全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Biotechnology　2001 ,8(5):279 ～ 283
灰树花多糖体内抗肿瘤作用的实验研究
孙　震 ,陈石良 ,谷文英 ,陶文沂
(无锡轻工大学食品学院 , 无锡 214036)
　　摘　要　灰树花是近年来开发出来的一种珍稀食药两用真菌。灰树花多糖具有明显的抗肿瘤和免疫调节
活性。动物体内实验灰树花发酵菌丝体多糖和发酵液多糖具有显著的抗肿瘤活性。其抑瘤率分别为 80.5%和
58.4%～ 63.8%。灰树花多糖还能增加小鼠免疫器官脾脏的重量 ,增加小鼠腹腔巨噬细胞数量和吞噬功能 ,提高
机体的免疫力。急性毒性实验 ,灰树花发酵液及发酵多糖对小鼠的最大安全量不低于 3g/kg , 发酵浓缩液对小鼠
的最大安全剂量不低于 30ml/ kg。
关键词　灰树花;抗肿瘤;免疫调节剂;安全性;
中图分类号:R965　　文献标识码:A　　文章编号 1005-8915(2001)05-0279-05
　　灰树花 [ Grifola frondosa (Dick , ex Fr.)S.F.
Groy]又名栗子蘑 、莲花菌 、贝叶多孔菌 、千佛菌 、叶
奇果菌 、云蕈等 , 日本人称为 マィタケ(舞茸 ,
Maitake)。在分类学上灰树花隶属于担子菌亚门 ,
层菌纲 ,非褶菌目 ,多孔菌科 ,树花菌属 ,是一种天
然的珍稀食药两用菌[ 1] 。
灰树花多糖的抗癌能力明显优于灵芝多糖 、香
菇多糖和云芝多糖[ 2] 。在日本 ,自古以来就把灰树
花作为野生草药用于治疗胃癌 、食道癌 、乳腺癌 、前
列腺癌 。最近 ,美国食品与药物管理局(FDA)允许
灰树花多糖作为癌症的有效抑制剂 ,直接进行 Ⅱ期
临床试验。灰树花多糖抗癌的机理与其它真菌多
糖制剂类似 ,即并非直接杀死肿瘤细胞 ,而是通过
激活机体免疫系统 ,增加巨噬细胞的吞噬作用 ,促
进免疫球蛋白的形成 ,升高白细胞 ,提高淋巴细胞
转化率并提高机体本身的抗病能力 ,从而达到抵抗
癌细胞生长 ,防止肿瘤转移 ,预防正常细胞癌变的
目的[ 3] 。
免疫赋活是灰树花多糖的一个重要特征 ,而且
多糖的抗肿瘤活性与免疫力的提高是密切相关
的[ 4] 。因此 ,通过免疫功能的研究 ,可进一步探讨
多糖抗肿瘤作用的机理。为此 ,我们对灰树花多糖
的免疫学性质进行了研究 ,同时在实验中设计了急
性毒性试验来初步评价发酵液及发酵液多糖的毒
性 ,以便为后期产品的开发应用提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
(1)多糖溶液　将灰树花菌丝体匀浆水提液及
发酵浓缩液各加 3倍乙醇沉淀过夜 ,沉淀经 Swvag
与酶法结合脱蛋白 ,乙醚脱酯 ,H2O2 脱色后 ,离心
得菌丝体水溶性多糖(GMP)和发酵液多糖(GLP)。
将GMP 和 GLP 配成各种所需浓度溶液 ,采用 3日
间歇法煮沸灭菌 ,离心取上清液备用。
(2)实验动物　小鼠购自江苏省原子能医学研
究所动物房 ,昆明种小鼠 ,6周龄 ,体重 20+2g , ♀
♂兼用。
(3)肿瘤模型　移植性小鼠肿瘤肉瘤 180(S-
180)腹水型 ,购自中科院上海药物研究所肿瘤组 。
1.2　实验方法
1.2.1　抗肿瘤实验[ 5] 　取接种 7d的小白鼠 S -
180腹水瘤细胞 ,用生理盐水稀释成 1×106 个/ml
的瘤细胞悬液 ,以每鼠 0.2ml接种于小鼠右前肢腋
皮下 。接种 24h后小鼠随机分组 ,每组 12只 , ♀♂
随机 ,同时开始每日 ip给药一次 ,每次每鼠给药体
积为 0.5ml ,连续 10d ,对照组给予等量无菌生理盐
水。停药 24h后处死动物 ,剥离瘤块 ,称重并计算
肿瘤抑制率。肿瘤生长抑制率按下式计算:
279
收稿日期:2001-01-12
作者简介:孙震(1966年生),女 ,山西太原人 ,讲师 ,医学硕士 ,主要从事微生物学及免疫学方面的研究
肿瘤抑制率%=C-T
C
×100
式中 C为对照组平均瘤重 ,T为实验组平均瘤
重。
1.2.2　免疫功能实验
1.2.2.1　正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能实验[ 5]
　昆明种鼠 ,每组 8 只 ,腹腔注射给药 ,分不同剂
量 ,每只 0.2ml ,每日 1 次 ,连续 7d ,对照组给等量
生理盐水 。于末次给药后的次日 ,各组腹腔注射浓
度为 5×106个/ml用阿氏液保存的鸡红血球悬液
(1ml /只),间隔 30min后用生理盐水洗脱收集小鼠
腹腔液 ,涂片 。以 1∶1丙酮-甲醛液固定 ,姬姆萨-
瑞氏染色液染色 ,用油镜计数 100个巨噬细胞中吞
噬鸡红血球的巨噬细胞数目及吞噬鸡红血球的总
数 ,并按下列公式计算吞噬百分比和吞噬指数 。
吞噬百分比=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数 ×100%
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数
1.2.2.2　对小鼠免疫器官重量的影响[ 6]取正常昆
明种小鼠随机分组 ,每组 12只 ,腹腔注射多糖溶
液 ,对照组给等量生理盐水 ,连续 10d ,给药结束后
次日解剖 ,取出小鼠脾脏和胸腺称重 ,并按下式计
算脾指数和胸腺指数。
　脾指数=脾脏平均重量(mg)平均体重(g)
　胸腺指数=胸腺平均重量(mg)平均体重(g)
1.2.3　急性毒性实验[ 7]取正常健康昆明种小鼠 ,
♀♂各半 ,每组 10只 ,多糖设 1g/kg 和 3g/kg 2 个
剂量组 ,发酵液(浓缩至 1/5)设 15ml/kg 和 30ml/kg
2个剂量组 ,采用灌胃法 1次给药 ,喂养 1周后 ,观
察动物死亡数目 、体重增长和进食等情况。
2　结　果
2.1　多糖的抗肿瘤活性
实验设对照和给药组 ,给药组 GMP 为 50mg/
(kg·d),GLP 为 50mg ,100mg ,200mg/(kg·d), ip ,连
续 10d ,观察多糖对小鼠 S-180的抑瘤作用 。结果
表明 ,灰树花多糖在对宿主生存数和体重均无明显
影响的情况下 ,对小鼠 S-180 的生长具有明显的抑
制作用。其中菌丝体水溶性多糖GMP 对 S-180的
抑制率达 85%,发酵上清液多糖GLP 对S-180的平
均抑制率达 61.6%(表 1),多糖组与生理盐水对照
组之间的差异均达到极显著水平(P<0.01)。
Tab　1　Inhibition effect of GMP on S-180
Group
Medication
route
Dose
mg/(kg·d)
No.of mice
Initiation Termination
Weight increase
of mice
(g)
Tumor
weight
(mg)
Inhibition
ratio
(%)
Control ip - 12 12 4.7 292.8±23.8 -
GMP ip 50 8 8 4.3 57.1±8.3 80.5＊＊＊
GFP ip 50 12 12 5.4 117.7±14.1 63.8＊＊＊
ip 100 12 12 4.8 122.3±27.5 62.5＊＊＊
ip 200 12 12 5.6 135.5±10.8 58.4＊＊＊
＊＊＊ P< 0.01 , Compared with control
2.2　多糖对小鼠 S-180肿瘤组织病理形态学的影
响
将给药组和生理盐水对照组的瘤块作组织切
片 ,常规 HE 染色 ,镜下观察肿瘤组织病理形态学
变化。病理检查结果:(1)对照组瘤体在脂肪组织
中呈浸润性生长 ,扩散快 ,瘤体与周围脂肪组织之
间界限不明显 ,而给药组瘤体与周围组织的界限较
为清楚(图 1);(2)对照组肿瘤组织出现多灶性坏
死 ,而给药组坏死仅见于中心区域(图 2);(3)对照
组和给药组镜下所见细胞形态相同 ,瘤细胞显著异
形 ,核仁明显 ,对照组核分裂相平均每高倍视野 4
个 ,而给药组为2个 。
2.3　多糖对小鼠免疫器官重量的影响
胸腺和脾脏是动物的重要免疫器官 ,胸腺指数
和脾脏指数的大小直接反映机体免疫水平的高低 。
灰树花多糖对小鼠脾脏和胸腺重量的影响见表 2。
280 药 物 生 物 技 术 第 8 卷第 5期
A:Control　　　B:Treatment
The border between tumor and fat tissue(40×)
Fig 1　Photomicrograph of transplant tumor S-180 showing
A:Control　　B:Treatment
Necrotic tissue of tumor(40×)
Fig 2　Photomicrograph of transplant tumor S-180 showing
Tab 2　Effect of GMP and GLP on spleen and thymus weight in mice
Group No.of mice Medication
route
Dose
mg/(kg·d) Spleen index Thymus index
Control 12 ip - 　　　6.3±0.32 2.1±0.08
GMP 12 ip 200 　　　9.8±0.46＊＊＊ 2.3±0.07
GLP 12 ip 200 　　　8.7±0.52＊＊＊ 2.0±0.11
　　＊＊P<0.05 , ＊＊＊P<0.01 , Compared with control
　　从表中可以看出 ,灰树花多糖可明显增加小鼠
脾脏重量。与对照组比较 ,GMP 组和 GLP 组的脾
指数分别增加 0.56倍和 0.38倍 ,但胸腺重量无显
著差异 。说明灰树花多糖对健康小鼠的脾脏有影
响 ,而对胸腺的影响不明显。
2.4　多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响
多糖对小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)的数量及吞噬
活性的影响见表 3。
Tab 3　Effect of GMP and GLP on macrophage phagocytosis of normal mice
Group
No.of
mice
Medication
route
Dose
mg/(kg·d)
Phagocytic
percent±SD
　　Phagocytic
index±SD
Control 12 ip - 24.30±2.2 0.146±0.05
GMP 12 ip 50 37.20±1.6＊＊＊ 0.610±0.09＊＊＊
12 ip 100 45.80±2.1＊＊＊ 1.170±0.12＊＊＊
12 ip 200 66.00±2.8＊＊＊ 1.380±0.17＊＊＊
GFP 12 ip 50 25.00±1.8＊＊＊ 0.401±0.13＊＊＊
12 ip 100 32.18±2.4＊＊＊ 0.575±0.20＊＊＊
12 ip 200 49.25±1.9＊＊＊ 0.630±0.15＊＊＊
　　＊＊P<0.05 , ＊＊＊P<0.01 , Compared with control
　　表3结果显示 ,无论是菌丝体多糖还是发酵液
多糖 ,无论是低剂量组还是高剂量组 ,其吞噬百分
率和吞噬指数都比生理盐水对照组明显增加 ,其中
菌丝体多糖组吞噬百分率比对照组增加 1.5 ～ 2.8
倍 ,吞噬指数比对照组增加 4.2 ～ 9.5倍 ,发酵液多
糖组吞噬百分率比对照组增加 1.3 ～ 2.5倍 ,吞噬
指数增加 4.8 ～ 7.5倍 。从表中还可看出 ,菌丝体
多糖组比发酵液多糖组吞噬效果好;高剂量组较低
剂量组效果好 ,由此说明 ,两类多糖对小鼠腹腔巨
噬细胞均有活化和促进增殖的作用 ,且存在量效关
系。
肿瘤的发生伴随着机体免疫力的减弱 ,而免疫
功能低下又是癌变的原初引发机制。灰树花多糖
可激活小鼠腹腔Mφ,增强其吞噬消化作用 ,并全面
281孙　震等:灰树花多糖体内抗肿瘤作用的实验研究
提高机体的免疫力 ,从而达到杀伤癌细胞之目的 ,
这可能是灰树花多糖抗肿瘤作用的主要方式 。
2.5　灰树花发酵液及其粗多糖毒理学初步评价
Tab 4　The Experimental results of acute toxicity of fermentation products of Grifola frondosa
Group
Dose
g(ml)/ kg
No.of
mice
Medication
route
Weight increase
of mice(g)
Mortality
of mice
Fermented
liquid
15 10 po 3.85 0
30 10 po 4.02 0
GMP 1 10 po 4.30 0
3 10 po 4.51 0
GLP 1 10 po 4.26 0
3 10 po 3.97 0
　　小鼠给药后未见死亡 。小鼠食欲 、精神 、毛色
等均正常 ,未见有由于药物引起的病变和中毒现
象 ,说明灰树花发酵液及其多糖毒性很小 ,灰树花
多糖对小鼠的最大安全剂量不低于 3g/kg ,发酵浓
缩液对小鼠的最大安全剂量不低于 30ml/kg 。
3　讨　论
本实验首次在国内对灰树花发酵多糖的体内
抗肿瘤作用和免疫活性以及毒理学进行了初步检
测与评价 ,以肿瘤动物模型(S-180)测定了灰树花
发酵液多糖(GLP)和发酵菌丝体多糖(GMP)的抑瘤
效果 ,其抑瘤率分别为 58.4%～ 63.8%和 80.5%。
这一结果低于日本人报道的抑瘤率(81% ～
100%)[ 8 , 9] ,可能性是由于各自采用的菌种 、多糖组
分以及实验动物与肿瘤模型不同所致。但是 ,灰树
花多糖的抗肿瘤效果明显优于近年来国内学者报
道的同类真菌多糖如香菇多糖[ 10] 、云芝多糖 、金针
菇多糖[ 11]等 。根据新药审批办法规定:中草药提
取物实体瘤抑制率大于 30%,经统计学处理有显
著差异者 ,则认为该药有一定疗效[ 12] 。我们利用
深层发酵法制取的灰树花多糖的抑瘤率均在 30%
以上 ,显示有较强抗肿瘤作用 ,符合抗癌药物筛选
标准 。
灰树花发酵多糖还能增加小鼠免疫器官脾脏
的重量 ,增加小鼠腹腔Mφ数量 ,增强Mφ的吞噬功
能 ,提高机体的免疫力 ,达到杀伤癌细胞之目的 ,可
能是灰树花多糖抗肿瘤作用的主要方式。
参 考 文 献
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282 药 物 生 物 技 术 第 8 卷第 5期
Fractionation and Antitumor Activity of Polysaccharide from Grifola
frondosa
SUN Zhen ,CHEN Shi-liang ,GU Wen-ying ,TAO Wen-yi
(School of food science and technology , Wuxi University of Light Industry , Wuxi 214036)
Abstract　Grifola frondosa is a edible and medical fungus which has been cultured in recent years.Polysaccharide
from G.frondosa possess antitumor and immunomodulating activity.The animal test showed the crude polysaccharide
mycelium and ferment liquid of G.frondosa could inhibit the growth of Sarcama-180 in mice.The inhibition ratio of
GMP (polysaccharide from the mycelium)was 80.5%, whereas GLP (polysaccharide from the ferment liquid)was
58.4%～ 63%.The crude polysaccharides could significantly promote the function of the mouse macrophages engulf-
ing CRBC in vivo and increase the quantity of macrophages and thymus weight in mice.The acute toxicity of crude
polysaccharide and ferment liquid to mouse were tested.The results indicated that the maximum safe dose of crude
polysaccharides to mouse was above 3g/kg , whereas of ferment liquid to mouse was above 30ml/kg.
Key words　 Grifola frondosa , Antitumor , Immunomodulating , Safety
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283孙　震等:灰树花多糖体内抗肿瘤作用的实验研究