全 文 ：
对羟基苯甲醇对灰树花产胞外多糖的影响及其发酵动力学
朱俊杰1，吴天祥1,2*，吴彩云1，刘 昕1，赵群丽1
（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省发酵与酿造重点实验室，贵州 贵阳
550025）
摘 要：通过向灰树花发酵液中添加不同浓度梯度的对羟基苯甲醇，分析其对灰树花菌体生长和胞外多糖合
成的影响，并且进一步研究了添加对羟基苯甲醇后发酵液中菌丝体生长、残糖（还原糖）含量、胞外多糖含
量、pH值、对羟基苯甲醇和天麻素含量的变化情况，做了动力学分析。结果表明：当对羟基苯甲醇添加量为
200mg/L 时效果最佳，相比于空白组（未添加对羟基苯甲醇）使菌丝量提高了 22.73%，胞外多糖含量提高了
10.24%，均显著高于空白组（P＜0.05）。动力学研究结果表明：在整个发酵过程中，灰树花生长从第 8d 趋
于稳定，葡萄糖作为碳源不断被消耗并且胞外多糖逐渐合成，到第 10d 趋于稳定。此外，对羟基苯甲醇含量
减少，部分转化为天麻素。这些为以后生产实际提供了理论依据。
关键词：对羟基苯甲醇；灰树花；胞外多糖；菌丝量；发酵动力学
Effect of p-hydroxybenzyl alcohol on the biosynthesis of exopolysaccharide by submerged
culture of Grifola frondosa and fermentation kinetics
ZHU Jun-jie 1, WU Tian-xiang *1,2, WU Cai-yun 1, LIU Xin 1 , ZHAO Qun-li 1
（1. School of Liquor & Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025,China; 2. Key Laboratory of
fermentation & brewing of Guizhou Province, Guiyang 550025,China）
Abstract：Different concentration gradient of p-hydroxybenzyl alcohol were added to the submerged culture of
Grifola frondosa, we tested Grifola frondosa growth and extracellular polysaccharide production. Meanwhile, we
studied the mycelium growth, reducing sugar content, extracellular polysaccharide content, pH value, the hydroxy
benzene methanol and the changes of the content of gastrodin in submerged culture of Grifola frondosa. We also
made a dynamic analysis. Results showed that the effect is best when the p-hydroxybenzyl alcohol content is 200
mg/L. Grifola frondosa growth increased by 22.73% and extracellular polysaccharide content increased by 10.24%
than in the blank group (not add to hydroxy benzyl alcohol) (P < 0.05). Dynamics research results showed that the
growth of Grifola frondosa was stable at 8d, glucose as carbon source was consumed and the production of
extracellular polysaccharide was stable at 10d. In addition, the content of gastrodin increased with p-hydroxybenzyl
alcohol reduced. This provides theory basis for the actual production in the future.
Key words：p-hydroxybenzyl alcohol; Grifola frondosa; extracellular polysaccharide; biomass; fermentation kinetics
中图分类号： Q936 文献标志码：A 文章编号：

灰树花（Grifola frondosa），俗称栗蘑，又名贝叶多孔菌，属于担子菌亚门（basidiomycotina），
多孔菌科（polyporaceae），是一种含丰富营养物质的药食两用真菌。其中灰树花多糖是其主要生物活
性物质，具有抗肿瘤[1-2]、抗氧化[3-4]、抗HIV[5]、清除自由基[4]等生物活性。采用液体发酵培养来获得药
用真菌多糖被认为是一种快速、高效、经济的方法。为了最大量获得真菌胞外多糖，很多研究在药用真
菌液体发酵体系中添加一定的刺激物，来促进菌丝体生长和代谢产物合成[6-7]。LIU Gao-qiang [8]等发现
通过添加乙酸乙酯到灵芝液体发酵培养基中可显著促进灵芝多糖的合成和菌丝体生长。YANG Hai-long[9]
等发现通过添加乙醇到灵芝液体发酵培养基中可显著促进灵芝多糖的合成和菌丝体生长。TANG
Ya-jie[10]研究同样也发现乳糖可以促进灵芝菌体生长和胞外多糖合成。而在灰树花液体发酵过程中，
Hsieh[11-12]等添加植物油和橄榄油，CHEN Hua-bing 等[13]添加适量聚乙二醇，候晓梅[14]等添加适量的白
花蛇草、黄芪、连翘、薏苡仁等中药，赵亮[15]等添加苦荞、山药均可以促进灰树花细胞生长和胞外多糖
的合成。此外，微生物能产生丰富的酶系可以用来发酵转化中药， Kim[16]等研究发现灰树花可以将牛

项目来源：国家自然科学基金项目[2014]31460537号
1作者简介：朱俊杰(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物。E-mail:15761621242@163.com
*通信作者：吴天祥(1965-),男，教授，博士，研究方向：发酵工程与生物转化。E-mail: ce.txwu@gzu.edu.cn
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网络出版时间：2016-01-08 16:51:30
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160108.1651.048.html

蒡子苷转化为牛蒡子，朱红莉[17]等筛选到一株华根霉可以转化对羟基苯甲醛合成天麻素，董亚成[18]等利
用黄绿蜜环菌将对羟基苯甲醇转化合成天麻素。
本课题组承担了国家自然科学基金项目“天麻提取物有效成分对灰树花发酵的代谢影响及机理研
究”课题，前期研究结果表明，在灰树花液体发酵体系中添加天麻提取物可显著促进灰树花细胞生长和
胞外多糖的生物合成[19-23]。但是天麻本身是一种中药且价格昂贵。因此，本实验在灰树花发酵培养基中
添加天麻素的前提物质对羟基苯甲醇，分析不同浓度的对羟基苯甲醇对灰树花发酵过程中菌体生长和胞
外多糖合成的影响，并且动态分析了添加对羟基苯甲醇后发酵液中菌丝体生长、残糖（还原糖）含量、
胞外多糖含量、pH值、对羟基苯甲醇含量的变化情况。此外还研究了是否存在转化对羟基苯甲醇和成天
麻素。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂
灰树花菌株（Grifola frondosa，菌种编号：51616） 购自于中国微生物菌种保藏管理中心；天麻素
和对羟基苯甲醇 美国 Sigma 公司；其余试剂均为市售分析纯。
1.2 仪器与设备
BXM-30R立式灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TG2-16G低速离心机，上海安亭科学仪
器厂； SW-CJ-1D净化工作台，苏州净化设备有限公司； Agilent 1100高效液相色谱仪及检测器，Agilent
公司。
1.3 培养基
斜面培养基：PDA培养基。
液体种子培养基：葡萄糖30 g/L，酵母膏6 g/L，蛋白胨2 g/L， MgSO4•7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，
pH自然。
发酵培养基：葡萄糖50 g/L，酵母膏6 g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO4•7H2O 2 g/L，KH2PO4 2 g/L，pH自
然。
1.4 培养方法
1.4.1 斜面种子培养
于母种试管中挑取黄豆粒大小的菌丝块接于PDA试管斜面中部，置于25℃恒温培养9d。
1.4.2 液体种子培养
先将斜面试管培养基上的菌丝用接种铲轻轻刮下，加入一定量的无菌水以使菌丝与固体培养基脱
离，然后倒入250 mL三角锥形瓶液体种子培养基中，置于恒温摇床中在25℃、150 r/min、摇床培养4-7d。
三角锥形瓶中应长出大量均匀细小的菌丝球且菌液澄清为最佳。
1.4.3 发酵培养
在无菌条件下，按10%的接种量接种。用移液枪量取液体种子，接种于发酵培养基中。250mL三角
锥形瓶装液量为100mL、25℃、150r/min、摇床培养14d。

1.5 分析方法
1.5.1 菌丝体生物量的测定
灰树花生长以其菌丝体生物量为指标。将发酵培养后的培养基进行过滤固液分离，得到菌丝体，菌
丝体再用蒸馏水冲洗3次，于数显鼓风干燥箱中60℃烘干至恒重，称重即得菌丝体生物量（干重）。
1.5.2 葡萄糖的测定
采用DNS法测定，取lmL发酵液于50mL容量瓶中并用蒸馏水定容，取定容后的1 mL稀释液于25 mL
的比色管中，与1.5mL DNS溶液混匀，在沸水中煮沸5min定容至25mL，于520nm处测光度值。
1.5.3 胞外多糖（EPS）含量测定
取上述滤液，加入4倍体积95%乙醇，于4℃冰箱中静置24 h。然后离心(4000r/min，15min)，去除上
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清液，再用95%乙醇清洗沉淀3次，最后将沉淀在60℃下烘干，再加蒸馏水溶解，用苯酚-硫酸法测定胞
外多糖含量。
1.5.4 高效液相色谱（HPLC）检测条件
取1mL发酵液进行膜过滤（45µm）用于HPLC检测，色谱柱： Agilent TC-C18 (4.6mm×250mm，5µm)；
流动相：0.1%磷酸水（A）和乙腈（C）。洗脱梯度：0-35min C：3%-30% (v/v)；35-45min，C：30%-70%
(v/v)。流速1mL/min，柱温30℃，进样量20µL,检测波长221 nm。
1.6 统计方法
所有的试验都做三个平行，得到的实验数据取平均值±标准偏差。使用 SPSS17.0 分析显著性，用
Origin 9.0 和 Excel2010做图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的对羟基苯甲醇对灰树花生物量和胞外多糖合成的影响

图 1. 不同浓度的对羟基苯甲醇对灰树花生物量和胞外多糖的影响
Fig.1 Effect of the concentrations of p-hydroxybenzyl alcohol on biomass and extracellular polysaccharide productions by
submerged culture of G. frondosa.
在灰树花发酵液中添加不同浓度的对羟基苯甲醇，发酵8d后菌丝生物量和胞外多糖如图1所示。随
着对羟基苯甲醇浓度的增加，灰树花菌丝生物量和胞外多糖均先增加至最大量后降低，这说明了一定浓
度的对羟基苯甲醇可能刺激灰树花菌丝体生长和胞外多糖的合成，尤其是能使合成多糖途径中一些相关
酶活性的增强，例如葡萄糖基转移酶，从而使多糖合成增加，而浓度过高又可能会抑制菌丝体生长进而
使胞外多糖产量有所降低。当对羟基苯甲醇浓度达到200mg/L时，对灰树花菌丝生物量和胞外多糖合成
具有明显促进作用（P<0.05），分别达到最大值2.365±0.05和397.54±1.72 mg/L，与空白组（不加对羟基
苯甲醇）相比，分别增加了22.73%和10.24%。基于后期研究，我们进一步考察对羟基苯甲醇在灰树花发
酵体系中的代谢及发酵动力学研究，选取添加对羟基苯甲醇浓度为200mg/L作后期试验。
2.2 发酵产物的HPLC检测

图2. 对羟基苯甲醇转化产物的HPLC分析
Fig.2 HPLC analysis of transformation product of p-hydroxybenzyl alcohol
在灰树花发酵液中添加对羟基苯甲醇至浓度达到200mg/L，取第0d和第8d的发酵液进行膜过滤
（45µm），然后用于HPLC进一步检测，结果如图2所示。发现第8d灰树花发酵液中对羟基苯甲醇
（p-hydroxybenzyl alcohol）含量减少，同时通过标品对照发现有天麻素（gastrodin）的吸收峰增加明显，
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这说明了对羟基苯甲醇添加到灰树花发酵体系中可能不仅促进了菌丝生长及胞外多糖的合成，也有可能
一部分自身被转化。接下来我们会继续跟踪考察对羟基苯甲醇在灰树花发酵体系中的代谢变化。
2.3 发酵动力学研究
在灰树花发酵液中添加对羟基苯甲醇至浓度达到200mg/L进行发酵培养，每隔2d取样，研究发酵过
程中菌丝量、残糖（还原糖）、胞外多糖、pH值、对羟基苯甲醇和天麻素含量的变化。进一步揭示了对
羟基苯甲醇促进灰树花菌丝体生长及胞外多糖的合成，也为获取灰树花菌丝体和胞外多糖的实际应用提
供了参考依据。胞外多糖的积累与灰树花菌丝体生长密切相关，菌丝体生长过程中消耗了大量的碳源，
8d后菌体生长进入稳定期，同时对羟基苯甲醇转化成天麻素也基本完成。这预示着实际生产过程中如果
要连续培养，第8d是最佳的补料时间。
2.3.1 菌体的生长动力学

图3 菌丝量和残糖（葡萄糖）的动力学曲线
Fig.3 Kinetic curves of biomass and reducing sugar (glucose)
由图3可知，在灰树花整个发酵周期中，葡萄糖作为碳源随着灰树花菌丝的生长不断减少，从刚开
始的50g/L减少到第14d的22.54±1.41g/L，减少了54.92%。葡萄糖没有消耗完，其中可能的原因是其他条
件限制了灰树花菌丝体进一步生长，例如氮源、生长因子等。而灰树花菌丝体刚开始生长缓慢后来生长
加快，到第8d之后生长趋于平稳，第14d菌丝体量达到2.46±0.21 g/L，而此时葡萄糖作为碳源消耗速度也
减缓了。这里也与大多数真菌生长过程相类似。
2.3.2 胞外多糖和 pH的动力学曲线

图4. 胞外多糖和pH的动力学曲线
Fig.4 Kinetic curves of extracellular polysaccharide and pH value
由图4可知，在灰树花整个发酵周期中，胞外多糖一开始合成较缓慢，当从第6d开始合成速度加快，
第10d开始趋于平稳。最终第14d检测得到灰树花胞外多糖达到402.23±13.76 mg/L。发现灰树花胞外多糖
的合成稍微滞后于菌丝体的生长。而刚开始第0d能够检测到少量多糖，可能是因为培养基中酵母膏里的
成分。此外发酵过程中pH值也是略微下降的，从4.64±0.02下降到3.56±0.05，可能的原因是随着灰树花
的生长，能够利用碳源产生了少量的有机酸，当菌体生长进入稳定期时也就是第8d,发酵液的pH变化也
趋于平缓。
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2.3.3 对羟基苯甲醇和天麻素的动力学曲线

图5. 对羟基苯甲醇和天麻素的动力学曲线
Fig.5 Kinetic curves of p-hydroxybenzyl alcohol and gastrodin
由图5可知，在灰树花发酵培养基中添加对羟基苯甲醇，第4d之前对羟基苯甲醇和天麻素含量变化
不明显。第4d至第6d，对羟基苯甲醇含量迅速从185.12±4.21 mg/L下降到77.34±9.23 mg/L并最终转化完
全，天麻素含量从0.23±0.04 mg/L上升到30.27±2.17 mg/L，但随着灰树花继续发酵又会略微减少。这现
象可能是刚开始灰树花能够合成一些酶如葡萄糖基转移酶将对羟基苯甲醇转化成天麻素，随着菌丝体生
长，后期可能会吸收对羟基苯甲醇用以促进胞外多糖的合成并且有可能产生一些能使天麻素降解的酶，
这里有待进一步研究。

3 结 论

目前提高灰树花菌丝体生长和多糖产量的研究主要集中在灰树花发酵培养基的优化及向培养基中
添加适量的中药。这些传统的研究方法对提高灰树花菌丝量和胞外多糖是可行的，但本研究从另外的角
度研究了对羟基苯甲醇对灰树花胞外多糖合成的影响。在灰树花发酵体系中，添加不同浓度的对羟基苯
甲醇能一定程度上促进灰树花菌体的生长和胞外多糖的合成，其中对羟基苯甲醇添加量为 200mg/L时对
灰树花菌体生物量和胞外多糖合成的促进作用效果最明显，与空白组（未添加对羟基苯甲醇）分别提高
了 22.73% 和 10.24%。EPS合成酶是菌体分泌的一种诱导 EPS产生的一类酶的总称。王琼[24]和张清丽[25]
的研究认为 α-磷酸葡萄糖变位酶（α-PGM）、磷酸葡萄糖异构酶（PGI）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、TDP-
葡萄糖焦磷酸化酶等是胞外多糖合成的关键酶。徐晓宝[20]的研究表明通过添加中药天麻醇提物可以提高
α-PGM 酶活力，而天麻醇提物主要成分就包括对羟基苯甲醇和天麻素。本研究中对羟基苯甲醇对灰树
花胞外多糖生物合成的促进作用可能与天麻醇提取物一致，这一点需要作进一步研究。此外本研究重点
进行了添加对羟基苯甲醇后灰树花发酵动力学研究，考察了发酵过程中菌丝量、残糖（还原糖）、胞外
多糖、pH 值、对羟基苯甲醇和天麻素含量的变化。揭示我们可以通过添加对羟基苯甲醇以及对培养条
件进一步优化，缩短发酵时间获得灰树花胞外多糖，更好的应用到中试和实际生产中。另外对于对羟基
苯甲醇转化合成天麻素要进一步做研究，天麻素本生也是一种重要的中药活性物质。



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