全 文 ：竿 n卷 第 4 期
1 9 9 2 年 7 月
巾国公共卫生学报
C h i n韶 e J OU rna l of P ub l ie H e a l th
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2 3 9
黄根抗石棉尘肺泡巨噬细胞毒性的研究
北京市劳动卫 生职业病防治研 究所 ( 1 0 0 0 2 。 ) 吴立军 谭 佳红 王菊庭
提 要 应用体外培养和扫描电镜技术探讨黄根抗石棉粉尘的细胞毒作用及主要作用方式 。 结果表
明: 黄根对兔肺泡巨噬细胞 (P A M )未显示明显毒性 , 经黄根孵育过的 P A M再与石棉粉尘作用时 , 县刚 ` -
程度明显减轻 , 培养液中 L D H 活性仅是直接与石棉尘作用组的 5 1 . 6 8% 。 提示黄根能在一定程度」.七
强P A M抗石棉尘毒性的能力 , 进而减轻了 P A M 自 身的损伤 。 本实验为石棉肺的预防性给药提供了参
考。
关链词 黄根 石棉尘 肺泡巨噬细胞毒性
吸入肺内的石棉粉尘损 伤肺饱 巨 噬 细 胞
P A M是石棉肺发病的始动环节 。 设法阻断这个
环节 , 保护 P A M 免遭粉尘损害是寻找预防石
棉肺药物的重要途径 。 据报道 : 中草药黄根 治
疗矽肺具有一定疗效 ` ” ,体外溶血试验表明黄
根能抑制石英和温石棉的溶血作用 , 而且抗温
石棉的溶血作用比抗石英的作用 要 强 ` 2 ’ 。 本
实验通过计台盼蓝着色率 , 观察细胞形态变化
和测定乳酸脱氢酶 ( L D H ) 活性 , 观察黄根对温
石棉粉尘所致 P A M损伤的影响及影响的环节 。
1 材料与方法
1
。
1 粉尘来源与悬液制备 粉尘 : 四川石
棉矿的温石棉 ( 1 0~ 1 0 0“ m 占 4 5 % ) 。 石棉尘悬
液 : 石棉粉尘 + 培养液 ( 含 0 . 5 % 乳 蛋 白的
H an k
/ s液 ) , 搅拌 z一 Z h , 浓度 0 . 6m g /m l 。
经黄根孵育的石棉尘悬液 : 石棉粉尘 十 含20 %
黄根液的生理盐水 , 搅拌 , 37 ℃ l h , 生理盐水
洗去药液 , 用培养液配成 0 . 6m g /m l 。
1
.
2 黄根液 黄根浸膏粉 (广西制药厂提
供 ) 0 . 8 42 9 + 生理盐水 40 m l , 持续搅拌 、 浸泡
2 天使药物充分溶解 , 滤过消毒备用 。 经 X -
荧光 自动分析仪测定内含铝 、 钾 、 锰 、 锌 、 硫 、
铁 、 钙 、 磷等多种离子 。
1
.
3 P A M 的收集与培养 取雄性成年家
兔 (2 ~ 3 k g) 肺 脏 , 离体以生理盐水 反 复灌
洗 , 收集灌洗液 离心 ( z s o o r / m切 ) i om访 , 弃
上清 , 生 理 盐水洗 1 遍 , 用含 0 . 5 % 乳蛋白的
吴立军 女 1。招年 5 月生 助理研究员
H an k
了 s 液配成细胞悬液 (2 x 1 0 “ /m l) , 以每
孔 l m l 接种于 2 4孔培养板 中 (孔底部放有 l x
z e m小玻片 ) , 于 3 7℃ 5 % C O Z培养箱中 Zh , 弃
培养液 , 用生理盐水洗 3遍 , 按分组加入相应
的粉尘或黄根液 。
1
.
4 分组 培养细胞分 5个实验组 : ( 1) 正
常对照组 : 只加培养 液 ; ( 2 )黄 根 组 : 加 含
10 %黄根液的培养液 , ( 3 )石棉尘组 : 加石棉
尘悬液 , o . 3m g /孔 ; ( 4 )黄棉尘组 : 加经黄根
孵育的石棉尘悬液 , o . 3m g /孔 , ( 5) 经黄根孵
育的 P AM与石棉尘作用组 (简称黄 P AM组 ) :
与黄根组同样处理的 P A M培养 Z h后 , 洗去含
有黄根的培养液 , 加入与 ( 3 )组剂量相同的石
棉尘悬液 。 各组均设平行孔 , 共培养 lZ h (黄
P A M组加尘后 的培养时间与前 4 组同 ) ,
1
.
5 观察指标 ( 1 )计细胞着色率 : 台盼
蓝染色 ,标志细胞膜通透性的异常 。 ( 2) 细胞形
态 观察 : 光镜 、 扫描电镜 。 ( 3 )培养液中乳酸
脱氢酶 ( L D H ) 活性测定 : 采用 2 , 4一二硝基苯
肪比色法 。
1
.
6 扫描 电镜标本的制备 将 各 组 贴 有
P A M 的玻片置 2 . 5% 戍二醛溶液和 1%饿酸中
各固定 l h , 充分洗去固定液后 2% 揉酸处理
l h
, 1% 饿酸再作用 l h 。 每一步 骤中间均用磷
酸缓冲液 ( 1 / 1 5M , p H 7 . 2) 浸洗 3 次 以上 。 经
乙醇梯度脱水 , 醋酸异戊醋置换 乙醇 , C O : 临
界点干燥和离子溅射喷金制成 。 在 J SM 一 35 C
型扫描电镜下观察 。
中国公共卫生学报 l r卷
2结果
2
.
1光拉形态特点 正常对照组细胞多为
园形 , 边缘光滑清晰 , 大小均匀 , 透亮 , 着色
率 2一 10 % 。 黄根组细胞大小不匀 , 形状不一 ,
但仍透亮 , 边缘清晰 , 着色率 5~ 15 % 。 石棉
尘组细胞聚集 , 轮廓模糊 , 边缘不 整 , 部 分
呈碎片状 , 着色细胞增 多 , 着 色 率 4 0~ 50 %
(图 1 ) 。 黄棉尘组变化与石棉尘组和似 , 并且轮
廓模糊细胞增多 , 着色率 50 ~ 6 0% 。 黄 P A M
姐除少部分细胞轮廓不清并着色外 , 大部分为
不着色 、 完整 、 透亮 、 边缘情晰的细胞 , 与对
照组细胞形态相似 , 仅胞体略小 , 着色率 30 一
4 0% ( 图 2 ) 。
图 3 经石棉尘作用的肺泡巨噬细胞 ( 2 50 又 )
图 1 石棉尘组肺泡巨雇细胞
图 2 黄 P AM组肺泡巨噬细胞
2
.
2 扫描 电镜形态特点 ( 图 3 , 4 ) 正常
对照组细胞大多为有立体感 的球形 , 表面布满
短而钝的指状突起或花瓣样的小片状皱褶 , 有
的表面还附有一些小饱 ,伸出一些丝状 、 刺状或
扫帚状的 伪 足 贴 附于玻片上 。 黄根组细胞仍
以球形为主 , 胞体完整 ,但表面的突起和皱褶减
少或皱缩 , 甚至消失 , 出现隆起的泡状结构 。
石棉尘组细胞普遍失去 P A M 多皱褶的表面结
构特征 , 许多细胞呈明显破裂或缺损 。 黄棉尘
图 4 先经黄根孵育再与石拍尘作用
的肺泡巨噬细胞 ( 2 50 0 X )
组细胞破损状况似石棉尘组 , 偶有细胞表面结
构消失 , 变光沿 , 不规则 。 黄 P A M 组见大部
分细胞仍保持多皱褶的球形 , 仅表面丝状伪足
增多 、 变长 , 还可见吞入粉尘 的细胞不但未破
且表面形态仍基本正常 。
2
.
3 培养液 中 L D H 活性侧 定结果 ( 附表 )
附表 各实验组培养液中L O H活性 (单位 / I OOm l)
组 别 样品数 X 士 S D 与对照组相比 (% )
正常对照组 l a 1 4 0 士 5 3 。 2 9 1 00
黄 根 组 1 2 0 1 士 3 4 。 2 1 6 5
石 棉 尘 组 1 6 3 8 7 土 5 6 。 。 4 2 76 。 4 3
黄 棉 尘 组 1了 哎5 4 士 1 1 5 . 9 9份 3 24 . 2。
黄 P AM 组 1魂 2 0 0 士 2 0 . 0 2赞份 1 4 2 . 8 6
甘 黄棉尘组与石棉尘组 间差异 : P > 。 . 0 5
柑 黄 P A M组与石棉尘组间差异 : P < 。 . 01
从结果可以看出本实验的细胞形态观察和
培养液中 L D H 活性测定的结果是一致的 : 对
`照组细胞形态大多正常 , 活性好 ,着 色率 10 %左
右 , L D H 活 性较低 ; 黄根组的细胞有变形 ,
表面皱褶减少 , 但很少破损 , 着色率仅较对照稍
4期 黄根抗石棉尖肺泡巨噬细胞毒性的研究
高 , L D H测定值较对照还低 , 无显著性差异 ;
石棉尘组的细胞则普遍失去正常 P A M 的表面
形态特征 , 有明显破裂和缺损 , 着色率达 50 %
以上 , 外漏的 L D H升高 , 为对照的2 7 6 . 5 4% ;
黄棉尘组细胞损 伤的程度 与 石 棉 尘组相似 ,
L D H 为对照的 3 24 . 29 % , 石棉尘组与黄棉尘
组之间无显著性差异 ( P > 0 . 05 ) ; 黄 P A M组大
部分细胞仍保持正常多皱褶的球形 , 甚至吞入
粉尘后仍墓本正常 , 外漏的 L D H 低 , 仅为同
剂量石棉尘组的 5 1 . 68 % , 有非常显著性差异
( P < 0
。
0 1 )
。
3 讨论
P A M 表 面形态 的变化反映了细胞膜和细
胞功能的变化 , 结合 L D H 外漏情况综 合分析
可以评价细胞膜的损伤状况 。 培养液中加入黄
根能使 P A M发生变形 , 但不造成 P A M的明显
损伤 , 结合 L D H 降低趋势来分析 , 这种变形
很有可能是暂时的 , 是可复性的 , 说明黄根本
身对 P A M 毒性不大 。 经黄根孵育过的石棉尘
(黄棉尘组 ) 对细胞的毒性 , 无论是形态改变
还是 L D H侧定都与石棉尘组相似 , 未见降低 ,
说明黄根不能降低石棉粉尘的 P A M 毒性 。 而
经黄根孵育过的 P A M 再与石棉尘作用时 (黄
P A M组 ) ,遭损伤的细胞数减 少 ,接触和吞入石
棉粉尘的巨噬细胞均基本保持正常 P A孙1 的形
态特征 , L D H也明显降低 , 仅是同剂量石棉尘
组的5 1 . 6 8% , 差 异非常显著 ( P < 0 . 01 ) , 说明
P A M 的损伤程度明显减轻 , 提示 黄 根 先 与
P A M 共孵时增强了 P A M 抗石棉尘损 仿的能
力 。
黄根对细胞的保护作用是因其成分中的铝
与 51 0 : 结合 , 改变了 51 0 : 表面结钩而降低其
毒性 ` ” “ ’ 。 但没有黄根治疗石棉肺的 研 究 报
道 。 本实验的结果说明黄根对 P A M 保护作用
不是通过作用于石棉尘 的表面结构来实现的 ,
而是黄根提高了 R气M 本身抗石棉粉尘损伤的
能力 , 这可能与石英和石棉损伤 P A M 膜的机
理不同有关 。 目前较多人认为石棉表面具有的
镁等金属元素引起纤维表面存在着 Z e t a 电位 ,
这种静电与细胞表面糖蛋 白 ( 如唾液酸 ) 的带
电基因相互作用 , 造成膜的 损 伤 “ ’ 。 黄根液
中含多种带正电荷的金属离子 , 有可能它先与
P A M 作 用时中和了细胞表面糖蛋白的电荷 ,
P A M 再 与石棉纤维作用时无法发生静电作用
而减轻了膜的损伤 。 也有可能是黄根液中的阳
离子与脂质双分子层上的磷酸基相互作用增强
了膜的稳定性 ` 5 ’ , 使 P A M再接触或吞噬石棉
尘时均不易破损 。 这种对细胞膜的直接作用比
改变粉尘降低毒性更具积极意义 。 以上结果为
黄根用于石棉肺防治提供了实验依据 。
石棉肺与矽肺的发病机理不尽相同 , 目前我
国还没有一种针对石棉肺的有效药物 。 本实验
的结果提示黄根有特异提高 P A M 抗石棉粉尘
损伤的作用有 , 可能成为一种防治石棉肺药物 。
参 考 文 姗
1 . 煤炭部 “ 黄 根治 疗矽肺 ” 协作组 。 黄根治疗矽 肺 鉴定
资料汇编 1 9 8 .6
2 . 陈宁蒙 , 等 . 黄根抗石英、 石棉 的溶血作用 。 卫 生 研
究 。 10 5 5 , 1 4 ( 忍 ) 。
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B OI hc e m i s t r y 19 了5 , 1 4 , 16 2
.
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