全 文 ：菌 物 系 统 1 7 (3 ) : 2 46一 2 5 0 , 19 9 8
弄吞c o sy s et m a
金耳子实体和发酵菌丝体多糖的分离 、
纯化与结构的比较研究
刘春卉 谢 红 刘黄华 荣福雄
(山西省生物研究所 太原 0 3 0 0 0 6)
摘要 人工段木栽培的金耳 ( rT e o e la au ar o iat lb o B a l l ( lo in et aZ n g )子实体和深层培养的金
耳菌丝体分别经沸水提取 、 醇析 、 透析 , s ve ag e 法脱蛋白 、 eS p h a d e x G一 10 柱层析纯化 , 得子
实体纯多糖 T A f 和菌丝体纯多糖 T A n l 。 玻璃纤维纸电泳表明 T A ll l 和 T A f 为单一均匀多糖 。
薄层层析表明 , T A l l l 的单糖组成为半乳糖 、 葡萄糖 、 甘露糖 、 岩藻糖 、 鼠李糖 。 T A f 的单糖组成
为葡萄糖 、 甘露糖 、 木糖 、 鼠李糖 、 葡萄糖醛酸 。 U V 分析表明组成中不含核酸和蛋白质 。 T A f
经乙醇分级分离得 T A卜一 1和 T A I卜 2 。 T A卜一 2经 SeP h a d e x G we es . 10 柱层析表明其为单一均匀
物质 。 红外光谱分析证明 , T A -f 一 1 和 T A卜2 有多糖吸收峰 , 存在毗喃环 , a 一糖昔键和 p一糖
昔键连接 。
关键词 金耳 , 子实体 , 发酵菌丝体 , 多糖
中图分类号 . 09 36
金耳 rT e m e l a au ar n iat lb a B an do in et z a l l g 新鲜时呈金 黄色 , 脑状 。 具有滋阴润肺 ,
止 咳化痰 , 补气养心 , 平肝益胃之功 13][ 41 。 药理试验证明金耳菌丝体有增进小 白鼠非特异
性免疫功能作用 l[] , 和使谷肤甘肤过氧化物酶活性增强的作用 6[] 。 金耳还能降低动物肝脏
总脂及肝胆固醇 , 因而使肝脏湿重低于高脂组 6j[ ; 能明显对抗四氯化碳所致的急性和慢性
肝损伤 , 降低转氨酶 , 有保护肝脏作用 4[] , 还有抗辐射损伤等多种药理活性 2[] 。 另报道 , 金
耳多糖能 明显抑制无水乙 醇所致的大 鼠胃溃疡和 巴豆油所致的小 白鼠耳部炎症 , 有提高
小 白鼠免疫功能的作用 l4] 。
本文对人工段木栽培的金耳子实体和深层发酵培养的菌丝体的多糖 , 进行了分离和
分析 , 报道了其理化性质和组成结构 。
1 材料和方法
L l 菌种
金耳子实体为本室人工段木栽培产品 ;
金耳菌丝体为本室保存菌种的深层培养产品。
L Z 药品
国家 “九五 ”科技攻关资助项 目 (%一 C O Z刃 3一 6) 。
19 7一 5一 2收到原稿 , 19 97 一 1 一 3收到第一次修改稿 , 19 98 一 2一 10 收到第二次修改稿 。
DOI : 10. 13346 /j . mycosystema . 1998. 03. 012
3 期 刘春卉等 : 金耳子实体和发酵菌丝体多糖的分离 、 纯化与结构的比较研究 24 7
单糖标准品为进 口或国产生化试剂 , 其它试剂为国产分析纯试剂 。
1 .3 制取 、 分离和纯化
取新鲜金耳子实体用匀浆器打碎 , 加 20 倍体积的水 , 在 98 一 10 0 ℃ 水浴 中搅拌加热 4 小时 , 重复 3
次 , 离心 (35 0 0r / 训n) , 收集上清液 , 减压浓缩至适 当体积 , 加 4 倍体积 95 % 乙醇 , 离心收集沉淀 , 溶解于
水 , 对自水流水透析 1 天 , 蒸馏水透析 1 天 , 去除小分子杂质 , 20 %乓q 脱色 , Sve ag e 法除去蛋白质 , 醇析 ,
离心分离 , 收集沉淀 , 真空干燥 , 得子实体粗多糖 。
取干金耳菌丝体 , 加 80 倍体积水浸泡过夜 , 在 98 一 10 0℃沸水浴中加热 4小时 , 重复 3 次 , 其它步骤均
同制备子实体粗多糖法 , 得菌丝体粗多糖 。
取两粗多糖粉水溶解 , 上 eS p h a d e x G 10 层析柱纯化 , 用 .0 05 m of / L Na a 洗脱 , 苯酚一硫酸法检
测 , 收集多糖组分 , 流水透析 , 浓缩 , 无水乙醇沉淀 , 离心分离 , 沉淀用无水乙醇 、 丙酮依次分别洗涤 , 干燥 ,
得纯多糖 T A f (子实体多糖命名为 T A f ) 和 T A l l l (菌丝体多糖命名为 T A n l ) 。
取 T A f gZ , 溶于 150 inl 水中 , 加乙醇达浓度为 60 % , 离心收集沉淀 , 丙酮洗涤 , 得纯品 T A I二 l , 将离心
的上 清液继续加乙醇至醇浓度为 80% , 又出现白色沉淀 , 离心收集 , 水溶透析 , 浓缩 , 真空 干燥 , 得纯品
T A -f 2
0
1 .4 性质测定
1
.
4
.
1 鉴别 : 酸水解后 , 斐林试剂鉴别多糖 , 以苯酚一硫酸法测定糖含量 , 于 2 60 nm 处测紫外吸收检查有
无核酸沉杂 , 并于 280 nm 测紫外吸收和荀三酮反应测定蛋 白质存在与否
。
1
.
.4 2 纯度鉴定 : 玻璃纤维纸电泳 , 玻璃纤维纸 GF / 83 剪成 5 x 2 c0 m , .0 2 m ol / L 硼砂缓冲液 , p 9H
.
37
, 电
压 80 0V , 电泳 20 分钟 , 茵香醛显色 。
S e hP ade
x G 一 100柱 ( 1 . 6 x 3 6 e m) , 上样量 s m g / l . s inl 水 , 0 . o s m o l / L N 自C I洗脱 , 分部收集 , 1 . 5一
Zml / 管 , 苯酚一硫酸法检测 (葡萄糖为标准品 ) 。
1
.
.43 组分分析 71[ : 取精制品 T A f 、 T A胡各 s m g , 加人 Zm ol / L 三氟乙酸 4 m l , 封管 1 10℃水解 6 小时 , 离心
除去残渣 , 减压浓缩至干 , 用无离子水洗涤 3 次 , 除去三氟乙酸 , 每样 中加数滴甲醛 , 点样至 o .Z m ol / L 磷
酸二氢钠硅胶薄层板上 (按常规制板 20 x cs m) , 展开剂 : 正丁醇 :丙酮 :水 = :4 :3 1 , 室温下置展开缸上行
密闭展开 , 晾干 ,蕙酮一硫酸喷雾 , 110 ℃烘烤 40 分钟 , 呈不同颜色的层析斑 , 与标准品图谱比较3[] 。
1
.
.4 结构分析 : 红外分析和 ’ 3-C N M R 分析
, 取 T A -f 2样品 40 mg , 溶于 几0 中 , 50 M H z , 核磁共振仪连
续 4 小时 , 35 ℃测定 。
2 结果和讨论
多糖 T A -f 1 、 T A -f 2 、 T A n l 均能溶解于水 , 0 . l m ol / L N直O H 水溶液 , 二 甲基亚矾 , 不溶
于其它有机溶剂 。 纯品 T A f 经乙醇分级分离 , T A -f 1收率为 48 . 14% , T A -f 2收率为 45 . 0 % 。
T A f 和 T A m 酸水解物能使斐林试剂生成砖红色沉淀 , 与苟三酮无显色反应 。 260 nm
,
28 0 imt 处均无紫外吸收 , 证明其不含核酸和蛋 白质 。 玻璃纤维纸电泳为单一斑点 , 表 明两
种多糖均为纯品 。
AT 卜2在 se p hade x -G l o 上层析
, 为单一对称洗脱峰 , (见 图 l) , 峰形对称 , 表明其为
纯品 。
T A f 和 T A m 经酸水解 , 进行薄层色谱分析 , 用标准品对照 , fR 值一致 , 检测分子 中的
单糖组成 , 结果见图 2 .
1 7 卷
8426氏众昌O霉
.叫
图 l 纯多糖 T A f ~ 2的 S叩h ad ex G 10 洗脱峰
R g
.
1 P u r i if e a it o n P or if le o f op ly
s ac e h a ir d e T A I
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2
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l a ` le x (卜 10 0 e o lum n
由图 2 可见 T A m 的单糖组成有半 乳
糖 、 葡萄糖 、 甘露糖 、 岩藻糖 、 鼠李糖 。 T A -f 2
的单糖组成有 鼠李糖 、 木糖 、 甘露糖 、 葡萄糖
醛酸 。
红 外 图 谱 (见 图 3 、 图 4) 分 析 表 明 ,
T A -f 1 和 T A -f 2 有 多 糖 的 3 3 0 c0 m 一` ,
1 6 10 e m
一
, 、 1 4 2 0 e-m
,特征 吸收峰 。 有 毗喃环
7 8 0一 7 9 5 e m 一 ,特征 吸收峰 , 8 2 0一 8 4 5e抓 `处
弱 吸 收 , 8 5 0 e m 一 ` 、 9 3 0 一 9 5 0 cm ,无 吸 收峰 ,
8 9 5c证 ,处有吸收峰 , 表 明 a 一糖昔键和 p一糖
昔键同时存在 。 s l o c m 一` , 8 7 5e m `处弱吸收 ,
是甘露糖的吸收峰 ,表 明甘露糖的存在 。
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0 . 1 M a n O lu O l. A F . ` X y l 咬卜. T A m T A f刁 了A f 一 2 T A f
C a】: 半乳糖
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.
2
图 2 T A n l 、 T A I乍1 、 T A f ~ 2 、 1, A f 多糖水解物薄层层析图谱
M an
:甘露糖 曰 :u 葡萄糖 已uA :葡萄糖醛酸 F u c 二岩藻糖 为 :l 木糖 hR :a 鼠李糖 T A ll l
菌丝体多糖 T A 卜子实体多糖 T A I匕 1 、 TA 卜 :2 T A f 的两组分
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lG cu our in
e ac id : F t l c : F l lc o s e : X y l : X y l o s e : R ll a 二 侧1创11 n o s e
` ’ C一 N M R 图谱分析 (见图 5) , T A I匕 2的 C l信号区中 , 可以确定 106 . 2 4 0 9 / 耐 为 p型木糖
卿峰 , 104 . 71 协g / 耐 为 p型葡 萄麒一nU一U8确b认O月4材喇日.uó卜 0J叹2哥来姻酸 峰 , 103 . 10 协g / inl 为 甘 露 糖 峰 ,10 2 . 8 4协g / nlt 为 鼠李 糖 峰 , 8 6 . 26 “ g /m l 为木糖 的 1一 3糖昔键 , 86 . 0 6协g / inl是 鼠李糖和甘露糖的 1一 3糖昔键 , 但不能区别两种单糖 。 由于在 70 一 8 0林g /耐 之间多峰 , 其它类型的连接和 l一 2 、1一 4 、 1一 6糖昔键 , 难以断定 。综合薄层层析 、 红外光谱 、 核磁共振的检定 结果 , 本文所得 的金耳子 实体多糖精 制品 的主要单糖 组成有 : 木 O L 」 一 _ _ . -4 0 0 0 3 5 00 3 00 0 2 5 0 0 2 0 0 0 1 6 00 12 00 8 0 0波数 和ve n山〕be (r cm一 l )图 3R g . 3 T A I匕 l的红外光谱图I . R S pe e tr um o f T A -f l
3期 刘春卉等 :金耳子实体和发酵菌丝体多糖的分离 、 纯化与结构的比较研究
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图4
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T A -f 2的红外光谱图
1
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图 5 T A卜2的 ` , G核磁共振谱
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糖 、 甘露糖 、 鼠李糖 、 葡萄糖 、 葡萄糖醛酸 ,糖链中存在 p (l 一 3) 糖昔键 。 金耳发酵菌丝体多
糖纯品的主要单糖组成有 : 半乳糖 、 葡萄糖 、 甘露糖 、 岩藻糖 、 鼠李糖 。 比较二者单糖组分
和理化性质有 明显区别 , 子实体多糖分子量 巨大 , 水溶液呈胶体状态 , 菌丝体多糖分子量
较小 。 药理试验 比较也发现菌丝体多糖对于抑制 胃溃疡 、 抗炎等作用 比子实体多糖好 , 可
能是菌丝体多糖生物活性易于发挥 5[] , 该结论有待进一步 阐明 。
金耳在分类学上与银耳 同属 , 且 中医理论认为其也能扶正 固本 , 补益身心 3l[ 。 文献对
银耳子实体多糖的组成和活性有详细报道 9[] , 作 为子实体的重要有效成份 , 其单糖组成为
岩藻糖 、 木糖 、 甘露糖 、 葡萄糖和葡萄糖醛酸 , 由主链 a ( 1一 3) 仆甘露聚糖和侧链 p一仆葡萄
糖醛酸以及在 c- 2上相连的单个短键的 p ( 1一 2) 仆木糖残基组成 1[ 0] 。 该多糖有较好 的促
进细胞免疫和体液免疫的功能 。 与银耳 比较 , 金耳子实体多糖与之有类似处 ,其活性均表
现在机体免疫功能方面 , 提示多糖可能是金耳子实体的一种重要有效成份 , 有可能成为一
种理想的保健药物 , 这正是本文的研究 目的 。 至于 T A f 和 T A n l 的详细 化学结构和药理活
性有待进一步研究 。
致谢 该课题在 山西大学生物系刘波教授指导下完成 , 本所关芳玲 、 彭 晓光同志也参加了
部分工作 , 特此致谢 。
参 考 文 献
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