全 文 ：毛果鱼藤黄酮类化合物提取工艺及抑菌作用的研究
杨立芳1， 刘洪存1， 许海棠1， 王 凯1， 姜明国2*
(1． 广西民族大学化学化工学院，广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530008 2． 广西民族大学
海洋与生物技术学院，广西 南宁 530008)
收稿日期:2014-01-11
基金项目:国家民委基金 (12GXZ009) ;广西民族大学重点项目 (2012MDZD041)
作者简介:杨立芳 (1969—) ，女，博士，高级实验师，硕士生导师，主要从事药物资源及药物活性研究。Tel: (0771)3260558，
E-mail:yanglf1990@ 163． com
* 通信作者:姜明国 (1973—) ，男，博士，教授，从事生物技术与生物活性评价。Tel: (0771)3260111，E-mail:mzxyjiang@163． com
摘要:目的 采用响应曲面方法优化中药毛果鱼藤中总黄酮的提取工艺，并考察毛果鱼藤总黄酮的体外抑菌作用。方
法 采用单因素试验结合 Box-Behnken 响应曲面法，以提取总黄酮量为考核指标，分别考察提取时间、提取功率、乙
醇体积分数、料液比、提取次数等因素对毛果鱼藤总黄酮提取效果的影响;采用纸片扩散法考察总黄酮的抑菌作用。
结果 提取毛果鱼藤总黄酮的最佳工艺条件为提取温度 70 ℃，提取功率为 500 W，用 44. 34 倍体积的 88. 18% 乙醇提
取 2 次，每次 24. 46 min;总黄酮对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，但对变形杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、铜
绿假单胞菌、白色念珠球菌、溶血性链球菌没有抑菌作用。结论 采用 Box-Behnken 响应曲面法可筛选出毛果鱼藤总
黄酮最佳提取方法，工艺可行;提取的总黄酮对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。
关键词:毛果鱼藤;黄酮;响应曲面法;抑菌作用
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:B 文章编号:1001-1528(2014)11-2413-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2014. 11. 046
毛果鱼藤为豆科植物毛果鱼藤 Derris eriocarpa How 的
干燥根、藤，别名土甘草，主要分布在广东、广西等地
区［1］。毛果鱼藤具有利尿除湿、镇咳化痰的功效，常用
于广西壮族民间验方，如治疗膀胱炎、肾炎、尿道炎、咳
嗽等症状［1-2］。因其民间用药的显著疗效，引起了越来越
多研究人员的关注。黄酮类化合物是毛果鱼藤中主要的活
性成分，有研究表明黄酮类化合物具有抗炎、抗 HIV［3-5］、
抗癌［6-8］、抗氧化［9-11］、降血脂、降血压［12］、降血糖［13］
等作用。近年来，国内有关毛果鱼藤的研究主要有资源调
查［14］，药材性状、薄层、紫外光谱的鉴别［15-16］以及抗炎
镇痛、止咳祛痰等药理［17-18］、毒理学［19］方面的研究，但
对其提取工艺、生物活性等方面的研究甚少［20］，对其总
黄酮提取工艺及抑菌作用的研究尚未见报道。采用 Box-
Behnken响应曲面法，可将各因素与响应值之间的函数关
系用多项式进行拟合，通过对回归方程以及响应面的分析
寻求最佳工艺条件［21-24］;采用纸片扩散法考察总黄酮提
取物对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌、肺炎双球
菌、铜绿假单胞菌、白色念珠球菌和溶血性链球菌的抑菌
作用。本研究以毛果鱼藤为原料，采用 Box-Behnken响应
面分析法对毛果鱼藤总黄酮的提取工艺进行优化，可为高
效率地提取毛果鱼藤总黄酮成分及进一步开发其药理作用
提供可靠的实验依据，同时也为进一步开发和合理利用毛
果鱼藤这一药用植物资源提供了参考数据。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 UVmini-1240 分光光度计 (Shimadzu 公司);
XH-100A微波催化合成 /萃取仪 (北京祥鹄科技发展有限
公司) ;SB-3200DTDN 超声波清洗器 (宁波新芝生物科技
股份有限公司);ZHJH-1109B 超净工作台 (上海智城分析
仪器制造有限公司) ;HHB11 电热恒温培养箱 (天津市实
验仪器厂)。
1. 2 试药 营养琼脂 (天津市英博生化世纪有限公司)。
阳性对照药:盐酸左氧氟沙星 (山东鲁抗医药，130701)、
阿莫西林胶囊 (先声药业，02-130701)、氨苄青霉素钠
(Sigma公司)、制霉菌素 (Kayon公司)。
毛果鱼藤藤茎购自广西靖西，经广西中医药大学田辉
教授鉴定为毛果鱼藤 Derris eriocarpa How藤茎。
芦丁对照品购于中国食品药品检定研究院 (批号
100080-200707)。
1. 3 菌种 金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌、肺炎
双球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠球菌、溶血性链球菌由
广西民族大学海洋与生物技术实验室提供。
2 实验结果与分析
2. 1 芦丁标准曲线的绘制［25-26］ 取芦丁对照品 25 mg，用
无水乙醇溶解，定容到 25 mL 量瓶中，摇匀，配制成质量
浓度为 1 mg /mL的芦丁标准溶液，保存，备用。
取上述芦丁标准溶液 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL
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于 25 mL 量瓶中，分别加入 5% NaNO2 溶液 1 mL，摇匀，
静置 6 min后加入 10% Al (NO3)3 溶液 1 mL，摇匀，静置
6 min后加入 4% NaOH 溶液 5 mL，定容至 25 mL。摇匀，
静置 5 ～ 10 min后，于 510 nm 波长处测定吸光度，每份样
品均检测 3 次。以标准溶液的质量浓度为横坐标，以吸光
度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程:y = 2. 306 5x －
0. 051 2，r = 0. 999 7。
2. 2 总黄酮提取工艺的优化
2. 2. 1 单因素试验
2. 2. 1. 1 提取时间对总黄酮提取率的影响 称取毛果鱼藤
5 份，每份 2. 0 g，70 ℃，400 W功率，用 20 倍体积的 95%
乙醇分别提取 10、15、20、25、30 min，提取 2 次，定容
到 100 mL量瓶中，在 510 nm测定，所有样品均检测 3 次。
结果 (见图 1)表明，随着提取时间的延长，总黄酮提取
量逐渐增加，但当提取时间达 25、30 min 时提取率改变不
大，从节约能源等因素考虑，选择 25 min 为最佳提取
时间。
图 1 提取时间对总黄酮提取率的影响
图 2 提取功率对总黄酮提取率的影响
2. 2. 1. 2 提取功率对总黄酮提取率的影响 称取毛果鱼藤
5份，每份 2. 0 g，70 ℃，用 20 倍体积的 95%乙醇分别在
功率为 300、400、500、600、700 W 提取 25 min，提取 2
次，定容到 100 mL 量瓶中，在 510 nm 测定，所有样品均
检测 3 次。结果如图 2 所示，随着提取功率的增大，在 500
W处出现小高峰，此后随着功率继续增加，提取量呈下降
趋势，故功率选择 500 W为宜。
2. 2. 1. 3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 称取毛果
鱼藤 7 份，每份 2. 0 g，70 ℃，功率为 500 W，分别用 20 倍
体积的 35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙
醇提取 25 min，提取 2 次，得到的提取液分别用相应体积
分数的乙醇定容到 100 mL 量瓶中，在 510 nm 测定，所有
样品均检测 3 次。结果如图 3 所示，随着乙醇体积分数的
增加，当乙醇体积分数为 85% 时，提取率最高，表明
85% 乙醇提取效果最佳。
图 3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
2. 2. 1. 4 料液比对总黄酮提取率的影响 称取毛果鱼藤 5
份，每份 2. 0 g，70 ℃，功率为 500 W，料液比分别为 1 ∶
10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50，用 85%的乙醇提取 25
min，提取 2 次，定容到 100 mL 量瓶中，在 510 nm 测定，
所有样品均检测 3 次。结果如图 4 所示，随着料液比增加，
黄酮提取率也随之增加，当料液比达到 1 ∶ 40 出现最高点，
继续增大料液比提取率变化不大，从减少试剂用量和保证
提取效率的综合因素考虑，选择最优的料液比为 1 ∶ 40。
图 4 料液比对总黄酮提取率的影响
2. 2. 1. 5 提取次数对总黄酮提取率的影响 称取毛果鱼藤
份 5 份，每份 2. 0 g，70 ℃，功率 500 W，料液比分别为
1 ∶ 40，用 85%乙醇提取 25 min，分别提取 1 次、2 次、3
次，定容到 100 mL 量瓶中，在 510 nm 处测定，所有样品
均检测 3 次。结果如图 5 所示，随着提取次数的增加，提
取率逐渐增加，提取次数由 2 次到 3 次时，总黄酮提取率
增加的幅度不大，说明总黄酮已提取完全，故提取次数选
2 次为宜。
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图 5 提取次数对总黄酮提取率的影响
2. 2. 2 Box-Behnken效应面法优化总黄酮提取工艺 综合
单因素试验结果，选取影响毛果鱼藤总黄酮提取率的提取
时间 (A)、料液比 (B)和乙醇体积分数 (C)这三个主
要因素作为考察因素，以总黄酮提取率为试验指标，采用
Design-Expert 8. 0. 6b 软件结合 Box-Behnken 设计法优化毛
果鱼藤总黄酮提取工艺。每因素设 3 水平，用代码 － 1、0、
+ 1 表示，试验因素水平及编码见表 1。
表 1 响应曲面分析因素水平及编码
水平
因素
A提取时间 /min B料液比 /倍 C乙醇体积分数 /%
－ 1 20 1 ∶ 30 7
0 25 1 ∶ 40 85
+ 1 30 1 ∶ 50 95
2. 2. 2. 1 毛果鱼藤总黄酮提取工艺回归模型建立及方差分
析 应用 Design-Expert 8. 0. 6b 软件中 Box-Behnken 设计分
析方案，试验结果如表 2 所示，试验组 1 ～ 12 是析因试验;
试验组 13 ～ 17 是中心试验，试验重复 5 次。
表 2 响应曲面分析方案及结果
试验号 A B C 总黄酮提取率 /(mg·g － 1)
1 － 1 － 1 0 2. 240
2 + 1 － 1 0 2. 001
3 － 1 + 1 0 3. 660
4 + 1 + 1 0 3. 371
5 － 1 0 － 1 3. 622
6 + 1 0 － 1 2. 652
7 － 1 0 + 1 3. 543
8 + 1 0 + 1 3. 426
9 0 － 1 － 1 2. 352
10 0 + 1 － 1 3. 566
11 0 － 1 + 1 2. 777
12 0 + 1 + 1 3. 872
13 0 0 0 4. 171
14 0 0 0 4. 191
15 0 0 0 4. 176
16 0 0 0 4. 186
17 0 0 0 4. 100
采用 Design-Expert软件对表 2 所得的数据进行统计分
析，分析结果如表 3 所示。对各因素进行回归拟合，得到
回归方程如下:
Y = 4. 16 － 0. 2A + 0. 58B + 0. 12C － 0. 012AB + 0. 21AC +
0. 076BC － 0. 64 A2 － 0. 7B2 － 0. 21C2
式中:A 为提取时间、B 为料液比、C 为乙醇体积分
数。各项系数的绝对值代表相应因素对黄酮提取量的影响
程度，系数的正负代表影响方向。由表 3 数据可以看出，
A、B、A2、B2 对黄酮提取率影响极显著，AC、C2 对黄酮
提取影响显著。A、B、C 三个因素中，对于毛果鱼藤黄酮
提取率的影响程度由大到小为 B ＞ A ＞ C。拟合模型的修正
相关系数平方 (Ｒ2)为 0. 979 0，即 97. 90%的数据可用此
方程解释;失拟项检验值 ＞ 0. 05，不显著;用上述方程描
述各因素与响应值的关系时，其变量和全体自变量之间的
线性关系 (Ｒ = 7. 77 /7. 94 = 0. 978 6)，模型的显著水平P ＜
0. 000 1，回归方差模型极显著，表明该方程可靠且对实验
拟合良好，无其他因素的显著影响，实验误差较小，可对
不同条件下的总黄酮提取率进行分析和预测。
表 3 回归模拟方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性
模型 7. 77 9 0. 86 36. 34 ＜ 0. 000 1 ＊＊
A 0. 33 1 0. 33 13. 27 0. 007 6 ＊＊
B 2. 73 1 2. 73 114. 87 ＜ 0. 000 1 ＊＊
C 0. 12 1 0. 12 5. 25 0. 055 7
AB 0. 000 62 1 0. 000 62 0. 026 0. 876 1
AC 0. 18 1 0. 18 7. 67 0. 027 7 *
BC 0. 023 1 0. 023 0. 98 0. 356 4
A2 1. 74 1 1. 74 73. 05 ＜ 0. 000 1 ＊＊
B2 2. 09 1 2. 09 87. 92 ＜ 0. 000 1 ＊＊
C2 0. 19 1 0. 19 7. 95 0. 025 8 *
残差 0. 17 7 0. 024
失拟项 0. 16 3 0. 054 38. 74
纯误差 0. 005 536 4 0. 001 38
综合 7. 94 16
注:差异极显著，＊＊P ＜ 0. 01;差异显著，* P ＜ 0. 05
2. 2. 2. 2 毛果鱼藤黄酮提取工艺的响应曲面分析 响应曲
面图中的响应值与各影响因素所构成的三维空间的曲面图
以及其在二维平面上的等高线图，可较为直观地反映出各
因素及各因素的相互作用对黄酮提取率的影响。
应用 Design-Expert 软件中的 Box-Behnken 模型，将影
响毛果鱼藤总黄酮提取率的一个因素固定为零水平，得到
另外两个因素对提取率的交互影响结果，其对应的响应曲
面及等高线，结果如图 6 ～ 8 所示。
图 6 结果显示，在料液比不变的条件下，随着提取时
间的增加，提取率先增加后降低，但是变化幅度不大。当
料液比在低水平时，提取率的变化不大，而且提取率比较
低;在高水平条件下，提取率变化较大。在提取时间不变
的情况下，随着料液比的逐渐增加，提取率呈现上升趋势，
且变化明显。由响应曲面图可以看出料液比与提取时间的
交互作用比较显著。
图 7 显示，在提取时间不变的条件下，随着乙醇体积
分数的增加，提取率稍有增加，但是变化幅度不大，且均
处于较高水平。在乙醇体积分数不变的情况下，随着提取
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图 6 料液比和提取时间对总黄酮提取率影响的
响应曲面和等高线
图 7 提取时间和乙醇体积分数对总黄酮提取率
影响的响应曲面和等高线
图 8 料液比和乙醇体积分数对总黄酮提取率影
响的响应曲面和等高线
时间的增加，提取率呈现上升趋势，且在 25 min 左右出现
峰值，随后又降低。由响应曲面图可以看出料液比与提取
时间的交互作用比较显著。
图 8 显示，在料液比不变的前提下，随着乙醇的体积
分数的增加，黄酮的提取率增加不明显。在乙醇的体积分
数不变的前提下，随着料液比的增加，黄酮的提取率呈递
增趋势，且在料液比为 1 ∶ 40 ～ 1 ∶ 45 的范围内，出现定
点，表示在此范围内提取率出现最大值。
2. 2. 3 毛果鱼藤总黄酮最佳提取工艺的验证 在选取的各
因素范围内，根据回归模型通过 Design-Expert 软件分析结
果，得出毛果鱼藤总黄酮的最佳提取工艺条件为:提取时
间为 24. 46 min，料液比为 1 ∶ 44. 34，乙醇体积分数为
88. 18%，在此条件下总黄酮理论提取率为 4. 322 mg /g。为
了便于实际操作，选择提取时间为 25 min，料液比 1 ∶ 45，
乙醇体积分数为 90%，提取功率为 500 W条件下进行实验
验证，提取率分别为 4. 297、4. 334、4. 323 mg /g，平均提
取率为 4. 318 mg /g，表明毛果鱼藤黄酮的提取率与预测值
基本吻合，说明预测模型与实际情况拟合较好。
2. 3 总黄酮抑菌试验的考察
2. 3. 1 总黄酮溶液的制备 称取毛果鱼藤 20 g，按照上述
实验得到的优化工艺条件进行毛果鱼藤总黄酮的提取，过
滤提取液，浓缩，得到总黄酮粗粉 3. 75 g (相当于总黄酮
85. 48 mg)，取粗粉 0. 88 g，用 1 mL DMSO 溶解，制成总
黄酮质量浓度为 20. 0 mg /mL的溶液，备用。
2. 3. 2 总黄酮的抑菌作用试验 用打孔器将定性滤纸打成
直径 6 mm的纸片，将纸片高压灭菌，烘干，在无菌的条
件下，用镊子将灭菌后的纸片放入“2. 3. 1”项中制备好
的黄酮溶液中浸泡;用涂布法将各供试菌液涂布接种在培
养基上，再用镊子将浸泡在黄酮溶液中纸片放入到培养基
上，药敏片做为阳性对照，DMSO 浸润的滤纸片作为阴性
对照 (－)，然后将培养皿置于 37 ℃的培养箱中培养 24 h，
测量抑菌圈的直径 (Ф)。判断标准:Φ ＞ 6 mm，判为有抑
菌作用;Ф≤6 mm，判为无抑菌作用; －为无效，10 mm ＞
Ф ＞ 6 mm 为低度敏感 (+);15 mm ＞Ф ＞ 10 mm中度敏感
(+ +) ;Ф ＞ 15 mm为高度敏感 (+ + +) ;结果如表 4 所
示，毛果鱼藤总黄酮提取物质量浓度为 20. 0 mg /mL时，对
金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，属于高度敏感，但对
大肠杆菌、变形杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、肺炎
链球菌、血溶性链球菌却没有抑菌作用。
表 4 总黄酮的抑菌作用及结果判定
菌种
抑菌圈直径(mm)/ 结果判定
总黄酮(20 mg /mL) 阳性对照(25 μg /mL)
金黄色葡萄球菌 15. 9(+ + +) 35. 3(氨苄青霉素钠)
变形杆菌 — 33. 7(盐酸左氧氟沙星)
大肠杆菌 — 27. 6(盐酸左氧氟沙星)
铜绿假单胞菌 — 29. 8(盐酸左氧氟沙星)
白念球菌 — 19. 7(制霉菌素)
肺炎链球菌 — 24. 8(阿莫西林胶囊)
血溶性链球菌 — 22. 5(阿莫西林胶囊)
3 结论
本研究以毛果鱼藤总黄酮提取率为指标，通过单因素
试验就料液比、提取时间、乙醇体积分数、提取功率和提
取次数对毛果鱼藤总黄酮提取率的影响进行考察;在此基
础上，利用 Design-Expert 软件结合 Box-Behnken 设计法设
计响应曲面试验，建立了数学模型，预测得到了最优的提
取工艺参数，分别为:提取时间为 24. 46 min，料液比为
1 ∶ 44. 34，乙醇体积分数为 88. 18%，在此条件下总黄酮理
论提取率为 4. 322 mg /g，并对实验进行验证，验证试验毛
果鱼藤总黄酮平均提取率为 4. 318 mg /g，与理论值 (4. 322
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mg /g)接近，表明 Box-Behnken 效应面法应用于中药提取
工艺筛选具有可行性。此外通过对毛果鱼藤总黄酮提取物
进行体外抑菌作用研究，表明质量浓度为 20. 0 mg /mL毛果
鱼藤总黄酮对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，但对变
形杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、白色念
珠球菌、血溶性链球菌均没有抑菌作用。毛果鱼藤总黄酮
作用于金黄色葡萄球菌的具体的抑菌活性的成分、及抑菌
作用机制还有待进一步研究。
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2014 年 11 月
第 36 卷 第 11 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
November 2014
Vol． 36 No． 11