全 文 ：1任 3永年第之期 生物半杂志 总第2 1期
里() () . . . . .… , . 构菌原生质体的形成和子实体的产生 .(} .()二 .() . .()二毛甘 零寒 李委 警零 , . _ _ 。 . _ ~ 雯蓉.() .() 常榭枷娜娜榭.() 卿翎锄溯嘟嘲翎翎娜卿珠大慈 刘 住翎僻娜翎娜溯翎常 .() 娜常榭 .() .() 榭 .() 翎娜 .() 蓉
( 安徽大学生物 系 )
摘要 : 本文是报导构菌原生质体形成 、 再生和诱导产生子实体的方法 , 以及不同渗透压
稳定剂和培养基对原生质体再生的影响 。
引 言
七十年代以来 , 微生物学领域中的应用原生质体融合技术取得了很大成果 。 如 1 9 8 4年松
吉撒等用球拟酵母 ( T O r “ I O sP i “ ) 和毕氏酵母 ( iP c h i a ) 的原生质体融合 , 使长链二元酸产
量由每升 4 . 0克增至 3 4 . 8克 , 提高 8倍以上 。 利用原生质体融合使维生素 B , : 产量提高 5 4~ 67 5
倍 。 目前 , 我国在高等担子菌类原生质体融合方面的研究 , 尚未见有成功的报导 , 尤其是食
用菌原生质体融合的研究仅处在初级阶段 , 即原生质体的分离和再生阶段 。 笔者在这一方面
进行了研究 , 现将其研究结果报告如下 。
材料和方法 ( 一 ) 供试菌株 : 构菌 A U F 8 51 2 , 本校保存菌株 , 从安徽大学校园内 的 女
贞树桩基部分离得到 。
( 二 ) 渗透压稳定剂 : 蔗糖 、 硫酸镁 、 氯化钾和甘露醇 , 使用浓度均为 o . 6 M 。
(三 )工具酶 : 用广东微生物所提供的溶壁酶 ( L y w a l l z y m e ) , 使用浓度为每毫升 15 毫克 。
(四 )菌丝培养基 : 用下列四 种培养基 , 均为常规方法配制和灭菌 , 去琼脂后为液体培养基 。
土豆 20 , 萄葡糖 2 , 琼脂 2 。 6 。 5
麦芽糖 2 , 蛋白膝 0 . 2 , 酵母膏 .0 2 , 琼脂 2。 6 。 5
土豆 2 0 , 蔗糖 2 , 琼脂 2 。 6 。 5
阿拉伯糖 2 , 构菌浸汁 20 , 琼脂 2。 6 。 5
l
~全叁卜号 { ` ’
一 成岭含量 _件” ` {一竺一丫月乍丰 ~ .…{幕毕澳擎介鉴燮卜一一一 }一竺一卜竺军兰一一尸望色考卿华翌塑些 .塑色毕竺一
}一理华一卜篆理嘿黔孽呷匕一一一丰二三一
} A
F A
:
{
:吧性竺竺圣 反什 0 , 。 { “ ·
( 五 ) 再生培养基 : 用下列五种培养基 , 常规配制和灭菌 。
培养基代号 成份及含量 ( % ) P H值
P D 葡萄糖 2 , 蛋白陈 0 . 1 , 琼脂 0 . 2, 6
P S … 土豆 2 0 , 蛋 白` 。 · , , 琼月旨0 · 2 , 6
P M 棉籽搪 2 , 蛋 白陈 0 . 1 , 琼脂 0 . 2 , 6
P 鼠李糖 2 , 蛋 白陈 0 . 1 , 琼脂 0 . 2 , 6
P F { 构菌子实体 20 , 蛋 白陈 0 . 1 , 琼脂 0 . 2,
.
2 0
.
1 988年第 1期 生物学杂志 总第21 期
( 六 ) 诱导子实体培养基 : 阔叶木屑 07 % , 玉米粉 5% , 鼓皮 2 3% , 石膏粉 2% , 用等量
的 1口% 土豆什和 10 %棉籽壳浸汁拌匀 , 含水量达到 6 5% , P H值为 6 。 常规制作并灭菌 。
( 七 ) 实验方法
·九菌丝培养 :
( 1 ) 固体玻璃纸培养 : 将 _巨迷国种培养基 , 常规制备后倒入直径 9厘米的培养皿中 , 制
成平板 , 再将直径 8厘米灼灭菌玻璃纸复盖其上 , 三点式等距离接种构菌菌种 , 于 25 “ C 恒温
培养6一 7天。
( 2 ) 液体培养 : 常规方法制备不含琼脂的上述四种培养基 , 分装于 5 0 毫升三角瓶中 ,
每瓶装15 0毫升 , 灭菌后接种构菌菌种 。 于 25 “ C下恒温培养 7夭 , 每夭振 摇 5一 6次 , 过 滤 洗
涤收取菌丝体 。
2
. 原生质体的制备
( 1 ) 用固体玻璃纸法培养的菌丝体 , 将玻璃纸轻轻揭下 , 在装有 10 毫升酶液的 培 养皿
中荡洗下菌丝体 , 共洗下 3张 。 称重并计算出菌丝体湿重 。 用洗前重量减去洗后 重 量 , 即为
菌丝体湿重 。
( 2 ) 用液体培养的菌丝本 经过滤洗涤称重后放入 5毫升的酶液中 。
将上述两种方法取得的菌丝体 , 分别于 25 “ C 、 30 “ C 、 3 5 O C 、 40 “ C的条件下酶解 1 0分钟 、
3 0分钟 、 40 分钟 、 60 分钟 、 9口分钟和 1 20 分钟后 , 用 G Z号滤器滤去菌丝碎片 , 离心后再用 0 . 6
M的硫酸镁洗涤离心 ( 10 0 0 x g , 5分钟 ) 2一 3次 , 取样镜检 , 观察并计算原生质体 的 释 放
量 。
3
.原生质体的再生 : 把收集的原生质体分别放入 5种不同的再生培养基中 , 使每毫升 含
1 0
“ 个左右 。 滴一滴于载片上 , 用盖片轻轻压盖 , 置 25 “ C保湿培养 , 以随时取出观察 再生情
况 , 业计算再生率 。
再生率 = 一撬羲纂爵爵剔群酱蓦氰 · 1。。
4
. 子实体的产生 : 把常规制备的诱导培养基 , 分别装入 2 0 、 2 。毫米的大试 管 中 , 灭菌
后接种再生菌丝体 , 于 20 “ C无光恒温培养 10 天 , 再移入 5 ” C冷箱中存左_ ,天 , 取出于 l o O C和
自然光照 条件下 3一 5天即产生子实体 。
结果与讨论
( 一 ) 酶解温度 、 时间和稳定剂的选择
用四种稳定剂 , 在 30 “ C温度下分别酶解 30 分钟 , 镜检观察结果以0 . 日M硫酸 镁 效 果 最
好 , 每视野原生质体数达到 31 个 , 一甘露醇次之 , 每视野 17 个 , 而氯化钾和蔗糖分别为 1 个和
9个。再以硫酸镁作稳定剂 , 在不同温度和不同时伺进行酶解卜 结果如表 1和图 1所示 。 在 35 O C
条件下酶解 40 ~ 60 分钟时的原生质体产量最高 。
( 二 ) 培养基成份和培养方法对原生质体产量的影响 。
皿种不伺谙养基 , 分别用固体和浪体墙养所获得的菌丝体 , 在 35 “ C条件下 酶 解 60 分 钟
的结果见表 2 , 其中以 A F A培养基释放的原生质量最高 , 此外培养方法对原生质体产 量 ; 影
响也十分明显` 固体玻璃纸培养法有助于原生质休形成 , 并且得到的菌丝体比较纯净 , 不必
1 9 85年第 l 期 生物学杂志 总第 21 期
经过离心洗涤等复杂操作 。
图 1 . 53 O C、 酶解 60 分钟的原生质体
( 6 00 X )表 1 . 酶解时间和温度与原生质体产量的关系
原生质俨咒 2 5 3 0 35截执
3 0 3
。
1 x 1 0 1 l
。
1 又 1 0 3 5 。 1 x 1 0 4 4。 1 x 1 0 2
6 O 3
。
3 x 1 0 1 4
。
7 x 1 0
吕 3 。 7 x 1 0 “ 3。 7 x 1 0 3
9 0 3
.
3 x 1 0 1 3
。
1 x 1 0 5 3
。
5 X 1 0 “ 4 。 1 x 1 0 3
1 2 0 3
。
1 x 1 0 1 5
.
0 x 1 0 3 2
。
7 x 1 0 5 2
。
1 x 1 0 2
表 2 . 培养基成份和培养方法对原生质体产量的影响
ah
P D A M P Y A P S A A F A
固体玻璃纸法 3。 3 x 1 0 4 2 。 3 x 1 0` 1 。 7 x 1 0 5 3。 7 x 1 0 6
液体培养法 2 . 7 x 1 0 4 1 。 3 x 1 0 4 3。 3 x 1 4 4 3。 1 X 1 0 5
( 三 ) 再生培养基的选择
用 5种不同再生培养基和压片法于 25 O C条件下 , 结果如表 3所示 , 以 P F培养基的 再生率
最高 , P M培养基次之 。 说明构菌子实体和棉籽糖有促进原生质体再生的作用 。 但是与 其他
的低等真菌相比 , 担子菌的原生质体再生率是比较低的 , 本次实验结果构菌子实体和棉籽糖
等以促进原生质体再生 , 但最高也只有 5 . 1% 左右 。 我们认为找出有效的再生培养基仍 是 值
得重视 的问题 。
( 五 ) 子实体的诱导
再生菌丝体通过诱导后所产生的子实体形态如图2 。 所示 。 形态特征上未发现与 亲 株 差
异 , 但其解剖结构和生理特性是否与亲株相同 , 尚需进一步探讨 。
( 下转第 40 页 )
198 8年第 1期 生物学杂志 总第 2 1期
1
.取材 : 材料来源广泛 : 用培养法获得除了用洋葱外 , 还可运用麦类 、 谷类种子等培养
来获得 。 还有一种较好方法 : 挖取地栽的豆类 、 谷类等植物的根尖来获得 。 方法是以较大的
面积 、 深度把植株挖起 , 再细心地浸于水中洗去泥土 。 这样 , 从一株植株可剪取大量根尖 。
2
.实验所需的蒸馏水可 以用洁净的天落水代替 , 不会影响实验效果 , 因本实验需要大量
蒸馏水 , 对于一时找不到大量蒸馏水者可用此法做 。
3
.把洗去浮色的根放于蒸馏水中 , 蒸馏水不变兰 , 如再加入 C a C 1 2溶液马上变兰 。 增加
这一步骤 , 可加深学生记忆 , 提高实验效果 。
三 、 叶绿体中色素的提取和分离
1
. 把剪碎的植物叶片放入研钵中加少许二氧化硅和碳酸钙进行研磨 , 再 加 1毫 升左右的
丙酮 、 再迅速充分地研磨 。 加入丙酮的量应视叶片含水量多少而定 , 含水量多的 , 宜少加点
丙酮 , 以使滤液不致太稀 。
2
. 取干燥的定性滤纸 , 裁成长 12 厘米 , 宽 1厘米的纸条 , 一端对称地剪 去 两角 , 再把另
一端折成直角 , 以使层折液面到烧杯沿的高度稍大于折叠处到滤液细线处的长度为宜 。
3
. 如划滤液细线无毛细吸管 , 可用新的蘸笔来代替 。 蘸取滤液 , 划线 , 干后再划 , 重 复
多次 ( 五次或更多 ) 。 颜色越深 , 实验效果越好 。 另外 , 把得到的滤液放置片刻 , 让丙酮挥
发掉些 , 可使溶液浓缩 。
4
。 把上述处理好的滤纸条插入层折液中 , 把横的一边放于烧杯沿上 。 用培养皿盖把它压
住 , 使另一边垂直悬空地插入层折液中再使滤液细线刚好不及层析液面 。 这样可避免滤纸因
湿软而支持不住滑下 , 或层析液沿烧杯壁与滤纸的缝隙上升 , 直接扩散使色素不 能分离 , 得
不到实验结果 。
( 上接第 2 页 )
表 3 .不同培养基成份对原生质体再生的影响
培 养 基
!
再生率 ( % _ :
一一 -竺竺 ~一一 一 一里一一 一 -」一 ~ .1竺 一土一全i - -一}一竺翌 一— 一二 当3 - - - 一 }一 上尽一— 上一一一11. .1一 -一 }” 厂 …_ 5 · ` }
图 2 .诱 一导产生的子实体形态