全 文 ：关白附的 HPLC指纹图谱
王吓长2 ,刘静涵1＊ ,王　强2
1中国药科大学天然药物化学教研室 ,南京 210009;
2中国药科大学中药分析教研室 ,南京 210038
【摘　要】　目的:对东北产 10 个批号的关白附药材指纹图谱进行了比较。方法:应用 RP-HPLC 法 , Dia-
monsil C18色谱柱 ,流动相为 2 mg/mL浓度的庚烷磺酸钠水溶液(含 0.2%三乙胺并以 H3PO4调 pH 至 3.0)-乙
腈二元梯度洗脱 ,流速为 1.0 mL/min ,检测波长205 nm。结果:不同批号的关白附药材所含生物碱成分均得到
很好的分离 ,确定了指纹图谱中 10 个共有峰 , 共有峰峰面积之和均大于各总峰面积的 90%。结论:该方法可
用于关白附的真伪鉴别和质量评价。
【关键词】　关白附;指纹图谱;生物碱
【中图分类号】　R917　　【文献标识码】　A　　【文章编号】　1672-3651(2005)05-0294-04
【收稿日期】　2005-04-01
【基金项目】　国家 863项目“创新药物与中药现代化”重大专项
资助(No.2002AA223102)
【＊通讯作者】　刘静涵:教授 , Tel:025-83271328 , E-mail:Liujinghan
@vip.sina.com
　　关白附系毛茛科乌头属植物黄花乌头 Aconi-
tum coreanum (Lèvl.)Rapaics的块根 ,又名白附子 、
竹节白附 ,具有祛风痰 ,定惊痫 ,散寒止痛作用 ,主
治中风痰壅 ,口眼歪斜 ,癫痫 ,偏正头痛[ 1] ,为中医
临床常用中药之一。近代药理研究表明关白附中
主要有效成分关附甲素 、关附庚素 、关附壬素等生
物碱类成分具有抗心律失常 、抗炎和镇痛作用[ 2] ,
盐酸关附甲素注射液作为我国独创的新药 ,是迄
今批准进行临床试验的由我国研制的从天然产物
中开发第一个抗心律失常药物(按西药一类),现
经临床 I 、II、Ш期试验证明该药具有较独特的临
床抗心律失常效果。有关关白附指纹图谱的研究
目前尚未见文献报道 ,本实验对东北产 10个批号
的关白附药材进行了指纹图谱研究 。
1　仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪 ,DAD检测器。
乙腈(Merck公司 ,色谱纯),庚烷磺酸钠(百
灵威公司 ,色谱纯),磷酸(分析纯)、三乙胺(分析
纯),重蒸水。
对照品:关附胺醇(GFAA)、关附壬素(批号:
030517)、关附甲素(GFA)、关附 Z 素(GFZ)、关附
庚素(GFI)均为从关白附中分离制备得到 ,结构经
UV 、IR、MS 和 NMR鉴定;化合物经 HPLC 检测纯
度均达98.0%以上 。
药材:关白附 ,经沈阳药科大学吴维春教授鉴
定均为 Aconitum coreanum (Lèvl.)Rapaics ,见表1。
Table 1　Samples of Aconitum coreanum
No. Collection place Collection time
1 Xifen county , Liaoning(purchased) 2003.11
2 Xifen county , Liaoning(wild) 2002.07
3 Xifen county , Liaoning(cultured) 2002.07
4 Xifen county , Liaoning(wild) 2002.08
5 Xifen county , Liaoning(cultured) 2002.08
6 Xifen county , Liaoning(wild) 2002.09
7 Tieling county , Liaoning(wild) 2003.08
8 Tieling county , Liaoning(cultured) 2003.08
9 Taonan city , Jilin(cultured) 2003.10
10 Benxi county , Liaoning(purchased) 2003.12
2　方法与结果
2.1　色谱分析条件
Diamonsil C18色谱柱 ,流动相 A为 2 mg/ml浓
度的庚烷磺酸钠水溶液(含 0.2%三乙胺并以
H3PO4 调 pH 至 3.0),流动相 B为乙腈 ,采用梯度
洗脱 ,梯度程序见表 2 ,流速为 1.0 mL/min ,检测
波长 205 nm ,柱温 20 ℃,经过与空白实验进行比
较 ,所有组分在 60 min 内洗脱出柱 ,洗脱时间延
294　　Chin J Nat Med　Sep.2005　Vol.3　No.5 中国天然药物　2005年 9月　第 3卷　第 5期
长至 120min亦无其它色谱峰出现 ,见图 1。
Table 2　The gradient elute process of mobile phase
Time(min) A(%) B(%)
0 82 18
8 82 18
20 75 25
30 70 30
40 60 40
60 50 50
Fig 1　HPLC of Aconitum coreanum
2.2　供试品溶液的制备
取各批关白附药材粉末(10 ～ 20目)各2 g ,精
密称定 ,置 100 mL 具塞锥形瓶中 ,精密加入 1%盐
酸溶液 50 mL ,称定重量 ,超声 30 min ,放冷 ,再称
定重量 ,用 1%盐酸溶液补足减失的重量 ,摇匀 ,
经0.45μm 微孔滤膜滤过 ,取续滤液 ,即得 。
2.3　对照品溶液的制备
精密称取关附胺醇 、关附壬素 、关附甲素 、关
附Z 素和关附庚素对照品适量 ,加流动相使溶解
配制成一定浓度 ,作为对照品溶液 。
2.4　指纹图谱的建立[ 3]
2.4.1　测定方法　分别精密量取对照品溶液和
各供试品溶液 20 μL ,注入液相色谱仪 , 记录 60
min色谱图即得 。以关附甲素的色谱峰(s)的保
留时间和峰面积为 1 ,计算其它各峰的相对保留
时间和相对峰面积比值。
2.4.2　稳定性试验　取 8号药材的供试品溶液 ,
分别在0 ,2 ,4 ,8 ,16 ,24 h 进样 20 μL 检测 ,计算相
对保留时间和相对峰面积 ,结果表明 ,供试品的指
纹图谱在 24h 内基本稳定 ,各色谱峰相对保留时
间的 RSD均在 1.0%以下 ,相对峰面积的 RSD为
2.4%～ 4.5%。
2.4.3　精密度试验　取 8号药材的供试品溶液 ,
连续重复进样 6 次检测 ,计算相对保留时间和相
对峰面积 ,结果表明 ,各色谱峰相对保留时间的
RSD均在1.0%以下 ,相对峰面积的 RSD为 1.7%
～ 3.5%。
2.4.4　重复性试验　取 8号药材 5份 ,分别制备
成供试品溶液 ,进样检测 ,计算相对保留时间和相
对峰面积 ,结果表明 ,各色谱峰相对保留时间的
RSD均在1.0%以下 ,相对峰面积的 RSD为 2.2%
～ 4.7%。
2.4.5　不同批号关白附指纹图谱的比较　10批
关白附药材测定结果见图 2 、表 3和表 4。根据结
果 ,比较各批样品的色谱图 ,确定了 10个共有峰
(见图 1),共有峰峰面积之和均大于各总峰面积
的 90%,10批关白附的共有峰的相对保留时间的
RSD均低于 1.0%,但是相对峰面积的比值有明
显不同 ,这也说明不同产地和采收时期对关白附
药材的化学成分均有影响 。
Fig 2　HPLC fingerprint for 10 batches of Aconitum core-
anum
2.4.6　关白附模式图谱的建立　利用中国药品
生物制品检定所的《中药色谱图分析和数据管理
系统》软件 ,对关白附指纹图谱的峰面积和峰高以
及全图谱进行匹配 ,以第 1批样品的 HPLC 图谱
为参照 ,计算 10批样品之间的相似度 ,结果见表
5 ,计算结果表明 10批样品在整体上相似 ,故以这
10批样品的相对峰面积和相对保留时间的均值
建立模式图谱 。
中国天然药物　2005年 9月　第 3卷　第 5期 Chin J Nat Med　Sep.2005　Vol.3　No.5　295　
Table 3　The relative retention times of common peaks for 10 batches of Aconitum coreanum
Sample
The relative retention times of common peaks
1 2 3 4 5(GFAA) 6 7(GFI) 8(s , GFA) 9(GFZ) 10(GFG)
Percent of common
peaks %
1 0.1825 0.1898 0.2317 0.3093 0.3424 0.6259 0.8251 1 1.2248 1.5651 91.46
2 0.1849 0.1918 0.2332 0.3107 0.3441 0.6246 0.8218 1 1.2246 1.5674 91.05
3 0.1846 0.1908 0.2333 0.3090 0.3426 0.6240 0.8215 1 1.2253 1.5689 90.11
4 0.1837 0.1910 0.2326 0.3088 0.3421 0.6223 0.8219 1 1.2271 1.5693 92.91
5 0.1836 0.1904 0.2328 0.3085 0.3414 0.6233 0.8224 1 1.2269 1.5680 96.35
6 0.1836 0.1907 0.2322 0.3091 0.3425 0.6240 0.8225 1 1.2251 1.5667 90.68
7 0.1836 0.1911 0.2329 0.3098 0.3431 0.6237 0.8226 1 1.2252 1.5671 96.33
8 0.1835 0.1902 0.2345 0.3103 0.3434 0.6246 0.8228 1 1.2247 1.5538 91.31
9 0.1834 0.1902 0.2335 0.3084 0.3424 0.6230 0.8224 1 1.2267 1.5698 90.85
10 0.1827 0.1903 0.2318 0.3083 0.3419 0.6232 0.8236 1 1.2262 1.5673 92.67
Average 0.1836 0.1906 0.2329 0.3092 0.3426 0.6239 0.8227 1 1.2257 1.5663 92.37
RSD% 0.4 0.3 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1 0 0.1 0.3 2.4
Table 4　The relative areas of common peaks for 10 batches of Aconitum coreanum
Sample
The relative areas of common peaks
1 2 3 4 5(GFAA) 6 7(GFI) 8(s ,GFA) 9(GFZ) 10(GFG)
1 4.8711 1.5946 1.3001 0.3992 0.3326 0.2314 0.7143 1 1.8899 0.2781
2 6.7937 2.2835 1.0496 0.2705 0.3197 0.0362 0.6246 1 2.3195 0.7639
3 10.6745 3.6972 4.2813 0.9841 2.9511 0.8102 2.8534 1 4.4435 0.7972
4 14.2638 5.3795 4.1077 1.4486 0.7740 0.3930 1.4769 1 5.2990 1.5829
5 12.7215 5.3679 5.9232 0.7405 0.9807 0.7032 2.9983 1 4.6023 0.9696
6 6.1262 1.8850 1.1630 0.4232 0.2019 0.3722 0.6360 1 2.2640 0.4853
7 6.2559 2.8770 2.6595 0.3916 0.3482 0.3436 1.0841 1 3.2047 0.5350
8 6.0702 2.7827 3.8568 0.4972 0.0623 0.5679 1.4586 1 3.4201 0.0397
9 13.1603 3.3659 4.8954 0.7253 0.2105 0.7235 2.5087 1 4.3300 0.0232
10 4.5219 1.8477 1.4137 0.3462 0.6258 0.2520 0.7859 1 2.3646 0.4077
Average 8.5459 3.1081 3.0650 0.6226 0.6807 0.4433 1.5141 1 3.4138 0.5883
Table 5　The similarity of the HPLC fingerprint for 10 batches of Aconitum coreanum
Sample
Correlation coefficient method
Peak Area Peak High Whole spectra
Angle cosine method
Peak Area Peak High Whole spectra
1 1 1 1 1 1 1
2 0.9845 0.9901 0.9850 0.9869 0.9915 0.9858
3 0.9827 0.9829 0.8953 0.9694 0.9815 0.9004
4 0.9888 0.9946 0.9907 0.9854 0.9956 0.9912
5 0.9725 0.9858 0.8959 0.9744 0.9887 0.9001
6 0.9888 0.9961 0.9926 0.9911 0.9967 0.9928
7 0.9730 0.9875 0.9810 0.9807 0.9901 0.9818
8 0.9390 0.9893 0.9578 0.9558 0.9913 0.9598
9 0.9832 0.9912 0.9677 0.9818 0.9928 0.9692
10 0.9780 0.9907 0.9913 0.9838 0.9924 0.9919
3　讨　论
关白附的主要有效成分为生物碱类 ,本实验
采用 1%盐酸溶液超声提取 , 通过比较超声 20
min 、30 min和 40 min所得结果 ,发现 30 min 和 40
min提取得到的图谱各峰面积相差不大 ,但均高
于 20 min所得图谱 ,故采用超声 30min进行提取。
不同批号关白附药材所含各有效成分基本相
同 ,但是各成分含量差别较大 ,如果要保证药品的
一致性 ,应注意药材产地和采收时间。
296　　Chin J Nat Med　Sep.2005　Vol.3　No.5 中国天然药物　2005年 9月　第 3卷　第 5期
本实验通过一系列筛选 ,建立了较好的色谱
洗脱条件 ,结果表明各色谱峰之间分离度良好 ,根
据此方法所得到的关白附的 HPLC指纹图谱重现
性 、精密度和稳定性均良好 ,确定了其中 10个共
有峰 ,并利用相似度软件对关白附指纹图谱进行
匹配 ,结果表明东北产 10批关白附在整体上相
似 ,因此以这 10批样品的相对峰面积和相对保留
时间的均值建立了模式图谱 ,可用于关白附的真
伪鉴别与质量评价。
参 考 文 献
[ 1] 　国家中医药管理局《中华本草》编辑委员会.中华本草(精
选本):上册[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1996:500-
505.
[ 2] 　后德辉(Hou DH), 邬利娅(Wu LY), 徐为人(Xu WR), 等.
关附甲素与关附庚素及壬素抗心律失常的比较[ J] .中国药
科大学学报(J Chin PharmUniv), 1987 , 18(4):268-271.
[ 3] 　国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要
求(暂行)[ J] .中成药(Chin Tradit Pat Med), 2000, 22(10):
671-675.
HPLC Fingerprint of Aconitum coreanum
WANG Xia-Chang2 , LIU Jing-Han1＊ , WANG Qiang2
1Department of Phytochemistry ;
2Department of Analysis of Chinese Materia Madica , China Pharmaceutical University , Nanjing 210038 , China
【ABSTRACT】　AIM:To make comparative study on HPLC fingerprint for 10 batches of Aconitum coreanum produced in the Northeast
of China.METHOD:Diamonsil C18 colunm was used with a mobile phase of (A)2 mg/ mL sodium 1-heptanesulfonate (including
0.2% triethylamine and the pH was adjusted to 3.0 with phosphoric acid)-(B)acetonitrile in a gradient mode.The flow rate was 1.0
mL/min.The wavelength of measurement was 205 nm.RESULT:The alkaloid components of Aconitum coreanum from different batch
was separated well.There were 10 common peaks in HPLC-FPS , the area summation of which were no less than 90% of the total peak
area.CONCLUSION:The method can be used to identify and evaluate the quality of Aconitum coreanum.
【KEY WORDS】　Aconitum coreanum;HPLC fingerprint;Alkaloid
【Foundation Item】　This project was supported by Innovation Medicines and Modernization of Traditional Chinese Medicines Items of
the National 863 Program Foundation of China(No.2002AA223102).
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中国天然药物　2005年 9月　第 3卷　第 5期 Chin J Nat Med　Sep.2005　Vol.3　No.5　297