潘广昌 , 郭承华 ,刘传琳 .砂海星酸性粘多糖的分离纯
化 [ J] .烟台大学学报(自然科学与工程版), 2007, 20
(2):108-112.
[ 6] 张铮 .罗氏海盘车(Asteriasrolestoni)水溶性海星皂苷
的分离纯化及其部分生物学活性研究 [ D] .青岛:中国
海洋大学 , 2008:19-20.
[ 7] 陈钧辉 , 陶力 ,李俊 , 等 .21世纪高等院校教材 ·国家
理科基地教材-生物科学系列 -生物化学实验 [ M] .第 3
版 .北京:科学出版社 , 2003:63-34.
[ 8] 张继杰.天然药物化学 [ M] .第 3版.北京:人民卫生
出版社 , 1997:154-158.
[ 9] 王楠 , 汤仲明 .MTT方法测定培养细胞抗药水平的评
价 [ J] .中国药理学通报 , 1996, 9(1):78-81.
[ 10] 王洪涛 , 付学军 ,申京宇 ,等.海参多肽 、多糖综合提取
工艺条件的优化 [ J] .食品与生物技术学报 , 2006, 25
(6):83-87.
[ 11] 刘纯慧 ,奚涛 , 林亲雄 .海胆黄多糖的分离 、纯化及免
疫活性测定 [ J] .中国海洋药物杂志 , 2006, 25(3):7-
11.
·1424· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 32卷第 9期 2009年 9月