全 文 ：DOI:10． 13463 / j． cnki． cczyy． 2015． 01． 008
Box-Behnken实验设计法优化花生衣中总黄酮提取工艺
白 甫，朱丽红，柳小莉，唐志书，郭东艳*
(陕西中医学院药学院，陕西 咸阳 712046)
摘要:目的 筛选出花生衣中总黄酮的最佳提取工艺。方法 采用三因素三水平的 Box-Behnken 实验设
计，响应曲面法对影响总黄酮提取率的主要因素(乙醇浓度、料液比、提取时间)进行考察，以总黄酮及儿茶素
含量为响应函数，建立相应的数学模型，优化提取工艺参数。结果 最佳工艺条件为提取溶剂为 40%乙醇，液
料比为 15 倍，提取时间为 30 min，总黄酮含量为 26. 36%，儿茶素含量为 0. 087 7%。结论 Box-Behnken 实验
设计法用于花生衣中总黄酮提取工艺的优化筛选是可行的，数学模型的预测值与实验观察值相符。
关键词:Box-Behnken设计;响应曲面法;花生衣;总黄酮
中图分类号:Ｒ284. 3 文献标志码:A 文章编号:2095 － 6258(2015)01 － 0024 － 04
基金项目:陕西省教育厅资助项目(09JC018) ;陕西省中药制药重点学科资助(10089)。
作者简介:白 甫(1962 －) ，男，硕士，副教授，主要从事中药新药的研发。
* 通信作者:郭东艳，电话 －(029)38185180，电子信箱 － winter180@ 163． com。
Optimization of extraction technology of total flavones from peanut skin by Box-Behnken
BAI Fu，ZHU Lihong，LIU Xiaoli，TANG Zhishu，GUO Dongyan*
(The Medicine College of Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，Shaanxi Province，China)
Abstract:Objective To screen the optimum extraction technology of total flavones from peanut skin．Methods Box-
Behnken experimental design of three factors and three levels as well as responds surface methodology were adopted to
study the main factors influence the rate of total flavones extraction，including ethanol concentration，liquid-to-solid ra-
tio and extraction time，the content of total flavones and catechin was used as response function to build the corre-
sponding mathematical model and to optimize the extraction technological parameters． Ｒesults The optimum techno-
logical conditions were as follows:40% ethanol，liquid-to-solid ratio of 15 times，extraction time of 30min，the content
of total flavones was 26． 36% and catechin was 0． 0877% ． Conclusion Box-Behnken experimental designis use for
optimization and screening of extraction technology of total flavones from peanut-skin is feasible，the predictive values
in mathematical model are consistent with the experimental values．
Keywords:Box-Behnken design;responds surface methodology;peanut skin;total flavones
花生衣为豆科植物落花生(Arachis hypogaea
L. )的种皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、养血止
血、散瘀消肿之功。文献报道［1］其主要含有脂质、鞣
质、甾醇、花生苷、花生衣色素、儿茶素等成分，其中主
要色素成分为黄酮类化合物。文献报道［2-3］花生衣具
有止血作用、抗纤维蛋白溶解、促进骨髓制造血小板、
缩短出血时间、加强毛细血管的收缩、调整凝血因子
缺陷等功能。临床试验观察结果［4-6］表明，花生衣汤
能提高化疗周期患者的血红蛋白、提高肝硬化患者的
血小板数及具有防止化疗引起血小板降低的作用。
近年来广泛用于胃肠、肺、子宫等内脏出血及放化疗
引起的血小板减少症等。但鲜有花生衣提取工艺研
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究的文献报道［7-8］。本文拟采用 Box-Behnken 实验设
计法优化花生衣中总黄酮的提取工艺，以期为今后进
一步开发利用奠定基础。
1 材料与仪器
1. 1 材料 花生衣购于西安盛兴中药饮片有限责任
公司，经陕西中医学院王继涛老师鉴定为豆科植物落
花生(Arachis hypogaea L. )的种皮;芦丁对照品(中
国生物制品检定所，批号 100080-200707) ，儿茶素对
照品(中国食品药品检定研究院提供，批号:110877-
201102) ;甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher 公司) ;其他试
剂均为分析纯。
1. 2 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪，Waters
2695 泵，Waters 2996 二极管阵列检测器;UV-1102 型
紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司) ;
WJN-50 多功能真空浓缩机(韩国) ;梅特勒 GB204 电
子天平(万分之一) ;KH-400KDE 型高功率数控超声
波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司) ;D101 型电
热鼓风干燥箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)。
2 方法与结果
2. 1 总黄酮含量测定［9］
2. 1. 1 对照品溶液的制备 精密称取在 105 ℃干燥
至恒重的芦丁对照品 10. 0 mg，置 50 mL 量瓶中，加
20 mL甲醇，超声处理溶解，再用甲醇定容至刻度，摇
匀，即得。
2. 1. 2 供试品溶液的制备 精密移取样品液 1 mL，
用 50%甲醇定容至 50 mL 量瓶中。精密吸取 0. 5 ～
25 mL量瓶中，加 50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
2. 1. 3 总黄酮最大吸收波长的确定 分别对对照品
溶液和供试品溶液在 200 ～ 800 nm范围内进行扫描，
结果均在 510 nm处有强吸收峰。
2. 1. 4 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 2，
3，4，5，6，7 mL，分别置 25 mL 量瓶中，各加水至 6. 0
mL，加 5%亚硝酸钠溶液 1 mL，混匀，放置 6 min，加
10%硝酸铝溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠
试液 10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置 15 min，以相
应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药
典》附录ⅤA) ，在 510 nm波长处测定吸光度，以吸光
度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归
方程 A = 11. 339X － 0. 035，r2 = 0. 999 7，结果表明芦
丁在0. 016 ～ 0. 056 mg /mL范围内线性关系良好。
2. 1. 5 样品中总黄酮含量测定 精密吸取供试品溶
液 1 mL，加水至 6. 0 mL，按 2. 1. 4 项下“加 50%亚硝
酸钠溶液 1 mL”起，至“在 510 nm 波长处测定吸光
度”，记录吸光度，计算总黄酮含量。
2. 2 儿茶素含量测定［10］
2. 2. 1 儿茶素对照品溶液的制备 精密称取儿茶素
对照品 10 mg，置于 50 mL 量瓶中，加入 50%的甲醇
溶解并定容至刻度，即得浓度为 0. 2 mg /mL 的对照
品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 精密吸取花生衣样品液
1 mL，用 50%甲醇定容至 50 mL量瓶中，加 50%甲醇
至刻度。摇匀，即得。
2. 2. 3 色谱条件 色谱柱:Thermo BDS Hypersil C18
(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ;流动相:乙腈-水(10 ∶
90) ;检测波长:280 nm;流速:1 mL /min;柱温 30 ℃。
2. 2. 4 含量测定 精密吸取对照品溶液及供试品溶
液各 10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，计算儿茶
素的含量。
2. 3 Box-Behnken实验设计法优选总黄酮提取工艺
2. 3. 1 评价指标的确定 总黄酮作为花生衣的主要
成分，是其发挥药效的物质基础，原花青素是花生衣
总黄酮的主要组成部分，而原花青素主要有儿茶素和
表儿茶素的单体或多聚体组合而成，儿茶素具有防治
心血管疾病、预防癌症等多种功能。它为还原性多元
酚类物质，在水溶液中易被空气氧化，常用作抗氧化
剂。右旋儿茶素还有降低毛细血管的通透性、止泻、
止血、抗病毒、杀真菌、及预防胃溃疡等多种作用，所
以将儿茶素的含量定为另一评价指标。根据各指标
成分在工艺选择中的主次地位，给予不同的加权系
数，求出综合评价指标 Y［11］。
2. 3. 2 各因素水平的确定 采用软件 Design-Expert
8. 0. 5 中的 Box-Behnken 试验设计原理，根据预实验
结果，选取乙醇浓度、液料比与提取时间 3 个因素，分
别以 A，B，C 表示，每个自变量的低中高水平分别以
－ 1，0，1 进行编码，总黄酮与儿茶素含量为响应值，
设计三因素三水平共 17 个试验点的响应面分析试
验。因素水平分析选取见表 1。
表 1 花生衣总黄酮提取工艺响应面因素水平编码
编码水平 乙醇浓度 /% 液料比 /倍 提取时间 /min
－ 1 20 1∶ 10 20
0 40 1∶ 15 30
1 60 1∶ 20 40
2. 3. 3 Box-Behnken试验设计方案 设计方案与试
验结果见表 2 ～表 3。
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表 2 Box-Behnken设计方案与试验结果
试验
编号
编码值
A B C
真实值
A乙醇浓度 /% B液料比 /倍 C提取时间 /min
总黄酮含量
Y1 /%
儿茶素含量
Y2 /%
综合评分
1 － 1 0 1 40 20 20 25. 63 0. 079 2 0. 92
2 － 1 0 0 60 10 30 23. 91 0. 071 4 0. 85
3 0 0 0 40 15 30 26. 80 0. 093 2 0. 98
4 0 0 0 40 15 30 26. 39 0. 089 4 0. 96
5 － 1 0 － 1 40 10 40 26. 04 0. 077 2 0. 93
6 1 0 － 1 60 15 20 25. 29 0. 076 5 0. 91
7 0 1 － 1 40 15 30 26. 59 0. 091 3 0. 97
8 0 － 1 1 60 15 40 25. 42 0. 081 0 0. 92
9 1 1 0 40 15 30 27. 22 0. 085 7 0. 98
10 0 0 0 40 15 30 27. 01 0. 087 6 0. 98
11 － 1 － 1 0 20 10 30 22. 19 0. 066 1 0. 79
12 0 0 0 40 20 40 25. 91 0. 081 8 0. 94
13 0 1 1 20 15 20 24. 53 0. 072 4 0. 88
14 1 － 1 0 40 10 20 25. 63 0. 073 6 0. 91
15 0 － 1 － 1 20 20 30 23. 91 0. 076 1 0. 87
16 1 0 1 20 15 40 23. 22 0. 075 9 0. 85
17 0 0 0 60 20 30 24. 73 0. 078 2 0. 91
表 3 二次回归方程方差分析
项 目 SS f MS F P
模型 15. 25 9 1. 69 13. 59 0. 001 2
A 1. 91 1 1. 91 15. 32 0. 005 8
B 0. 39 1 0. 39 3. 14 0. 119 8
C 0. 011 1 0. 011 0. 088 0. 775 8
AB 0. 1 1 0. 1 0. 81 0. 397 7
AC 0. 26 1 0. 26 2. 08 0. 192 3
BC 2. 650E － 003 1 2. 625E － 003 0. 002 1 0. 888 7
A2 9. 91 1 9. 91 79. 46 ＜ 0. 000 1
B2 2. 05 1 2. 05 16. 42 0. 004 9
C2 5. 608E － 003 1 5. 608E － 003 0. 045 ＜ 0. 838 1
残差 0. 87 7 0. 12 — —
失拟检验 0. 67 3 0. 22 4. 50 0. 090 0
纯误差 0． 20 4 0． 050 — —
总误差 16． 12 16 — — —
2. 3. 4 模型的建立及显著性检验 用软件分析响应
面的回归参数，建立各影响因素之间的数学模型，以
综合评分为响应值的方差分析可知，一次项 A ＜
0. 01，各因素对响应值 Y 的线性关系显著;二次项
A2、B2 对响应值(综合评分)Y 的曲面效应显著。利
用 Design-Expert 8. 0. 5 软件对表 3 数据进行多元回
归拟合，得到响应值 Y对乙醇浓度(A)、液料比(B)、
提取时间(C)的二次多项回归模型:Y = 19. 03 + 0. 49
× A +0. 22 × B － 0. 037 × C － 0. 16 × A × B + 0. 25 × A
× C －0. 026 × B × C －1. 53 × A2 － 0. 70 × B2 － 0. 03 ×
C2，方差分析结果见表 4。根据数理统计学的相关知
识分析，由表 3 可知，整体数学模型达到显著水平(P
＜ 0. 01) ，表明在试验因子与响应值确定的回归方程
中，其应变量与各个自变量之间的线性关系极显著，
说明该二次方程模型比较显著。模型的失拟项不显
著(P ＞ 0. 05) ，该方程对试验拟合较好，可以对不同
条件下的总黄酮含量进行预测。此外，该模型的变异
系数(CV)为 1. 97%，在可接受范围内。数学模型的
相关系数 r2 = 0. 943 2。综合分析表明用此模型来分
析和预测花生衣中总黄酮的提取工艺结果是比较合
适的。在回归方程模型中，对各因变量进行的方差分
析结果表明:模型一次项 A 差异极显著;交互项差异
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不显著;各个二次项 A2、B2 差异极显著，说明不能用
简单的线性关系来描述试验因素与响应值之间的关
系。从回归方程的系数值和方差分析结果可以看出，
在响应面的试验范围内，各个试验因素的主效应关系
为:乙醇浓度 ＞料液比 ＞提取时间。各个试验因素对
花生衣总黄酮得率影响的响应曲面及等高线见图 1
～图 3。
图 1 Y = f(A，B)的等高线图与响应面
图 2 Y = f(A，C)的等高线图与响应面
图 3 Y = f(B，C)的等高线图与响应面
经分析计算后可知，花生衣的最佳提取工艺参数
为:乙醇浓度为 39. 12%，液料比为 16. 27 倍，提取时
间为 31 min。但考虑到实际生产条件及方差分析结
果，确定优化提取条件为:提取溶剂为 40%乙醇，液
料比为 15 倍，提取时间为 30 min，并按此条件进行验
证实验。
从多元回归方程中，可以得到各个试验因素对花
生衣总黄酮得率影响的响应曲面及等高线图(图 1 ～
图 3)。由图响应面图可知，得到响应面图开口向下，
随着每个试验因素的增大，响应面对应的值相应增
大，当响应值增大到极值后，随着各因素的增大，响应
值逐渐减小。该模型有稳定点，最大值就是其稳定
点。
2. 3. 5 验证实验 按照响应面试验优选出的最佳工
艺条件重复 3 次，以验证该提取工艺条件是否具有重
现性。测定结果见表 4。
表 4 花生衣提取方法验证实验结果(n = 3)
序号 总黄酮含量 /% 儿茶素 /%
1 26. 72 0. 083 4
2 25. 94 0. 092 7
3 26. 43 0. 087 1
平均值 26. 36 0. 087 7
结果表明，响应面试验优选的花生衣提取工艺稳
定、可行。
3 小结
有关花生衣总黄酮提取方法的选择在预实验中
分别采用了超声提取法和回流提取法，以总黄酮及儿
茶素含量作为评价指标，结果两种方法的儿茶素得率
和总黄酮得率都相差不大，考虑到大生产的设备以及
经济条件等选择回流提取法。
在实验的因素水平设置中，采用单因素试验法，
对影响提取效率的浸提次数，浸提溶剂，液料比，浸提
温度，浸提时间等进行了考察，以总黄酮及儿茶素含
量作为评价指标，最终确定了试验中的因素水平数。
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