全 文 ：　第 25 卷第 4 期
2006 年 7 月 　 　 　　　　 　
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Journal of Food Science and Biotechnology
　 　 　　　　Vo l. 25　No . 4
Jul. 　2006
　文章编号:1673-1689(2006)04-0067-05
　　收稿日期:2005-09-17;　修回日期:2005-11-11.
　　基金项目:江苏省无锡市自然科学基金资助项目(NOCK030002).
作者简介:崔凤杰(1980-), 男 ,安徽阜阳人 , 生物制药博士研究生;*通讯作者.
搅拌转速和通气量对灰树花深层发酵培养的影响
崔凤杰1 , 2 , 　陶文沂1 , 2* , 　许泓瑜2 , 　许正宏2 , 　敖宗华2
(1. 江南大学 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室 ,江苏 无锡 214036;2. 江南大学 生
物工程学院生物制药研究室 ,江苏 无锡 214036)
摘　要:采用 15 L 搅拌式发酵罐研究灰树花的扩大培养条件 ,主要考察了搅拌转速和通气量对灰
树花菌丝量 、胞外多糖产率 、溶氧 、菌丝形态以及发酵液粘度的影响. 研究结果表明搅拌转速和通
气量能显著影响灰树花的生长 ,并且通过对灰树花菌丝球的大小 、形态以及胞外多糖的分泌影响
发酵液的粘度.并得出较为优化的培养条件为:温度 25 ℃,通气量 0. 75 vvm ,搅拌转速 80 r /min ,
装液量 60%;在此条件下 ,发酵 10 d后 ,灰树花菌丝体最大得率为 22. 95 g /L ,胞外多糖的得率为
1. 521 g /L。
关键词:灰树花;扩大培养;搅拌转速;通气量
中图分类号:Q 815 文献标识码:A
Effects of Agitation and Aeration on the Production of Mycelial Biomass
and Exo-polysaccharides by Grif ola f rondosa GF9801
CUI Feng-jie 1 , 2 , 　TAO Wen-yi1 , 2* , 　XU Hong-yu2 , 　XU Zheng-hong 2 , 　AO Zhong-hua2
(1. Key Labo rato ry o f I ndustrial Bio technolog y , Ministry of Education , Southern Yang tze Unive rsity , Wux i
214036 , China;2. Labo rato ry o f Biopha rmaceutics , School of biotechno log y , Southern Yang tze Univer sity , Wux i
214036 , China)
Abstract:The ef fects o f cultiv ation agitation intensi ty and aeration rate on the production o f
mycelial biomass and exo-poly saccharides (EPS) by Gri f ola f rondosa GF9801 in a 15 L batch
fermenter w ere investig ated in this study. Results revealed that agi tation intensi ty and aeration
rate could significant ly inf luence the production of mycelial biomass and exo-po lysaccharides
(EPS), the concentrations of dissolved oxygen and reducing sugars , and the broth apparent
viscosi ties. The highest mycelial biomass (22. 95 g /L) and EPS concentrat ion (1. 521 g /L)were
obtained a t the optimized ope rating condi tion at agi tation speed (80 r /min) and aeration rate
(0. 75 vvm) af ter 10-day cultiv ation.
Key words:Gri f ola f rondosa ;batch fermentation;agitation intensi ty;aeration rate
　　丝状真菌深层发酵过程中其形态对一些代谢
产物的生产有着重要的影响 ,许多丝状真菌一般以
游离菌丝体或者球状生长. 在扩大培养中影响菌
丝体生长的因素很多 ,其中搅拌剪切力等影响较为
显著[ 1] ,特别在搅拌式发酵罐中对剪切力更大. 因
此 ,一般采用较低的搅拌速度来降低剪切力. 但是
许多大型真菌的培养过程粘度很大 ,并且对氧需求
也很大[ 2 - 3]. 因此需要同时考虑必要的通气量和搅
拌速度. 为了满足在培养过程中菌球能紧密生长 ,
提高传质常数 ,有必要对真菌发酵过程的操作条件
进行优化 。
近年来 ,药用真菌深层发酵培养得到的菌丝体
和胞外多糖受到广泛的关注 ,由于它们所具有的各
种生理活性物质 ,目前更多的研究集中在其药理应
用[ 4 - 6]. 此外很多研究集中在药用真菌摇瓶发酵的
影响因素 ,如培养基配方优化 、培养条件的选择等
方面[ 7 -8] 。但是药用真菌的深层发酵的扩大培养目
前还很少有报道 。
灰树花(Gri f ola f rondosa)又名栗子蘑 , 贝叶
多孔菌 , 日本称舞茸 , 其香味浓郁 , 质地脆嫩 , 营
养价值高 ,在民间有悠久的食用历史[ 9] , 中国 、日本
以及北美等地均有分布. 由于其含有诸多生物活
性物质 ,获得了广泛关注。作者在本实验室前期工
作的基础上[ 10] ,在发酵罐上对不同的转速以及通气
量进行实验 ,以考察它对灰树花深层发酵的影响 ,
以期得出较佳的操作条件 ,为灰树花的工业放大生
产提供一定的参考价值。
1　材料与方法
1. 1　材料
灰树花(Gri f ola f rondosa GF9801)为作者所
在实验室保藏菌种;LS-B50型立式圆形压力蒸气灭
菌锅:上海医用核子仪器厂生产;HYG-11型转式恒
温调速摇瓶柜:上海新星自动化控制设备厂生产;
15 L 搅拌式发酵罐:德国产;Bio stat C10-3 型生化
培养箱:广东省医疗机械厂生产;721 分光光度计:
上海精密科学仪器有限公司生产。
培养基:PDA 培养基(成分 g /L):马铃薯 200 ,
葡萄糖 20 ,蛋白胨 2 ,KH 2PO4 2 , MgSO 4 7H 2O 1 ,
琼脂 20 。
种子培养基(成分 g /L):葡萄糖 20 ,蛋白胨 2 ,
KH2 PO 4 2 ,MgSO 4 7H 2O 1 ,麸皮浸汁 50(麸皮浸
汁煮沸 30 min八层纱布过滤),pH 自然;
发酵培养基(成分 g /L):葡萄糖 30 ,蛋白胨 4 ,
KH2 PO 44 , MgSO 4 7H 2O 2 , 玉米浆 1. 5 , pH 自
然。
1. 2　测定方法
1. 2. 1　种子培养　250 mL 摇瓶装液100 mL ,每瓶
用接种铲接种黄豆大小菌丝体 10块 。25 ℃150 r /
min 培养 6 d ,收集种子液。
1. 2. 2　15 L 扩大培养　发酵罐中装液量 60 %,即
10 L ,接种 10%,在温度为 25 ℃条件下调节不同的
通气量 、搅拌转速 ,初始 pH 自然 , 其中相对溶氧
(%),pH 、温度以及空气流速全程检测 ,间隔一定时
间取样分析。
1. 2. 3　菌丝体干重和胞外多糖的测定　所取样品
在 4 ℃以 10 000 r /min离心 10 min ,收集沉淀物 ,
去离子水洗涤 3次 ,真空干燥箱 60 ℃烘至恒重 , 所
得即为菌丝体干重. 所得滤液经 0. 45 μm 滤膜过
滤 ,滤液浓缩后 ,加入 3 倍体积无水乙醇 ,剧烈搅
拌 ,4 ℃过夜沉淀 ,高速离心醇沉液 ,收集沉淀 ,真空
干燥箱 60 ℃烘至恒重 , 所得即为胞外多糖含量。
各测定指标测定两次 ,取其均值。
发酵参数的计算公式:菌丝体过程平均比生长
速率:V(h - 1)=(1 /X)(dX /dt)
胞外多糖过程平均比增加得率:Pp / x =(1 /X)
(dP /dt)
1. 2. 4　残糖测定　通过 HPLC 法测定发酵醪中残
糖含量 ,测定条件:ZORBAX Carbohydrate (5 μm
×150 mm)柱;柱温:30 ℃;流动相∶乙腈∶水=70
∶30(V∶V);进样:5 μL;以葡萄糖为标准品作标
准曲线 ,根据样品中葡萄糖的相应峰面积计算出相
应的含量 。
1. 2. 5　菌丝体形态学观察 　采用光学显微镜观
察 ,并用数码相机拍摄相应发酵醪图片进行分析 。
1. 2. 6　发酵液粘度分析 　发酵液离心后去上清
液 ,采用 NDJ-1 旋转黏度计 , 3 号转子 , 在 60 r /
min 室温下测定粘度。
2　结果与分析
2. 1　搅拌转速对灰树花生长的影响
为了考察搅拌转速对灰树花发酵过程的影响 ,
菌体生长 、胞外多糖得率 、发酵液还原糖消耗以及
溶氧进行跟踪检测 ,实验中控制搅拌转速范围为 60
～ 120 r /min ,研究结果示于图 1。不同的搅拌速度
对灰树花菌丝体量的得率影响显著(见图 1 (A)),
其中搅拌转速在 60 ～ 100 r /min 内 ,随着搅拌速度
的增加菌丝体量不断提高. 其中搅拌转速为100 r /
min时 ,灰树花菌丝体量增长最快 ,并且产率最高 ,
发酵到第 9天菌丝体得率达到 23. 50 g /L。但搅拌
转速升高后 ,菌丝体量有所下降 ,可能是由于高搅
拌转速条件下 ,剪切作用力较大 ,菌丝易被打断 ,不
利于菌体生长 。
68 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷　
　　(a)
　　(b)
　　(c)
　　(d)
图 1　不同搅拌速度对灰树花生长的影响(a):灰树花
菌丝体干重(g/L);(b):灰树花胞外多糖(g /
L);(c):发酵液残糖(g/L);(d):相对溶氧
(%)
Fig. 1　Time profiles of (a) mycelial biomass , (b) exo-
polysaccharides(EPS) production , (c) dissolved
oxygen (DO), and (d) residual sugar in G.
f rondosa GF9801 using a 15 L stirred fermenter
at different agitation rates
　　类似的生长趋势也表现在灰树花胞外多糖的
得率上(图 1(B)),灰树花经过近 5 d的培养适应
期 ,开始大量分泌胞外多糖 ,在转速 80 r /min 下培
养 10 d ,灰树花胞外多糖得率达到最大 2. 252 g /L ,
而其他转速(60 , 100 ,120 r /min)条件下 ,胞外多糖
的最大产率分别为 0. 653 , 1. 094 ,0. 937 g /L。
从图 1(C)和(D)中可以看到 ,发酵液中残糖所
消耗的趋势 ,在发酵前期(第 0 ～ 2 天)残糖量基本
保持稳定 ,随着菌体快速生长 ,还原糖消耗也逐渐
快速增加;溶氧的消耗规律基本相似 ,在快速生长
期溶氧下降迅速 ,表明此时细胞的摄氧速率明显高
于发酵液中的供氧速率。进入稳定期后 ,溶氧一直
保持在较低的水平 ,这也可能由于发酵后期大量菌
体生长 ,需要消耗大量的溶氧 。
不同转速条件下 ,灰树花发酵动力学参数如表
1所示 ,在 80和 100 r /min 下取得菌丝体平均生长
速率 ,分别为 0. 106 86和 0. 107 57 /h , 而对于胞外
多糖 ,则在 80 r /min时产率最大 ,达到 0. 005 93 /h。
表 1　不同转速条件下的发酵参数比较
Tab. 1　Fermentation kinetics of G. f rondosa GF9801 under
the dif ferent agitation conditions
动力学
参数 /(r /min)
菌丝
体量 /(g /dL)
胞外
多糖 /(g / L)
菌丝体过程
平均比
生长速率 /h
胞外多糖
过程平均比
增加得率 /h
60 18. 11 0. 653 0. 096 47 0. 003 30
80 20. 94 1. 252 0. 106 86 0. 005 93
100 23. 7 1. 094 0. 107 57 0. 004 59
120 20. 12 0. 937 0. 096 57 0. 004 42
2. 2　搅拌转速对灰树花菌体形态及发酵液粘度的
影响
实验中发现搅拌转速对灰树花菌体的生长形
态有较大的影响 ,观测结果见表 2。
表 2　搅拌转速对灰树花菌体形态的影响
Tab. 2　The morphological change in G. f rondosa GF9801 in
a 15 L stirred-tank fermenter at different agitat ion
rates
搅拌转速 /
(r /min)
菌求直径 /
mm
丝状体
比例 形态
60 3. 5 + 紧密 , 小球状
80 2. 2 + 较紧密 ,小球状
100 1. 4 ++ 松散
120 0. 9 +++ 疏松 ,絮状
　　由表 2 可以看出低搅拌转速(60 和 80 r /min)
下菌球直径较大 ,紧密 ,随着转速的提高 ,菌球直径
下降并趋于松散;同时随着转速的提高 , 丝状菌体
所占比例增大 ,一般丝状体方式生长时则会引出发
酵前期的粘度较大 ,不利于营养物质和氧的溶解 、
传递与均匀分布 ,从而降低产量. 通常发酵液的粘
度与菌体的形态 、产率以及胞外多糖的浓度相关.
图 2显示在发酵过程中 ,搅拌速度对灰树花发酵液
的粘度的影响 ,搅拌速度在一定范围(60 ～ 100 r /
min)内与发酵液最终粘度呈正相关 ,这主要由于搅
69　第 4期 崔凤杰等:搅拌转速和通气量对灰树花深层发酵培养的影响
拌的剪切作用在促进菌体生长的同时 ,加快胞外多
糖的分泌的原因. 还可以看出在转速 100 r /m in
下 ,发酵第 4天发酵液的粘度急剧上升 ,表明此时
灰树花培养进入快速生长期。
图 2　不同转速对灰树花发酵液粘度的影响
Fig. 2　The apparent viscosity of the fermentation broth
G. f rondosa GF9801 in a 15 L stirred fermenter
under different agitation speeds
2. 3　通气量对灰树花生长的影响
在好氧培养过程中 ,溶氧浓度是一个非常关键
的控制参数 ,特别是对丝状真菌发酵的影响尤为明
显 ,其中通气量对发酵醪的溶氧浓度起到直接的作
用。在转速一定 (80 r /min)的条件下 ,考察不同的
通气量对灰树花生长的影响。
在搅拌转速为 80 r /min时 ,通气量对灰树花生
长以及发酵动力学参数的影响如图 2和表 3 所示 ,
在通气量为 0. 5 , 0. 75 , 1. 0 vvm 时 ,最大菌丝体量
为 14. 51 ,20. 54 和 21. 38 g /L ,较高的通气量比较
有利于菌丝体的生长;而最大胞外多糖得率为
0. 903 ,1. 394和1. 262 g /L ,较高或较低的通气量均
不利于胞外多糖的分泌。
对于还原糖的消耗以及发酵过程溶氧的变化 ,
基本与搅拌转速的影响趋势相一致 ,通气量加大 ,
发酵液中还原糖消耗的更为彻底 ,与灰树花菌丝体
及胞外多糖得率的增加相对应;在通气量较大(1
vvm)的条件下 ,发酵后期发酵液中的溶氧仍然保持
较高的浓度 ,因此在较大的通气量下 ,灰树花菌体
生长较为充分。
　　　(a)
　　(b)
　　(c)
　　(d)
图 3　不同通气量对灰树花生长的影响
(a):灰树花菌丝体干重(g /L);(b):灰树花胞外
多糖(g/L);(c):发酵液残糖(g /L);(d):相对溶
氧(%)
Fig. 3　Time profiles of (a) mycelial biomass , (b) exo-
polysaccharides(EPS) production, (c) dissolved
oxygen (DO), and (d) residual sugar in G.
f rondosa GF9801 using a 15 L stirred fermenter
at different aeration rates
表 3　不同通气量条件下的发酵参数比较
Tab. 3　Fermentation kinetics of G. f rondosa GF9801 under
the dif ferent aeration conditions
动力学
参数 /
vvm
菌丝
体量 /
(g /dL)
胞外
多糖 /
(g / L)
菌丝体过程
平均比
生长速率 /h
胞外多糖
过程平均比
增加得率 /h
0. 5 14. 51 0. 903 0. 097 726 0. 005 78
0. 75 20. 54 1. 394 0. 097 907 0. 006 51
1. 0 21. 38 1. 252 0. 098 129 0. 005 62
2. 4　通气量对灰树花菌丝体形态及发酵液粘度的
影响
对于丝状真菌发酵 ,通气速率对菌丝体形态有
着显著的影响 ,过高或者过低都有可能使菌丝生长
70 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷　
会发生异常变化 ,主要表现在菌球生长大小不一 ,
或者菌丝体碎裂 ,出现大量菌体碎片。通气量对灰
树花发酵菌丝体形态的影响如图 4 。(1 ～ 3)所示 。
从图中可以看出 ,较低的通气速度(0. 5 vvm)可以
得到较好的菌体形态 ,但是菌球大小不一 ,而较高
的通气量(1 vvm)则导致菌球过小 ,并且发酵液中
夹杂有异状粗体菌丝的菌丝体。可以看到通气速
度对灰树花菌丝体形态影响显著。
(a)
(b)
(c)
图 4　不同通气量对灰树花发酵菌丝体形态的影响
Fig. 4 　The morphological change (a) 0. 5 vvm , (b)
0. 75 vvm , (c) 1. 0 vvm in G. f rondosa
GF9801 in a 15 L stirred fermenter at different
aeration rates
　　通气量对发酵液粘度的影响如图 5所示 ,由于
在通气量为 0. 75 vvm 下灰树花菌丝体和胞外多糖
的得率都相对较高 ,因此在此条件下发酵液的粘度
最高;较低的通气量(0. 5 vvm)时发酵的粘度最低.
一般通气量过大 ,会使大量泡沫逃逸 ,增加染菌机
会 ,降低搅拌罐装料系数 ,液体蒸发多 ,增加粘度。
因此综 合以 上研究 结果 , 较 佳的 通气 量为
0. 75 vvm 。
图 5　不同通气量对灰树花发酵液粘度的影响
Fig. 5　The apparent viscosity of the fermentation broth
G. f rondosa GF9801 in a 15 L stirred fermenter
under different aeration speeds
3　结　论
通常在通气量一定的情况下 ,搅拌在发酵过程
中主要起着混合和剪切作用 ,影响着菌丝球的大
小 ,包括影响菌丝缠绕成球或打碎菌丝球 ,发酵过
程中搅拌作用对菌丝球尺寸的影响 ,间接地影响菌
球内氧及底物的消耗 ,同时对胞外多糖的分泌都有
直接的影响 ,但是由于丝状真菌对搅拌剪切敏感 ,
过高或过低的搅拌转速使菌丝体量 、菌体形态以及
胞外多糖的合成发生一定的变化 ,进而影响发酵液
的粘度. 本实验研究发现 ,在转速 80和 100 r /min
条件下 ,菌丝生长较好 ,胞外多糖的得率也相对较
高 ,过高或者过低的转速对菌体的生长不利 。
前期实验也发现 ,通气量的改变对菌体的形态
以及发酵液的粘度有着直接的作用. 在转速固定
在 80 r /min条件下 ,考察了不同通气量对灰树花发
酵过程的影响 ,结果表明过高的通气量也会导致菌
丝球的大小和形态 ,并且在一定范围内对发酵液的
粘度呈正相关 。
经过对灰树花 15 L 发酵罐扩大培养过程中不
同搅拌速度和通气量的研究 ,得出较为优化的培养
条件为:温度 25 ℃,通气量 0. 75 vvm ,搅拌转速 80
r /min ,装液量 60 %;在此条件下 ,发酵 10 d 后 ,灰
树花菌丝体最大得率为 22. 95 g /L ,胞外多糖的得
率为 1. 521 g /L 。 (下转第 80页)
71　第 4期 崔凤杰等:搅拌转速和通气量对灰树花深层发酵培养的影响
化链的还原途径来实现的 ,而 1 ,3-丙二醇氧化还原
酶同工酶[ 8] ,在微生物体内可代替 1 , 3-丙二醇氧化
还原酶催化 3-羟基丙醛生成 1 ,3-丙二醇 ,是微生物
转化甘油生成 1 , 3-丙二醇的另一关键酶 。作者已
经成功地构建了利用甘油转化为 1 , 3-丙二醇的重
组大肠杆菌 JM 109(pUCtac-dhaB-yqhD)。以 50
g /L 甘油为惟一碳源的发酵培养基 ,经 IPTG 诱导
后 1 , 3-丙二醇产量为 38. 0 g /L;考虑到工业化生
产 ,利用 IPTG 诱导的方法成本较高 ,采用温控载体
pHsh代替原来的 pUCtac 载体 ,温控载体 pHsh 通
过温度诱导表达 ,降低了生产成本 。另外温控载体
pHsh整个质粒仅为 2. 3 kb ,有利于增加其拷贝数
和容量 ,可以插入较大的外源基因片断 ,并且外源
蛋白质在大肠杆菌中高效表达后不易形成包含体 ,
利用温控载体 pHsh可以使编码 1 ,3-丙二醇氧化还
原酶同工酶基因 yqhD 得到高效表达 ,为构建适合
工业化生产 1 ,3-丙二醇的新型基因工程菌打下了
良好的基础。
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(上接第 71页)
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(责任编辑:杨 萌)
80 食　品　与　生　物　技　术　学　报　　　　　　　　　　　　第 25卷