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收稿日期:2011-09-28
基金项目:吉林省教育厅“十二五”规划项目(2011-272)
作者简介:于加平(1973-),男 , 吉林省大安市人 ,讲师 , 从事分析化学和天然产物的教学 、科研工作。
超临界 CO2萃取黄花忍冬果中精油及其抑菌性研究
于加平
(吉林农业科技学院生物工程学院 ,吉林 132101)
摘 要:通过超临界 CO2萃取法 , 从黄花忍冬果粉中萃取得到黄花忍冬果精油 , 再采用分馏法对总的精油进行分馏 ,
得到三种不同温度下的精油馏分 ,然后选用六种供试菌 ,对 3 段温度的精油馏分及总精油的抑菌性进行研究 。结果:60 ～
100℃间的精油馏分抑菌效果最强 , 且三种不同温度的精油馏分均对青霉 、黑曲霉的抑制效果较强 ,对四链球菌的抑制效果
较弱。结论:黄花忍冬果精油的抑菌性较强 , 是天然的抑菌剂 ,对有害生物防治 、疾病的治疗 、食品领域及化妆品产业均有
开发利用价值。
关键词:黄花忍冬果;超临界 CO2 萃取法;精油;抑菌性
中图分类号:R284 文献标识码:A
Study on the Bacteria Restraint of Essential Oils Get from Lonicera chrysantha
Fruit by Supercritical CO2 Extraction
YU Jiaping
(J ilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering , Jilin 132101)
Abstract:Essential oils were extracted from lonicera chrysantha fruit by the supercritical carbon dioxide fluid ex-
traction , and three compounds were separated from the essential oils in different temperature.The antimicrobial activ-
ities of the three compounds on various bacteria were investigated.The results indicated that the compounds of essen-
tial oils of 60 ～ 100℃had the best antimicrobial activity , and different kinds of essential oils had different antimicro-
bial activity to the various bacteria.The best effects was to penicillium sp and aspergillus niger , the lest effect was to
micrococcus tetragenus.The conclusion was that the essential oils of Lonicera chrysantha fruit has the strong antimi-
crobial activity , it is a nature bacteriostasis which has the value of development and using to the harmful biological
control , disease treatment , food field and cosmetics industries.
Key words:the fruits of Lonicera chrysantha;supercritical carbon extraction;essential oils;bacteria restraint
黄花忍冬(Lonicera chrysantha)别名金花忍冬 ,
为忍冬科忍冬属多年生灌木 ,主要分布于华北 、东
北 、西北等地 ,在我国资源丰富 ,目前大多数黄花
忍冬用于城市绿化 ,其果实大部分被废弃。对于
黄花忍冬果中活性成分的研究主要是绿原酸和多
糖[ 1 ～ 2] ,而对黄花忍冬果中精油的研究却未见报
道。精油主要用于日化 、食品以及医药等领域[ 3] 。
现代药理学研究表明 ,精油具有疏风散热 、和中理
气 、辟秽解毒 、消炎 、止血 、收敛 、促进细胞新陈代
谢及抗氧化之功效 ,常用于伤风感冒 、头痛 、胃气
痛 、目赤 、口疮 、牙痛等症[ 4～ 5] 。为了更好的研究 、
了解 、利用黄花忍冬 ,以黄花忍冬的果为原料 ,采
用超临界 CO2 萃取法萃取黄花忍冬果中精油 ,再
对黄花忍冬果精油的抑菌性进行研究 。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料 黄花忍冬果 ,采自吉林农业科技学
院校园内 ,经专家鉴定为黄花忍冬果 ,经阴干 ,低
温烘干 ,粉碎 ,处理为干品 ,置于干燥器内备用。
1.1.2 供试菌 大肠杆菌 、四链球菌 、枯草杆菌 、
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金黄色葡萄球菌 、青霉 、黑曲霉 ,由吉林农业科技
学院微生物实验室提供。
1.1.3 培养基 细菌用牛肉膏蛋白胨培养基 ,成
分为蛋白胨20g ,牛肉膏 6g ,NaCl 10g ,琼脂 36g ,加
蒸馏水 2 000mL , pH 值 7.2 ～ 7.4。真菌用马铃薯
培养基 , 将市售新鲜马铃薯去皮切成小块 ,称取
200g加水约 800mL煮沸 30min ,纱布过滤 ,加葡萄
糖20g ,琼脂 20g ,加蒸馏水至 1 000mL ,pH 值取自
然值。将上述培养基在 121℃的条件下 ,高压蒸汽
灭菌 20min ,备用 。
1.1.4 仪器 HA121-50-O型超临界流体萃取
装置 、AIR-TECH 型超净工作台(苏静集团安泰公
司)、LRH-150B型生化培养箱(广东省医疗器械
厂)、YXQ.SG41.280型电热手提式压力蒸汽灭菌
锅(上海生银医疗仪器仪表厂)、电子天平(北京赛
多利斯天平有限公司)、分馏装置(上海亚荣)。
1.2 试验方法
1.2.1 超临界 CO2 萃取黄花忍冬果精油 由于
所得目标产物为挥发性油脂类成份 ,所以本文参
考了超临界 CO2 萃取精油的相关文献[ 6～ 7] ,将萃
取条件设置为:萃取压力 30MPa 、分离压力 8MPa 、
萃取温度 35℃、分离Ⅰ的温度45℃、分离 Ⅱ的温度
45℃、萃取时间 4h 、CO2 流量 25L/h。得到黄花忍
冬果精油 ,棕黄色 ,具有较浓的芳香气味 ,粘稠状。
1.2.2 黄花忍冬果精油的分馏 采用分馏装置 ,
对1.2.1所得精油进行分馏 ,得到三种不同温度
下的精油馏分 ,分别为:沸点小于 60℃的馏分 ,乳
白色油状液体 ,具有很强的芳香气味;沸点在 60℃
～ 100℃之间的馏分 ,淡黄色油状液体 ,具有芳香
气味;沸点在 100℃以上的馏分 ,深棕色油状液体 ,
具有淡芳香气味 。
1.2.3 精油稀释液的制备 取 7支试管 ,第一支
为空 ,其余每支试管均加入 2.5mL 丙酮 ,分别吸取
2.5mL 沸点在60℃以下精油和2.5mL丙酮加入到第
一支试管中 ,混匀 ,再从第一支试管中吸出 2.5mL
加入到第二支试管中 ,混匀 ,依次操作 ,最后从第 7
支试管中取出 2.5mL 弃去 ,就得到梯度浓度的精
油稀释液。配制两组 ,一组用于加入到细菌培养
基 ,另一组用于加入到真菌培养基。同法制备沸
点在 60℃～ 100℃之间的精油 、沸点在 100℃以上
的精油和总精油的稀释液 。
1.2.4 菌悬液制备 采用平板菌落计数法 ,将供
试的细菌和真菌的菌种在斜面试管培养基上活化
2 ～ 3代 ,用接种环从斜面上轻刮菌苔一环 ,分别收
集到内盛有 10mL 无菌水的小三角烧瓶中 ,配制成
终浓度为 106cfu·mL-1的菌悬液和 104 cfu·mL-1的
孢子悬液 ,备用 。
1.2.5 抑菌圈的测定 采用贴片法测定其抑菌
性[ 8～ 9] :取吸水力较强且质地均匀的滤纸 ,用打孔
器打成直径为 6mm 的圆形纸片 ,干热灭菌后分别
放入 1.2.2所得各种馏分的精油样品中浸泡 2h。
用无菌移液枪吸取 0.1mL 已配置好的菌悬液 ,将
其均匀涂布于冷却好的无菌平板表面 ,制成含菌
平板 。然后正置于培养箱中 1h(细菌培养温度为
37℃,真菌培养温度为 28℃)。1h后 ,取浸泡过精
油的圆形滤纸片贴在含菌平板上 ,每皿贴浸过同
一种精油的圆纸片 3个和浸过无菌生理盐水的圆
纸片 1个 ,不同馏分的精油样品 、不同种类的菌种
间相互对照。细菌置于 37℃的恒温箱中培养 24h
后观察 ,测量并记录抑菌圈直径;真菌置于 28℃恒
温箱中培养 48h后观察 ,测量并记录抑菌圈直径 。
每组取 3个相同样品直径的平均值 。
抑菌圈试验判定标准:抑菌圈直径大于 20mm
极敏;15 ～ 20mm 高敏;10 ～ 15mm 中敏;7 ～ 9mm 低
敏;小于 7mm 不敏感。
1.2.6 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度
(MBC)的测定 采用二倍稀释法[ 10] ,以丙酮为溶
剂 ,配制一系列梯度浓度的精油溶液 ,加入到已经
融化好的培养基中 ,混合均匀 ,使培养基中精油的
浓度分别为 50.000 0 、25.000 0 、12.500 0 、6.250 0 、
3.125 0 、1.562 5μL·mL-1 。待培养基冷却凝固后 ,
吸取制备好的菌悬液或孢子悬液 0.1mL ,将其均
匀涂布于上述平板表面 ,置一定条件下培养(细菌
37℃,24h;真菌 28℃, 48h),然后观察并记录供试
菌生长情况 ,与对照组(菌落正长生长)比较 ,肉眼
可见菌落生长者为无抑制作用 ,以 24h 后完全没
有菌落生长的最低精油浓度为其最低抑菌浓度
(MIC),以 48h后出现菌落生长的最低精油浓度为
其最低杀菌浓度(MBC),以丙酮为对照。设置 3次
重复实验 ,不同精油样品间相互对照。
2 结果与分析
2.1 精油抑菌活性的测定结果 见表 1。
由表 1可知 ,黄花忍冬果精油及其经分馏分
离后得到的三种精油馏分对 6种供试菌的抑菌效
果明显不同。4种精油样品对 6种菌的抑菌圈直
径大小关系为:沸点在 60℃～ 100℃的馏分>沸点
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大于 100℃的馏分>沸点小于 60℃的馏分>分馏
前的总精油 ,其中沸点在 60℃～ 100℃的馏分的抑
菌效果最好 。总体上黄花忍冬果精油对 6种菌的
抑菌圈直径大小关系为:黑曲霉>青霉>大肠杆
菌>金黄色葡萄球菌>枯草杆菌>四链球菌 ,其
中对黑曲霉的抑菌效果最好 ,对四链球菌的抑菌
效果最差 。
表 1 4 种精油对 6种菌的抑菌圈直径测定结果(mm)
供应品
精油样品 大肠杆菌 四链球菌 枯草杆菌
金黄色
葡萄球菌 青霉 黑曲霉
总精油 11.2±0.3 8.1±0.2 9.4±0.1 9.5±0.1 15.6±0.2 17.6±0.1
沸点小于 60℃ 13.1±0.2 8.5±0.1 10.3±0.2 10.4±0.1 18.3±0.2 20.3±0.3
沸点 60～ 100℃ 20.3±0.1 10.4±0.3 15.2±0.1 16.7±0.2 30.2±0.2 35.9±0.2
沸点大于 100℃ 18.6±0.2 9.3±0.2 13.3±0.1 14.0±0.1 25.6±0.3 29.8±0.2
2.2 精油的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度
(MBC)的测定结果
见表 2 、表 3 、表 4 、表 5。
表 2 黄花忍冬果总精油抑菌的 MIC 和 MBC(μL·mL-1)
浓度 时间 50.000 0 25.000 0 12.500 0 6.250 0 3.125 0 1.562 5
大肠杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
四链球菌 24h
48h
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
枯草杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
金黄色葡萄球菌 24h
48h
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
青霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
黑曲霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
表 3 沸点小于 60℃的馏分抑菌的 MIC和 MBC(μL·mL-1)
浓度 时间 50.000 0 25.000 0 12.500 0 6.250 0 3.125 0 1.562 5
大肠杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
四链球菌 24h
48h
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
枯草杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
金黄色葡萄球菌 24h
48h
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
青霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
黑曲霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
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表 4 沸点 60℃～ 100℃的馏分抑菌的MIC和 MBC(μL·mL-1)
浓度 时间 50.000 0 25.000 0 12.500 0 6.250 0 3.125 0 1.562 5
大肠杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
四链球菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
枯草杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
金黄色葡萄球菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
青霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
黑曲霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
表 5 沸点大于 100℃的馏分抑菌的 MIC和 MBC(μL·mL-1)
浓度 时间 50.000 0 25.000 0 12.500 0 6.250 0 3.125 0 1.562 5
大肠杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
四链球菌 24h
48h
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
枯草杆菌 24h
48h
-
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
金黄色葡萄球菌 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
青霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
黑曲霉 24h
48h
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
由表 2 、表 3 、表 4 、表 5可知:黄花忍冬果精油
对大肠杆菌 、四链球菌 、枯草杆菌 、金黄色葡萄球
菌 、青霉 、黑曲霉的最低抑菌浓度分别为 12.500 0 、
25.000 0 、12.500 0 、12.500 0 、6.250 0 、6.250 0μL·
mL
-1;最低杀菌浓度分别为 25.000 0 、50.000 0 、
25.000 0 、25.00 0 、12.500 0 、12.500 0μL·mL-1 。精
油沸程小于60℃馏分对大肠杆菌 、四联球菌 、枯草
杆菌 、金黄色葡萄球菌 、青霉 、黑曲霉的最低抑菌
浓度分别为12.500 0 、12.500 0 、6.250 0 、12.500 0 、
6.250 0 、6.250 0μL·mL-1;最低杀菌浓度分别为
12.500 0 、50.000 0 、12.500 0 、25.000 0 、6.250 0 、6.
250 0μL·mL-1 。精油沸程 60℃～ 100℃馏分对大
肠杆菌 、四链球菌 、枯草杆菌 、金黄色葡萄球菌的
最低抑菌浓度分别为 3.125 0 、6.250 0 、6.250 0 、3.
125 0μL·mL-1 ,对于青霉和黑曲霉的最低抑菌浓
度很低;最低杀菌的浓度分别为 6.250 0 、12.500 0 、
6.250 0 、3.125 0μL·mL-1 ,对于青霉和黑曲霉的最
低杀菌浓度很低;精油沸程大于 100℃馏分对大肠
杆菌 、四链球菌 、枯草杆菌 、金黄色葡萄球菌 、青
霉 、黑曲霉的最低抑菌浓度分别为 6.250 0 、12.500
0 、6.250 0 、6.250 0 、3.125 0 、1.562 5μL·mL-1;最低
杀菌浓度分别为 12.500 0 、25.000 0 、25.000 0 、12.
500 0 、3.125 0 、3.125 0μL·mL-1 。4种精油对 6种
供试菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度
(MBC)有明显的不同 ,与抑菌活性的测定结果相
一致 。总体来看精油对四链球菌的 MIC 和 MBC
较大 ,对青霉 、黑曲霉效果最好。
3 结论
目前黄花忍冬作为城市绿化树种 ,果实大部
分被废弃 ,是一种尚未被开发利用且很有价值的
药用资源 , 为了使其得到合理应用 ,通过超临界
(下转第 106页)
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出于课题研究的需求 ,就会寻找时间阅读大
量的相关教育 、教学的书籍 ,学习先进的教育 、教
学理论 ,从而不断更新及逐步形成自己的教育 、教
学理念 。这种主动的 、理解基础上的理论学习 ,必
然将促使教师在学术素养上的提高 。养成积累资
料的习惯 ,也有利于学术素养的提高。其他如论
文写作 、课题报告的撰写也有利于学术素养的提
高。
4.3 有利于“学者智慧型”教师的塑造
素质教育时代对教师提出了新的要求 ,要求
教师不能再停留于过去的“经验型” ,而是应该向
“科研型” 、“专家型” ,直至“智慧型”教师转型 ,而
开展课题研究无疑将有利于“智慧型”教师的塑
造。原先在进行教育教学时 ,总是凭借着经验 ,知
道哪些知识该采取哪种方式来进行教学 ,哪些学
生该采取什么方式来进行教育 ,总停留在经验的
套用上 ,而没有思考过为什么要这样做。但是在
开展课题研究后 ,便会有意识地去审视自己日常
工作的习惯 ,对一些好的经验或存在的问题进行
思考和归纳 ,寻找其中的规律 ,自觉地去改进自己
的教育 、教学手段 ,最终探寻出更好的解决方法 。
这些大大促进了教学水平的提高 ,使我们能够逐
步向“智慧型”教师的最终目标靠近。
参考文献:
[ 1] 刘永和.将“个人课题”进行到底[ J] .江苏教育研究 , 2010
(11):56～ 58.
[ 2] 江 明.“关注每一位教师”关系教育和国家的未来[ N] .中
国教育报 ,2010-12-29.
[ 3] 李亚娟.“个人课题”八面来风[ N] .中国教育报 , 2010-12-
29.
[ 4] 张文松.我们为什么做个人课题研究[ EB/OL] .http://www.
jlws.cn/Article/ ShowArticle.asp? Article.
责任编辑:建德锋
(上接第 11页)
CO2流体萃取技术用于黄花忍冬果中精油的提取
并对黄花忍冬果精油的抑菌性进行了研究 。结果
表明 ,黄花忍冬果精油对常见的食品污染菌有很
好的抑制效果 。不同温度下经分馏后 ,得到 3段
不同温度下的精油馏分 ,对大肠杆菌 、四链球菌 、
枯草杆菌 、金黄色葡萄球菌 、青霉 、黑曲霉均有抑
制效果 。4种精油样品对 6 种供试菌均有不同程
度的抑菌效果 ,其中对青霉 、黑曲霉的抑菌效果最
为明显 ,对四链球菌的抑菌效果相对较弱。黄花
忍冬果精油是一种天然的抑菌剂 ,对有害生物防
治 、疾病的治疗 、食品领域及化妆品产业均有开发
利用价值 。这为今后对黄花忍冬药用价值的开发
利用奠定理论基础。
另外 ,本试验对因地域不同而造成精油成分
不同 ,从而导致精油的抑菌效果不同 ,以及菌种来
源不同等方面所造成的差异未进行研究 ,其具体
情况还有待于进一步探讨 。
参考文献:
[ 1] 于加平 ,王夕宇 ,马中宇.黄花忍冬果实中绿原酸的提取及含
量测定[ J] .安徽农业科学 , 2008 ,36(6):2 199～ 2 200.
[ 2] 于加平 ,常 序 ,李文渊.超临界CO2 处理黄花忍冬果后多糖
的提取及含量测定[ J] .西南农业学报 , 2010, 23(1):181～ 183.
[ 3] 何 璞 ,康占国.留兰香的生产应用[ J] .河南农业 , 2004(8):
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[ 5] 张晓伟 , 李青雨 ,王德国 , 等.留兰香精油的抗菌活性研究
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[ 6] 朱自强.超临界流体技术—原理和应用[M] .北京化学工业
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责任编辑:建德锋
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