全 文 ：* 国家民委基金(12GXZ009);广西教育厅科学研究项目(YB2014101);广西民族大学引进人才科研启动项目(2011QD0024)
＊＊ 通信作者 Tel:(0771)3265023;E － mail:mzxyjiang@ 163． com
第一作者 Tel:(0771)3260558;E － mail:yanglf1990@ 163． com
★技术研发★
响应曲面法优选毛果鱼藤中香豆素类成分提取工艺的研究*
杨立芳1，刘洪存1，姜明国2＊＊，梁行1，李丹妮1
(1．广西民族大学 化学化工学院，广西林产化学与工程重点实验室，广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室，
南宁 530008;2．广西民族大学 海洋与生物技术学院，广西高校微生物与植物资源利用重点实验室，南宁 530008)
摘要 目的:采用响应曲面法优化毛果鱼藤中香豆素类化合物的提取工艺，提高香豆素类化合物的提取与分离效率。方法:以毛
果鱼藤藤茎为原料，采用 Box － Behnken设计实验，结合微波提取法，分别从料液比、乙醇体积分数和提取时间 3 个方面考察其对
香豆素类化合物提取效果的影响，以优化提取工艺;以毛果鱼藤中香豆素衍生物 Ｒobustin acid为考察指标，采用高效液相色谱法
进行检测。结果:毛果鱼藤中香豆素类化合物的优化提取工艺条件为微波功率为 400 W，提取温度为 70 ℃，提取时间为 11. 67
min，料液比为 1∶ 49. 67，乙醇体积分数为 86. 67%，香豆素提取率为 8. 90 mg·g －1;高效液相的最佳色谱条件为:检测波长为 254
nm，柱温为 30 ℃，流动相为乙腈 －0. 5%醋酸水溶液，梯度洗脱分离效果最佳。结论:以毛果鱼藤中香豆素衍生物 Ｒobustin acid
高效液相色谱为参考，采用 Box － Behnken响应曲面法优化了香豆素类化合物的提取工艺，提高了此类化合物的提取效率，为分
离毛果鱼藤藤茎中更丰富的香豆素类化合物奠定了基础。
关键词:毛果鱼藤;香豆素;提取分离;工艺优化;响应曲面法;高效液相色谱法
中图分类号:Ｒ 917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2015)03 － 0506 － 06
Optimization of extraction process for coumarins from Derris
eriocarpa How． by response surface methodology*
YANG Li － fang1，LIU Hong － cun1，JIANG Ming － guo2＊＊，LIANG － xing1，LI Dan － ni1
(1． Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products，Key Laboratory of Guangxi Colleges and Universities for Food Safety
and Pharmaceutical Analytical Chemistry，School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530008，China;
2． Guangxi University for Nationalities，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Botanical
Ｒesources，School of Marine Sciences and Biotechnology，Nanning 530008，China)
Abstract Objective:To optimize extraction process for coumarins from the stem of Derris eriocarpa by response
surface methodology，and improve extraction efficiency and productivity of coumarins from the stem of Derris eriocar-
pa． Methods:Extraction process of coumarins from the stem of Derris eriocarpa was optimized by Box － Behnken re-
sponse surface method combined with microwave extraction． Three aspects of ethanol volume fraction，solid － liquid
ratio and extraction time were investigated to evaluate their influence on extraction． The detection was performed by
HPLC with the coumarin derivative Ｒobustin acid as the investigation index． Ｒesults:The optimum conditions for
extraction of coumarins were found to be 400 W，70 ℃，11. 67 min，1∶ 49. 67(g·mL －1)，and 86. 67% for extraction
power，extraction temperature，extraction duration，solid － liquid ratio，and volume fraction of ethanol，respectively．
The efficiency of extraction under these optimum conditions was found to be 8. 90 mg·g －1 of coumarins． The opti-
mum HPLC conditions were the mobile phase of acetonitrile － 0. 5% acetic acid，the temperature of 30 ℃ and the
UV detection wavelength of 254 nm to achieve the best separation by gradient elution． Conclusion:The optimized
processing parameters of coumarin compounds were acquired by the Box － Behnken response surface method with
reference to the HPLC profile of the coumarin deriative Ｒobustin acid． This optimal experiment provided the optimal
—605— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(3)
conditions to improve efficiency and productivity of coumarins and laid a foundation for separation of rich varieties of
coumarin compounds in the stem of Derris eriocarpa How．
Keywords:Derris eriocarpa How．;coumarins;extraction separation;optimization of process technology;Box － Be-
hnken response surface method;HPLC
毛果鱼藤为豆科植物毛果鱼藤(Derris eriocarpa
How．)的干燥藤茎，别名土甘草，主要分布在广西、
广东等地区［1］。作为广西壮族民间验方的组成成
分之一，毛果鱼藤具有利尿除湿、镇咳化痰的功
效［2］，常用于膀胱炎、肾炎、尿道炎和咳嗽等症状的
治疗［1 － 3］。近年来，国内在毛果鱼藤的研究方面主
要有资源调查［4］、药材鉴别［5 － 6］、抗炎镇痛、止咳祛
痰等药理［2，7］及毒理学［8］等，但对其提取工艺、化学
成分、生物活性等方面的研究甚少［9 － 10］，毛果鱼藤
中香豆素类化合物提取工艺鲜有报道。有研究表
明，香豆素及其衍生物具有抗氧化、抗菌、抗微生物、
抗肿瘤、抗炎［11］、抗高血脂［12］及抗高血压［13］等多种
生物活性［14］，已引起了众多学者的关注。Box － Be-
hnken 效应面法能将各因素与响应值之间的函数关
系用多项式进行拟合，并通过对回归方程以及响应
面的分析寻求最佳工艺条件［15 － 19］。
为了高效提取出毛果鱼藤中的香豆素类化合
物，并深入了解、开发毛果鱼藤中香豆素类化学成分
及其生物活性奠定基础，笔者实验组曾对毛果鱼藤
进行了化学成分的初步研究，并从毛果鱼藤藤茎中
提取分离到 Ｒobustic acid等多种香豆素衍生物。实
验组在单因素考核的基础上，采用 Box － Behnken 效
应面分析法结合 HPLC法对毛果鱼藤中香豆素类化
合物的提取工艺进行了筛选、优化。
1 材料与方法
1. 1 仪器、试剂与材料
高效液相色谱仪 LC －15C(SHIMADZU);XH －
100A微波催化合成 /萃取仪(北京祥鹄科技发展有
限公司);SB － 3200DTDN 超声波清洗器(宁波新芝
生物科技股份有限公司)。
乙醇为分析纯;甲醇为色谱纯。
毛果鱼藤藤茎购自广西靖西，并经广西中医药
大学田惠教授鉴定为毛果鱼藤(Derris eriocarpa
How．)的藤茎。Ｒobustic acid为本实验室提取分离、
纯化，经核磁共振氢谱和碳谱检测为 Ｒobustic acid
(纯度:96. 3%)。
1. 2 实验设计与方法
1. 2. 1 单因素实验的设计
微波法提取毛果鱼藤藤茎中香豆素类化合物，
从料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取功率及提
取次数 5个方面进行考察，即料液比分别设定 1∶ 10、
1∶ 20、1∶ 30、1∶ 40 和 1 ∶ 50 共 5 组实验，乙醇体积分
数分别为 55%、65%、75%、85%及 95%水溶液进行
提取，提取时间分别考察了 10、15、20、25 和 30 min
共 5 组实验，提取功率分别考察了 200、300、400、
500、600 和 700 W 下的提取效率，提取次数分别考
察了 1、2、3 次。实验中，固定其中 4 个因素，对另一
因素进行单因素实验。
1. 2. 2 响应曲面实验的设计［20 － 21］
在单因素实验的基础上，根据实验结果，选取 3
个对提取效率影响较大的 3 个因素，运用 Box － Be-
hnken 响应曲面法［20 － 21］，对实验进行设计，考察 3
个因素对提取效果的影响。
1. 2. 3 含量的测定
1. 2. 3. 1 HPLC条件分析及样品检测 对毛果鱼藤
的提取液采用紫外全波长扫描，以确定高效液相色谱
法的检测波长;流速定为 1. 0 mL·min －1，考察比较甲
醇 －0. 5%醋酸水溶液、乙腈 － 0. 5%醋酸水溶液、甲
醇 －1%醋酸水溶液等流动相系统，并进行梯度洗脱。
1. 2. 3. 2 标准样品的制备及标准曲线的绘制 取
5 个质量浓度(1、0. 75、0. 5、0. 25、0. 1 mg·mL －1)的
香豆素 Ｒobustic acid对照品溶液分别进样，以峰面积
为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X) ，作回归方程。
1. 2. 4 供试品溶液的制备
准确称取粉碎的药材 5. 0 g，根据不同的试验要
求设定提取条件，置于微波炉中回流提取。将提取
液离心(3 000 r·min －1)10 min，取上清液，定容至
100 mL，作为供试品溶液。每次进样 10 μL，采用高
效液相色谱法进行检测。
2 实验结果
2. 1 色谱条件
色谱柱:WondasilTM C18 5 μm C /N5020 － 39003
(250 mm ×4. 6 mm，5 μm);流动相:乙腈 － 0. 5%醋
酸水溶液，梯度洗脱，程序见表 1;流速:1. 0 mL·
min －1;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃;
2. 2 线性关系
以峰面积积分值(Y)为纵坐标，以质量浓度
(X)为横坐标，作回归方程:
—705—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(3)
表 1 梯度洗脱条件
Tab． 1 Conditions for gradient elution
时间(time)
/min
乙腈 －0. 5%醋酸水溶液梯度变化
(gradient change of acetonitrile － 0. 5%
acetic acid water solution)
0 ～ 20 40∶ 60→60∶ 40
20 ～ 30 60∶ 40→60∶ 40
30 ～ 40 60∶ 40→80∶ 20
40 ～ 60 80∶ 20→80∶ 20
Y = 5 × 107X + 2. 445 × 105 r = 0. 999 6(n = 5)
结果表明Ｒobustic acid质量浓度在 0. 0 ～1. 0 mg·mL－1
内，线性关系良好。香豆素的含量与峰面积成正比，
即香豆素含量越高，峰面积越大。
2. 3 单因素实验结果
2. 3. 1 乙醇体积分数对提取率的影响
按照“1. 2. 4”项方法制备供试品溶液，以“2. 1”
项下条件进行检测。结果见图 1 所示，随着乙醇体
积分数的增加，香豆素提取率逐渐升高，当乙醇体积
分数为 85% 时，提取率最高。
图 1 乙醇体积分数对香豆素提取率的影响
Fig． 1 Effects of ethanol volume fraction on extraction yield of coumarins
2. 3. 2 提取时间对提取率的影响
按照“1. 2. 4”项方法制备供试品溶液，以“2. 1”
项下条件进行检测。结果见图 2 所示，随着提取时
间的增加，香豆素提取率逐渐升高，在 20 min 时，提
取率达到最大，随后又有降低。
2. 3. 3 提取功率对提取率的影响
按照“1. 2. 4”项方法制备供试品溶液，以“2. 1”
项下条件进行检测。结果见图 3 所示，随着提取功
率的增加，香豆素提取率呈折线状，提取率在 7. 0
mg·g －1左右浮动，在提取功率为 400 W 时，提取率
最高。
图 2 提取时间对香豆素提取率的影响
Fig． 2 Effect of extraction duration on extraction yield of coumarins
图 3 提取功率对香豆素提取率的影响
Fig． 3 Effects of the extraction power on extraction yield of coumarins
2. 3. 4 提取次数对提取率的影响
按照“1. 2. 4”项方法制备供试品溶液，以“2. 1”
项下条件进行检测。结果见图 4 所示，当分别提取
2 次或 3 次时，提取率几乎不变，在 7. 7 mg·g －1左
右，说明提取次数对提取效率的影响不大。
图 4 提取次数对香豆素提取率的影响
Fig． 4 Effects of extraction times on extraction yield of coumarins
—805— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(3)
2. 3. 5 料液比对提取率的影响
按照“1. 2. 4”项方法制备供试品溶液，以“2. 1”
项下条件进行检测。结果见图 5 所示，随着料液比
的增加，香豆素提取率逐渐升高，当料液比在 1 ∶ 40
时，提取率基本达到稳定。
图 5 料液比对香豆素提取率的影响
Fig． 5 Effects of ratio of solid to liquid on extraction yield of coumarins
2. 4 响应曲面实验结果
2. 4. 1 回归模型建立及方差分析
根据“2. 3”项中单因素实验结果，选取影响毛
果鱼藤香豆素提取率的料液比(A)、乙醇体积分数
(B)和提取时间(C)这 3 个主要因素作为考察因
素，组成三因素三水平实验。运用 Box － Behnken 方
法，对每个因素设 3 个水平，用代码 － 1、0、+ 1 表
示，共组合出 17 组实验。试验因素水平及编码见表
2。试验结果见表 3 所示，试验组 1 ～ 12 是析因实
验;试验组 13 ～ 17 是中心试验，试验重复 5 次。
表 2 响应曲面分析因素水平及编码
Tab． 2 Factors，levels and codes of
response surface analysis
水平
(coding
level)
因素(factor)
A料液比
(ratio of solid
to liquid)
B乙醇体积分数
(volume fraction
of ethanol)/%
C提取时间
(extraction
duration)/min
－ 1 30 75 10
0 40 85 20
+ 1 50 95 30
运用 Design － Expert 软件对上述 17 组响应曲
面实验进行数据分析处理，得到提取率与各个因素
之间的关系，回归方程如下:
Y = 8. 76 + 0. 34 × A + 0. 92 × B + 0. 014 × C － 1. 10 ×
AB － 0. 31 × AC + 0. 14 × BC － 1. 03 × i2 － 1. 27 × B2
+ 0. 90 × C2
表 3 响应曲面分析方案及结果
Tab． 3 Experimental design and results
of response surface analysis
序号
(number)
A B C
香豆素提取率
(yield of total coumarins)/(mg·g － 1)
1 － 1 － 1 0 3. 29
2 + 1 － 1 0 6. 69
3 － 1 + 1 0 8. 43
4 + 1 + 1 0 7. 44
5 － 1 0 － 1 8. 07
6 + 1 0 － 1 8. 84
7 － 1 0 + 1 9. 02
8 + 1 0 + 1 8. 56
9 0 － 1 － 1 8. 31
10 0 + 1 － 1 8. 75
11 0 － 1 + 1 7. 75
12 0 + 1 + 1 8. 75
13 0 0 0 8. 83
14 0 0 0 8. 80
15 0 0 0 8. 89
16 0 0 0 8. 8
17 0 0 0 8. 48
式中:A代表料液比，B 代表乙醇体积分数，C 代表
提取时间。各个系数的绝对值表示各项因素对香
豆素提取量的影响程度，“+”表示对提取率有正
影响，既积极影响;“ －”表示呈消极影响，既负
影响。
对表 3 的数据进行回归模拟，并进行数据分析，
从而得到表 4(回归模拟方程分析的各项数据)。
2. 4. 2 香豆素提取工艺响应曲面分析
利用 Design － Expert 软件中的 Box － Behnken
模型，通过响应曲面图中的响应值与各影响因素所
构成的三维空间图以及等高线图，可以直观地显示
各因素之间的相互作用，以及对香豆素提取率的影
响。结果见图 6、7、8 所示。
2. 4. 3 香豆素最佳提取工艺条件及验证
根据回归模型通过 Design － Expert 软件分析结
果，并从节能环保等方面综合考虑，选取较为环保的
提取方法，提取工艺条件为:提取时间为 11. 67 min，
料液比为 1∶ 49. 67，乙醇体积分数为 86. 67%，在此
条件下香豆素理论提取率为 8. 90 mg·g －1。为了便
于实际操作，选择提取时间为 12 min，料液比为
1∶ 50，乙醇体积分数为 87%，提取功率为 400 W 条
件下进行实验验证，提取率分别为 8. 83、8. 91、8. 87
mg·g －1，平均提取率为 8. 87 mg·g －1，预测值基本
吻合，说明预测模型与实际情况拟合较好。
—905—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(3)
表 4 回归模拟方差分析
Tab． 4 ANOVA for the regression model
方差来源(source) 平方和(sum of squares) 自由度 df 均方(mean square) F值(F value) P值(P value) 显著性(significance)
模型(model) 27. 25 9 3. 03 6. 39 0. 012 *
A 0. 92 1 0. 92 1. 95 0. 21
B 6. 72 1 6. 72 14. 16 0. 007 0 ＊＊
C 1. 51 × 10 － 3 1 1. 51 × 10 － 3 3. 19 × 10 － 3 0. 96
AB 4. 82 1 4. 82 10. 16 0. 015 *
AC 0. 38 1 0. 38 0. 8 0. 40
BC 0. 078 1 0. 078 0. 17 0. 70
A2 4. 49 1 4. 49 9. 47 0. 018 *
B2 6. 74 1 6. 74 14. 21 0. 007 0 ＊＊
C2 3. 37 1 3. 37 7. 11 0. 032 *
残差(residual) 3. 32 7 0. 47
失拟项(lack of fit) 3. 22 3 1. 07 41. 47 0. 001 8 ＊＊
纯误差(pure error) 0. 10 4 0. 026
综合(total) 30. 57 16
注(note):＊＊差异极显著(extremely significant difference)，P ＜0. 01;* 差异显著(significant difference)，P ＜0. 05
图 6 料液比和乙醇体积分数对香豆素提取率影响的响应曲面和等
高线
Fig． 6 Ｒesponse surface and contour showing the effects of ratio of solid
to liquid and ethanol volume fraction on extraction yield of coumarins
图 7 料液比和提取时间对香豆素提取率影响的响应曲面和等高线
Fig． 7 Ｒesponse surface and contour showing the effects of ratio of solid
to liquid and extraction duration on extraction yield of coumarins
图 8 乙醇体积分数和提取时间对香豆素提取率影响的响应曲面和
等高线
Fig． 8 Ｒesponse surface and contour showing the effects of ethanol vol-
ume fraction and extraction duration on extraction yield of coumarins
3 讨论
3. 1 检测波长的选择
通过紫外全波长扫描，发现提取物在 254 nm处
有较强吸收峰，且杂质峰相对较少，特征峰信息明
显，故选择 254 nm作为检测波长。
3. 2 流动相的选择
通过比较甲醇 －水、乙腈 －水、乙腈 － 0. 5%醋
酸水溶液、甲醇 － 1%醋酸水溶液等流动相的分离效
果，结果表明，乙腈 － 0. 5%醋酸水溶液分离效果最
佳，故选择此溶液系统作为流动相系统，进行梯度
洗脱。
3. 3 最佳工艺条件的确定
微波法提取毛果鱼藤中香豆素类成分的最佳工
—015— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(3)
艺条件为:微波功率为 400 W，提取温度为 70 ℃，提
取时间为 11. 67 min，料液比为 1 ∶ 49. 67，乙醇体积
分数为 86. 67%，在此条件下总香豆素理论提取率
为 8. 90 mg·g －1。对该实验进行验证，验证试验毛
果鱼藤香豆素平均提取率为 8. 87 mg·g －1，与理论
值(8. 90 mg·g －1)接近，表明 Box － Behnken 效应面
法应用于中药毛果鱼藤香豆素类化合物提取工艺筛
选具有可行性。实验证明，毛果鱼藤中含有较多种
香豆素类成分，且含量较高，具有很大开发、应用和
研究的价值。
3. 4 小结
本研究可为高效率地提取毛果鱼藤香豆素类成
分及进一步开发其药理活性作用提供可靠的实验基
础，同时也可为进一步开发和合理利用毛果鱼藤这
一药用植物资源提供参考数据。
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(本文于 2014 年 8 月 19 日收到)
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