全 文 ：生 物 技 术 2011 年 21(6)
图 9 接种量对产酶的影响
Fig. 9 Effect of amount of inoculum on penicillinase production
图 10 装液量对产酶的影响
Fig. 10 Effect of liquid volume on penicillinase production
2. 8 温度对发酵产酶的影响
图 11 温度对产酶的影响
Fig. 11 Effect of temperature on penicillinase production
角瓶装液量是 70mL时，即装液量为 14%，产酶活力最高可达
2 227U /mL。装液量太少，则水分在长期的发酵过程中会蒸发
较多，造成底物浓度过大，从而影响产酶;而装液量过多则造
成溶氧不足，产酶也不高。
图 11 结果显示，随着温度的升高，酶促反应也相应加快;
达到一定温度后温度升高，酶失活越快，菌体易于衰老，影响
产物生成。由图可知，28℃ ～ 32℃范围内不利于产酶，37℃发
酵液中酶活力达到最大，为 2 227. 8U /mL。
3 讨论
国内报道的产生青霉素酶的蜡样芽孢杆菌 CMCC(B)
63301［7］，存在产酶量低、培养基价格较高等问题。Susan J
Thornwell等人［8］将青霉素酶基因进行了异源表达，每毫升发
酵液可获得 900 ～ 1 500U /mL。国内还未见有青霉素酶异源表
达报道。此次，发酵优化后酶活力达 2 227. 8U /mL，为先前本
实验室摇瓶发酵结果(1 580U /mL)的 1. 41 倍。本研究中产青
霉素酶活力高于国内外现有水平，而且生产成本较低，为今后
建立工程菌稳定的发酵工艺和规模化生产奠定了基础。
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灰树花蛋白聚糖的提取、分离及氨基酸组成分析
虞凤慧，徐泽平* ，杨传伦，张心青，王秀芝，黄宝生，周传兵
(山东京博控股股份有限公司，山东 滨州 256500)
摘要:目的:研究灰树花(Grifola frondosa)蛋白聚糖的提取与分离方法及氨基酸组成。方法:采用碱提法提取蛋白聚糖，Q
Sepharose FF离子交换层析进行纯化，SDS － PAGE电泳分离蛋白聚糖及结合蛋白，高效液相色谱法鉴定蛋白聚糖的纯度及分子
量，并测定 18 种氨基酸的含量。结果:分离出蛋白聚糖 GFPⅠ、GFPⅡ和 GFPⅢ，糖含量分别为:43. 69%、40. 88%、28. 33%，蛋白
含量分别为:40. 42%、34. 65%、51. 19%。其中 GFPⅢ为均一成分，纯度 93. 61%，重均相对分子量(Mr)150kDa，GFPⅢ结合蛋白
分子量约为 33. 0kDa，为单一谱带。氨基酸组成分析结果显示:GFPⅢ的氨基酸总和达到 66. 60g /100g，其中 8 种必需氨基酸总量
为 26. 14g /100g，4 种呈味氨基酸总量为 25. 43g /100g，Asp、Glu、Leu、Ala和 Lys含量较高。结论:分离出的蛋白聚糖为结构均一成
分，纯度较高，可用于质量研究和生物学研究。
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2011 年 21(6) 生 物 技 术
关键词:灰树花;发酵菌丝体;蛋白聚糖;提取;分离纯化;氨基酸组成分析
中图分类号:Q936. 34;TQ929. 2 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 06． 159
Extraction，Purification and Amino Acid Composition Analysis
of Proteoglycans from Mycelium of Grifola frondosa
YU Feng － hui，XU Ze － ping* ，YANG Chuan － lun，ZHANG Xin － qing，
WANG Xiu － zhi，HUANG Bao － sheng，ZHOU Chuan － bing
(Shandong Chambroad Holding Co. ，Ltd. ，Binzhou 256500，China)
Abstract:Objective:To research the methods of extraction and separation of proteoglycans from mycelium of Grifola frondosa and the ami-
no acid composition. Method:The proteoglycans were extracted with aqueous alkali and isolated using ultrafiltration and Q Sepharose FF
column，and determined by SDS － polyacrylamide gel electrophoresis and HPLC. The contents of eighteen kinds of amino acids were ana-
lyzed. Result:Three fractions of proteoglycans were isolated and identified as GFPⅠ，GFPⅡand GFPⅢ respectively. Total sugar contents
in each fraction was 43. 69%，40. 88% and 28. 33% respectively，and protein contents were 40. 42%，34. 65% and 51. 19% respective-
ly. The GFPⅢ was single ingredient with the purity of 93. 61% and weight － average relative molecular weight of 150kDa by HPLC analy-
sis. The molecular weights of protein GFPⅢ was about 33. 0kDa. and the electrophoretic band was single. Amino acid composition analysis
of GFPⅢ showed that the total amino acids of the proteoglycans reached 66. 60g /100g，including 26. 14g /100g of eight kinds of essential
amino acids and 25. 43 g /100g of four kinds of flavor amino acids. In which，the higher contents of Asp，Glu，Leu，Ala，and Lys were detec-
ted. Conclusion:The results indicated that the proteoglycan is a single ingredient with a higher purity and can be used in farther quality re-
search and biology study.
Key words:Grifola frondosa;fermented mycelium;proteoglycans;extraction;isolation and purification;amino acid composition analysis
收稿日期:2011 － 06 － 22;修回日期:2011 － 10 － 13
资助项目:国家重点新产品计划项目(2007GRC60031)资助
作者简介:虞凤慧 (1982 －) ，女，硕士，工程师，研究方向:生物制药，
Email:else1982@ 163. com;* 通讯作者:徐泽平(1963 －) ，硕士，副研
究员，研究方向:真菌资源利用，Tel:+ 86 － 543 － 2512095，Fax:+ 86 －
543 － 2511296，Email:action919@ 163. com。
灰树花(Grifola frondosa)是一种药食两用珍稀菇类，又名
贝叶多孔菌、栗子蘑等［1］，属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌
目、多孔菌科、树花菌属［2］。β －葡聚糖和蛋白聚糖是灰树花
最主要的生物活性糖复合物。大量的药理药效研究表明，灰
树花多糖具有降血糖、调节免疫力、抗癌等多种生理活性［3］，
同时还具有抗 HIV /AIDS 病毒［4］的作用。目前对灰树花的研
究主要集中在灰树花子实体多糖的提取工艺方面［5］，对其蛋
白聚糖的相关研究报道较少。本研究利用液体深层发酵获得
灰树花菌丝粉，采用碱提法提取灰树花蛋白聚糖，并结合膜分
离、离子交换层析、SDS － PAGE电泳和冷冻干燥技术对蛋白聚
糖进行分离纯化，同时进行了氨基酸组成分析。希望为灰树
花蛋白聚糖的质量研究及应用研究提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
灰树花(Grifola frondosa)GF － 932 菌株由作者实验室分离
驯化，保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号 CGMCC
No. 1709。
1. 1. 2 试剂
Q Sepharose FF(Amersham)、蛋白 Marker(2 － 212 kDa，
NEB)、PNGase F(NEB) ，其它试剂均为国产分析纯。
1. 1. 3 仪器
中空纤维微滤膜组件(MOF，天津膜天膜科技有限公司) ;
中空纤维超滤膜组件(VEOS，天津膜天膜科技有限公司) ;PP
－ 6 蠕动泵(常州市科健蠕动泵厂) ;FD － ID － 55 冷冻干燥机
(北京博医康实验仪器有限公司) ;离子交换柱(20mm ×
300mm) ;HD － 3 紫外检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公
司) ;BT － 200 恒流泵(上海沪西分析仪器厂) ;DYY － 10 型电
泳仪(北京市六一仪器厂) ;TS － 8 型脱色摇床(海门市其林贝
尔仪器制造有限公司)。
1. 1. 4 培养基
斜面培养基:PDA培养基。
种子培养基:葡萄糖 10g，玉米粉 2. 5g，蛋白胨 1. 5g，酵母
粉 0. 75g，KH2PO4 0. 25g，MgSO4 0. 5g，水1 000mL，pH自然。
生产用培养基:马铃薯 14g，麸皮 28g，葡萄糖 28g，玉米粉
12g，蛋白胨 4. 2g，酵母膏 2. 1g，KH2PO4 0. 7g，MgSO4 1. 4g，水
1 000mL，pH自然。
1. 2 方法
1. 2. 1 灰树花菌丝粉的制备
将斜面培养的菌种接种于无菌种子培养基中，28℃摇床
(100r /min)培养 3d，获得种子液。将种子液以 4%的接种量经
一级种子罐(50L)、二级种子罐(500L)和发酵罐(5 000L)逐
级培养，培养温度为 28℃，搅拌速度为 200 r /min，通气量为
0. 5vvm，培养时间各为 24h、24h、48h，发酵液离心后，洗涤菌丝
体沉淀，干燥、备用。
1. 2. 2 蛋白聚糖的提取
取 100g灰树花菌丝粉，分别经 80%乙醇，于 80℃水浴脱
脂;水，沸水浴提取;1. 0mol /L NaOH，4℃提取，离心后收集滤
饼，回收乙醇。滤饼再经 1. 0mol /L NaOH，50℃ 水浴提取
1. 5h，重复一次，离心后合并两次热碱提取的上清液，得到蛋
白聚糖粗提液。粗提液经乙酸中和、离心、微滤、超滤浓缩、醇
沉，干燥后即为灰树花蛋白聚糖粗品。
1. 2. 3 蛋白聚糖的分离纯化
18
生 物 技 术 2011 年 21(6)
将灰树花蛋白聚糖粗品配成 1%的水溶液，经 0. 45μm 微
孔滤膜过滤，采用 Q Sepharose FF 离子交换层析纯化，洗脱液
依次为含 0、0. 1、0. 4、1. 0mol /L NaCl 的 Tris － HCl 溶液，收集
各蛋白聚糖组分。将各组分分别超滤脱盐，至浓缩液电导率
在 100μS /cm以下，真空冷冻干燥，获得蛋白聚糖 GFPⅠ、GFP
Ⅱ、GFPⅢ。
1. 2. 4 蛋白聚糖含量的测定
1. 2. 4. 1 糖含量的测定:采用苯酚 －硫酸法［6，7］进行测定。
1. 2. 4. 2 蛋白质含量的测定:采用 Lowry法［8 － 10］进行测定。
1. 2. 5 蛋白聚糖的 SDS － PAGE分离
将蛋白聚糖及经过 PNGase F 酶切的样品，进行 SDS －
PAGE电泳分离、检测。电泳采用 pH 8. 3 的 Tris －甘氨酸缓冲
体系，6%浓缩胶，16%分离胶，上样量 40 ～ 80μg，考马斯亮蓝
R －250 染色。以标准分子量蛋白为标准，将各蛋白迁移率对
分子量的对数作图，获得一条标准曲线，根据目的蛋白的迁移
率从标准曲线上求得分子量。
1. 2. 6 蛋白聚糖的纯度及相对分子量的测定
采用高效液相色谱法鉴定蛋白聚糖粗品和 GFPⅢ的纯
度，样品液浓度为 2mg /ml，分析条件为:OHpak SB － 804 HQ凝
胶色谱柱，进样量 20μL，流动相为 0. 02% NaN3 水溶液，流速
0. 5mL /min，柱温 35℃，示差折光检测器。根据保留时间得到
测定曲线，并采用 GPC软件分析样品的重均相对分子量。
1. 2. 7 氨基酸组成分析
依据 GB /T18246 － 2000，采用氨基酸分析仪对灰树花菌
丝粉及蛋白聚糖 GFPⅢ的 18 种氨基酸进行分析，由农业部食
品质量监督检验测试中心(济南)完成。
2 结果与分析
2. 1 灰树花蛋白聚糖的提取与分离纯化
采用碱提法提取的蛋白聚糖，经脱色、超滤浓缩、除游离
蛋白、醇沉后粗干品为浅棕黄色絮状，得率为 1. 13%(见表
1) ，极易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。取 1. 13g 粗
样经 Q Sepharose FF离子交换层析纯化后，得到 GFPⅠ、GFPⅡ
和 GFPⅢ三个组分，得率分别为 7. 48%、24. 55%、17. 52%。
表 1 灰树花蛋白聚糖的得率
Tab. 1 Yield of proteoglycans from mycelium of Grifola frondosa
Test items Crude proteoglycan GFPⅠ GFPⅡ GFPⅢ
Yield to mycelium(%) 1. 13 0. 0845 0. 2774 0. 1980
Yield to crude proteoglycan(%) — 7. 48 24. 55 17. 52
2. 2 蛋白聚糖含量测定
灰树花蛋白聚糖的糖含量测定采用苯酚 －硫酸法。该方
法不仅适合于单糖、寡糖和多糖定性和定量分析，而且可用于
各种糖复合物如糖蛋白、糖肽和糖脂中总糖的定性分析中，尚
未见该法用于中性糖蛋白中总糖定量分析［11］。蛋白质含量测
定采用 Lowry法，此法经 Folin －酚试剂法改良而来，是蛋白质
含量测定常用的方法之一。本研究测定的糖和蛋白含量结果
见表 2，粗蛋白聚糖、GFPⅠ、GFPⅡ、GFPⅢ糖含量分别为:
19. 61%、43. 69%、40. 88%、28. 33%，蛋 白 含 量 分 别 为:
67. 34%、40. 42%、34. 65%、51. 19%。由于 GFPⅠ得率较低，
故只进行了此项测定。
表 2 灰树花蛋白聚糖的含量
Tab. 2 Total sugar and protein contents of proteoglycans from mycelium of
Grifola frondosa
Test items Crude proteoglycan GFPⅠ GFPⅡ GFPⅢ
Total sugar contents(%) 19. 61 43. 69 40. 88 28. 33
Protein contents(%) 67. 34 40. 42 34. 65 51. 19
Residue yield(%) 37. 26
2. 3 SDS － PAGE电泳结果
蛋白聚糖是 β －葡聚糖与蛋白质结合而成的缀合物，分子
量较大，利用 PNGase F 可将结合蛋白切分下来，在 SDS －
PAGE电泳后形成明显的蛋白条带。由图 1 可见，蛋白聚糖
GFPⅢ在凝胶上缘呈现单一谱带，且其结合蛋白同样在凝胶中
呈现单一谱带，只是酶切不完全，仍留有较少的蛋白聚糖。而
蛋白聚糖 GFPⅡ在凝胶中只模糊的呈现了蛋白谱带。由此说
明 GFPⅢ纯化效果较好，达到了电泳级纯度。由标准曲线可
求得 GFPⅢ的分子量约为 33. 0kDa。
图 1 灰树花蛋白聚糖 GFPⅡ和 GFPⅢ SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig. 1 SDS － PAGE of GFPⅡ and GFPⅢ from mycelium of Grifola fron-
dosa
1:marker;2:GFPⅢ;3:GFPⅢ;4:GFPⅢ digested by PNGase F;5:GFP
Ⅱ;6:GFPⅡ;7:GFPⅡ digested by PNGase F;8:GFPⅡ.
2. 4 GFPⅢ的纯度及相对分子量的测定
经 HPLC分析，蛋白聚糖粗品在谱图中呈现一个主要的蛋
白聚糖不对称峰(图 2) ，出峰时间为 12. 8 ～ 19min 之间，最高
峰在 15. 65min，纯度较高。而 GFPⅢ却呈现出一单一对称主
峰(图 3) ，出峰时间为 12. 5 ～ 17. 5min 之间，最高峰在
15. 29min，纯度为 93. 61%，与蛋白聚糖粗品检测结果极为相
似，表明 GFPⅢ已经被纯化，经 GPC软件分析得出重均相对分
子量(Mr)为 150kDa，为分子量较大，成分均一的蛋白聚糖。
2. 5 氨基酸组成分析
由表 3 可见，灰树花脱脂菌丝粉和 GFPⅢ的中 18 种氨基
酸含量高低顺序基本一致，其中 Asp、Glu、Leu、Ala 和 Lys 含量
较高，而 Cys、Try 含量较低;氨基酸总和分别为 33. 51 和
66. 60g /100g。GFPⅢ中必需氨基酸(Lys、Try、Met、Thr、Phe、
Ile、Leu、Val)总量为 26. 14g /100g，呈味氨基酸总量(Glu、Asp、
Ala、Gly)为 25. 43g /100g。
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2011 年 21(6) 生 物 技 术
图 2 灰树花蛋白聚糖粗品高效液相色谱分析图谱
Fig. 2 HPLC spectrum of crude proteoglycan from mycelium of Grifola frondosa
图 3 灰树花蛋白聚糖 GFPⅢ高效液相色谱分析图谱
Fig. 3 HPLC spectrum of GFPⅢ from mycelium of Grifola frondosa
表 3 灰树花蛋白聚糖 GFPⅢ及菌丝体的氨基酸组成与含量
Tab. 3 Amino acid composition of GFPⅢ and mycelium from Grifola fron-
dosa
Amino
acids
Contents in
GFPⅢ
(g /100g)
Contents in
mycelium powder
(g /100g)
Amino
acids
Contents in
GFPⅢ
(g /100g)
Contents in
mycelium
powder(g /100g)
Asp 8. 31 3. 48 Leu 5. 66 2. 98
Thr 3. 53 1. 92 Tyr 2. 56 0. 93
Ser 2. 92 1. 95 Phe 3. 49 1. 81
Glu 9. 47 3. 85 His 1. 78 0. 98
Gly 3. 03 1. 83 Lys 4. 55 2. 34
Ala 4. 62 2. 34 Arg 4. 24 2. 11
Cys 0. 43 0. 29 Pro 3. 10 1. 76
Val 4. 06 2. 02 Try 0. 10 0. 57
Met 1. 37 0. 67
Ammonia
(Excluding)
0. 46 0. 60
Ile 3. 38 1. 68 Total amino acids 66. 60 33. 51
3 讨论
灰树花是一种药食两用的大型真菌，具有很高的营养价
值以及重大疾病预防和治疗的作用。目前灰树花的研究大多
是集中在多糖的提取和功能上［12］，而对灰树花蛋白聚糖的研
究鲜有报道。周昌艳［13］、徐泽平［14］等虽然提出了灰树花蛋白
聚糖的制备方法，但对其组成成分和结构研究的深入程度仍
不及其他真菌多糖。在徐泽平［14］所述的制备方法中，以无机
盐诱导菌丝体自溶后，经过酶解、离心，获得粗提液，再超滤脱
盐和浓缩，干燥获得蛋白聚糖，虽然有较高的含量，但没有进
一步分离纯化。因此，本研究在灰树花蛋白聚糖现有制备工
艺的基础上，进行了进一步的分离纯化及氨基酸组成分析，为
其生物活性研究及产业化开发打下坚实的基础。
本研究以灰树花菌丝粉为原料，通过脱脂、热水提取去除
杂多糖、冷碱提取去除非目的碱溶性多糖后，再经 50℃热碱提
取获得了灰树花蛋白聚糖粗体液。粗体液依次经 0. 2μm的微
滤膜去除大分子和胶体类物质，截留分子量 10KD的超滤膜进
行脱盐，离子交换层析法进行分离纯化，最终获得 GFPⅠ、GFP
Ⅱ和 GFPⅢ三个组分。为进一步检测蛋白聚糖的分离纯化效
果，本研究首先进行了 SDS － PAGE电泳分析，由结果可知，蛋
白聚糖 GFPⅢ被有效地分离纯化出来，其结合蛋白呈现单一
谱带，蛋白分子量约为 33. 0kDa。其次对 GFPⅢ进行了 HPLC
分析，得到一单一对称主峰，纯度为 93. 61%，重均相对分子量
(Mr)为 150kDa，表明已经获得 GFPⅢ纯品。说明微滤、超滤
技术和离子交换层析法适合本样品的分离纯化，得到了蛋白
含量较高、分子量较大、纯度较高的蛋白聚糖，为以后的工业
化生产提供理论依据。
同时对 GFPⅢ进行了氨基酸组成分析，据农业部食品质
量监督检验测试中心(济南)检验，GFPⅢ所含 18 种氨基酸总
量为 66. 60g /100g，其中 8 种必需氨基酸和 4 种呈味氨基酸含
量较高，分别为 26. 14g /100g 和 25. 43 g /100g，具有重要的研
究和应用价值。
4 结论
采用碱提法，从灰树花菌丝体中获得的蛋白聚糖具有极
好的水溶性，进一步分离得到的三个组分，主要成分仍为葡聚
糖。经 HPLC分析，其成分均一，且纯度较高。说明本研究所
采用的方法能够对灰树花蛋白聚糖进行纯化，获得高含量的
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生 物 技 术 2011 年 21(6)
蛋白聚糖纯品。而且灰树花菌丝体和 GFPⅢ均含有 18 种氨
基酸，必需氨基酸和呈味氨基酸含量较高，具有重要的食品保
健品开发价值。
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坏血酸(VC)、L －硫辛酸、表没食子酸儿茶素的还原能力，羟自由基、超氧阴离子自由基和 DPPH 自由基清除能力及抗脂质过氧
化能力，比较微生物源性抗氧化剂与其他抗氧化剂抗氧化能力。结果:微生物源性抗氧化剂有较强的抗氧化能力，体外清除羟自
由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基能力的半数有效量(EC50)分别为 184. 5μg 、48. 7μg、66. 1μg。与常见抗氧化剂相比，微生
物源性抗氧化剂对氧自由基及氮自由基都有较好的清除自由基作用。结论:微生物源性抗氧化剂体外抗氧化作用明显，有进一
步开发的价值。
关键词:微生物源性;抗氧化剂;自由基;体外
中图分类号:Q505 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2011． 06． 160
A Preliminary Research of Antioxidant Capacity
by Micro － derived Antioxidants in vitro
CAI Xuan1#，CHEN Xiao － lian1#，YANG Fan2，XU Jian － xiong1* GU Juan1，ZHANG Chao1
(1. School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China;
2. College of Life ＆ Environment Science，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China)
Abstract:Objective:To preliminary study and compare the antioxidant capacity of micro － derived antioxidants and common food and feed
antioxidants in vitro. Method:test the scavenging capacity，reducing power and anti － lipid peroxidative of the hydroxyl radical，superoxide
anion and DPPH from micro － derived antioxidants and common food and feed antioxidants by classic methods in vitro. Result:Microbial －
derived antioxidants have strong free radical scavenging and anti － lipid peroxidative，the EC50 of hydroxyl radical;superoxide anion and
DPPH scavenging capacity are 184. 5μg，48. 7μg and 66. 1μg respectively. Conclusion:Antioxidants derived from microbes take on obvi-
ous antioxidant ability in vitro，which have the value of further development.
Key words:micro － derived;antioxidants;free radical;in vitro
收稿日期:2011 － 09 － 05;修回日期:2011 － 12 － 01
基金项目:国家自然科学基金项目(30972103) ;上海交通大学农业与
生物学院青年人才发展培育基金项目(NRC201102)资助
作者简介:蔡旋(1985 －) ，男，武汉人，博士生，研究方向:食品及饲料
中功能性成份研究;#并列第一作者:陈小连(1978 －) ，女，博士，讲师，
研究方向:动物营养与饲料。* 通讯作者:徐建雄(1962 －) ，男，上海
人，教授，研究方向:动物营养与饲料，Email:jxxu1962@ sjtu. edu. cn。
0 引言 生物体在特定的应激状态下会产生过量自由基，使生物
体产生病理反应。抗氧化剂能有效清除自由基，改善生物体
的生理状况，因而广受关注。目前常见的抗氧化剂有人工合
成和天然产物提取两大类，微生物源性抗氧化剂(micro － de-
rived antioxidants，MA)属于发酵物提取抗氧化剂，较传统的植
物提取而言，有着来源丰富、品质易控制、提取分离方便等诸
多优势，但目前鲜见关于微生物源性抗氧化剂的研究。本研
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