全 文 ：植物生态学报 2013, 37 (1): 70–79 doi: 10.3724/SP.J.1258.2013.00008
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
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收稿日期Received: 2012-09-10 接受日期Accepted: 2012-11-08
* Email: bioche@nwsuaf.edu.cn
** 通讯作者 Author for correspondence (E-mail: guoaiguang@yahoo.com.cn)
接种两种固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫及生长
能力
刘华伟1,2* 林晓军1,2 孙 超1,2 李 强1,2 杨 呼1,2 郭蔼光1,2**
1西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100; 2旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌 712100
摘 要 苗期是小麦(Triticum aestivum)物质和能量积累的关键时期, 苗期干旱影响小麦的后期群体建成。利用田菁茎瘤固氮
根瘤菌(Azorhizobium caulinodans) ‘ORS571’与巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense) ‘Yu62’浸种侵染小麦和聚乙二醇(PEG)
模拟渗透胁迫, 研究渗透胁迫下接菌小麦种子的发芽状况; 利用固氮菌涂抹小麦幼苗叶部, 测定PEG模拟渗透胁迫下小麦幼
苗根体积、叶片相对含水量、脯氨酸含量及可溶性蛋白含量, 探究固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫的能力。结果表明, 接种
混合固氮菌后在渗透胁迫下小麦种子的发芽率明显提高; 在渗透胁迫下叶部涂抹固氮菌小麦的根体积、叶片相对含水量、脯
氨酸含量及可溶性蛋白含量明显升高, 表明接种固氮菌可提高小麦幼苗的抗渗透胁迫能力, 且混合固氮菌对小麦幼苗叶片的
增强效果优于单一固氮菌。
关键词 抗旱性, 混合固氮菌, 小麦幼苗
Inoculation two azotobacter enhancing osmotic stress resistance and growth in wheat seedling
LIU Hua-Wei1,2*, LIN Xiao-Jun1,2, SUN Chao1,2, LI Qiang1,2, YANG Hu1,2 and GUO Ai-Guang1,2**
1College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi 712100, China; and 2State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,
Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract
Aims The seedling stage is the key stage of matter and energy accumulation in the wheat life cycle. Therefore,
drought during the seedling stage affects population formation in late stages. In this study, wheat seedlings were
inoculated with azotobacters Azorhizobium caulinodans ‘ORS571’ and Azospirillum brasilense ‘Yu62’.
Methods Wheat seedlings germination was screened in normal conditions and with PEG 6000 osmotic stress
using seedlings inoculated with azotobacters. Root volume, relative water content (RWC), proline content and
soluble protein content of seedling laminas were determined under PEG drought stress using seedlings inoculated
with azotobacters on laminas.
Important findings The germination rate of wheat seedlings was significantly increased under drought stress
when inoculated with azotobacters. Moreover, wheat seedlings inoculated with mixed azotobacters have more
obvious growth promotion than when inoculated with a single azotobacter. The former laminas proline content,
relative water content, proline content and soluble protein content had increased. The results showed that drought
resistance of wheat seedlings was improved when inoculated with mixed azotobacters, which provided the foun-
dation for further study of azotobacter-wheat interaction under drought stress.
Key words drought resistance, mixed azotobacters, wheat seedling

全球40%以上的土地属于旱地, 干旱地区的农
业研究对于弥补该地区不断恶化的环境问题、实现
传统农业模式的转变和提高旱区作物的生产能力
具有的重要意义(周利平等, 2010)。近年来, 我国北
方麦区旱象加重 , 旱灾时有发生 , 造成小麦
(Triticum aestivum)生育期内水分匮乏, 尤其在苗期
光合速率下降, 气孔导度减少, 叶绿素总量降低,
从而抑制了小麦正常的生长发育, 影响产量(石研
等, 1996)。
根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,
刘华伟等: 接种两种固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫及生长能力 71

doi: 10.3724/SP.J.1258.2013.00008
PGPR)可以促进植物生长和增强植物对干旱、病原
菌侵染等逆境的耐受能力(Glick & Bashan, 1997;
梁宇等, 2002; 沈世华和荆玉祥, 2003; 陆雅海和张
福锁, 2006; 康贻军等, 2010; de Oliveira & Varsh-
ney, 2011; Yu, 2011)。在干燥条件下, 一些抗旱根瘤
菌可与豆科植物形成有效的共生体系, 增强植物的
抗旱性(Fuhrmann et al., 1986)。叶爱华等(2003)比较
了两种丛枝真菌对小麦的抗旱效应 , 赵士杰等
(2004)研究发现菌根真菌可增强小麦抗旱性, 李相
文等(2010)利用假单胞菌分泌的菌冠素诱导小麦幼
苗提高抗旱性, 但利用固氮菌增强小麦幼苗抗旱性
的研究相对较少。
本研究探索田菁茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium
caulinodans) ‘ORS571’与巴西固氮螺菌 (Azospir-
illum brasilense) ‘Yu62’的抗旱生长规律, 研究田菁
茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌作为混合固氮菌
促进小麦幼苗的生长和增强幼苗抗旱性的生理生
化机制, 探索混合固氮菌作为小麦叶面菌肥的可行
性, 为小麦等作物的抗旱研究提供一条新思路。
1 材料和方法
1.1 材料
绿色荧光蛋白(GFP)标记田菁茎瘤固氮根瘤菌
由中国科学院植物研究所荆玉祥研究员馈赠。巴西
固氮螺菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。
小麦品种‘小偃22’、‘西农979’由西北农林科技
大学农学院赵继新博士提供; ‘绵阳19’由西北农林
科技大学生命科学学院刘香利博士提供; ‘周麦18’
为市售小麦种子。
1.2 实验方法
仪器: 人工气候室BIC-300 (上海博迅实业医疗
设备公司), 恒温振荡培养箱DHZ-DA(太仓市实验
设备公司), 电热恒温隔水式培养箱SGSP-02PLUS
(黄石市恒丰医疗仪器有限公司)。
TY液体培养基(5 g·L–1胰蛋白胨, 3 g·L–1酵母
粉, 0.88 g·L–1 CaCl2·2H2O, pH 7.4)用于田菁茎瘤固
氮根瘤菌和巴西固氮螺菌的活化与扩繁。
YMA固体培养基(10 g·L–1甘露醇, 3 g·L–1酵母
粉, 0.5 g·L–1 K2HPO4, 0.2 g·L–1 MgSO4·7H2O, 0.1
g·L–1 NaCl, 3 g·L–1 CaCO3, 18 g·L–1琼脂粉, pH 7.0),
用于平板计数法检测小麦幼苗不同组织内部定殖
的根瘤菌数目。
PBS缓冲液(0.24 g·L–1 KH2PO4, 0.2 g·L–1 KCl, 8
g·L–1 NaCl, 1.44 g·L–1 Na2HPO4, 1 000 mL蒸馏水,
pH 7.4), 作为菌体悬浮液。以上药品均为分析纯。
1.2.1 两种固氮菌的活化和渗透胁迫抗性实验
按0.25%接种量活化田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴
西固氮螺菌, 按2%接种量扩大培养于50 mL培养基
中, 28 , 200 r·m℃ in–1培养至对数生长期(OD600 =
0.6–0.8)。8 000 r·min–1离心10 min收集菌体, 用含
0.1%吐温-20的PBS缓冲液稀释, 混合固氮菌以1:1
的比例混合备用。
活化后的田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺
菌分别用含30% PEG 6000的TY液体培养基培养,
同等条件下设置无PEG 6000对照。培养条件: 28 , ℃
200 r·min–1。平行测量两种菌在3、6、9、24、30 h
于600 nm下的紫外分光光度值并绘制生长曲线。
1.2.2 测定小麦种子的发芽状况
将表面消毒的‘小偃22’种子置于直径为9 cm的
玻璃培养皿中, 以双层滤纸为发芽床, 处理组吸取
5 mL PBS稀释的固氮菌液到培养皿中, 使稀释菌液
半覆盖于种子表面, 并用浓度30%的PEG 6000进行
渗透胁迫。设置正负对照, 正对照不进行渗透胁迫
加PBS缓冲液, 负对照进行渗透胁迫加PBS缓冲液。
从渗透胁迫第1天开始每天观察, 记录发芽数, 统
计发芽率、发芽势和发芽指数, 当胚根长度达到种
子长度的一半时视为发芽, 以具明显胚芽鞘及胚根
作为发芽标准, 连续3天发芽数不再增长时终止发
芽试验(付博等, 2009)。试验在第4天计算发芽势, 连
续3天各处理均无新增发芽数时计算总发芽率。按
以下公式计算萌发指数。
发芽率(Gr) = (最终发芽的种子数/供试种子数)
× 100%;
发芽势(Gv) = n/N × 100% (n为前4天发芽的种
子数, N为供试种子数);
发芽指数(Gi) = ∑(Gt/Dt) (Gt为t日内发芽的种子
数, Dt为对应种子发芽的天数)
1.2.3 渗透胁迫条件下对固氮菌敏感小麦品种筛
选
室内条件下, 选用本实验室已筛选出的正常条
件下对固氮菌敏感的小麦品种: ‘绵阳19’、 ‘西农
979’、‘周麦18’和‘小偃22’ (刘华伟等, 2012)。选取
饱满、均匀一致的4种小麦种子, 用75%酒精浸泡30
s, 无菌水冲洗3次; 再用1% NaClO浸泡10 min, 无
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菌水冲洗3次, 进行表面消毒。将种子栽培于育苗盘
(规格为4 × 8格, 每格大小为3 cm × 3 cm)中, 每格4
粒小麦种子, 设置3个重复, 培养条件: 光照16 h,
光强12 000 lx, 温度25 , ℃ 相对湿度46%; 黑暗8 h,
光强0 lx, 温度18 , ℃ 相对湿度37%。出苗6天后,用
浓度30%的PEG 6000对处理组进行渗透胁迫同时
叶片涂抹PBS稀释的田菁茎瘤固氮根瘤菌, 对照组
用浓度30%的PEG 6000进行渗透胁迫同时涂抹PBS
缓冲液, 检测小麦幼苗渗透胁迫后各个时期的相对
含水量。
1.2.4 测定小麦幼苗的形态指标
对‘小偃22’种子进行表面消毒, 在育苗盘(规格
同上)中萌发, 设置3个重复, 培养条件同上。向生长
至第6天的处理组‘小偃22’幼苗叶背面均匀涂抹
PBS稀释的固氮菌液, 同时加浓度30%的PEG 6000
进行渗透胁迫, 对照组涂抹等量PBS缓冲液同时加
浓度30%的PEG 6000进行渗透胁迫, 在第15天检测
幼苗各种形态指标。
1.2.5 估算固氮菌在小麦组织中的定殖数目
对‘小偃22’种子进行表面消毒, 在育苗盘(规格
同上)中萌发, 设置3个重复, 培养条件同上。向生长
至第6天的处理组小麦幼苗叶背面均匀涂抹PBS稀
释的固氮菌液。在叶部接菌6天后利用平板计数法
估算定殖于小麦幼苗根和叶的固氮菌数目。
1.2.6 激光共聚焦检测GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌
在小麦组织中的定殖
对叶部接菌6天后的‘小偃22’幼苗的根和叶进
行徒手切片, 树脂封片, 利用激光共聚焦显微镜
(AIR, Nikon, Tokyo, Japan)检测GFP-田菁茎瘤固氮
根瘤菌在幼苗不同组织中的定殖与分布规律。对选
定位点用488 nm激光激发, 用500–530 nm激光检测
GFP荧光; 用568 nm激光激发, 在600–800 nm间调
整带宽检测小麦组织的自发荧光; 在控制面板用x、
y平面扫描以2 μm为步距沿z轴从根表面向根内逐层
进行, 依据需要和激光扫描深度的限制及可采集根
自发荧光的限制, 扫描距离在50–150 μm间。徒手切
片选择上表面30 μm以下位置扫描成像。
1.2.7 测定小麦幼苗的抗旱性指标
对‘小偃22’种子进行表面消毒, 在育苗盘(规格
同上)中萌发, 设置3个重复, 培养条件同上。向生长
至第6天的处理组‘小偃22’幼苗叶背面均匀涂抹
PBS稀释的固氮菌液, 同时加浓度30%的PEG 6000
进行渗透胁迫, 对照组涂抹等量PBS缓冲液同时加
浓度30%的PEG 6000进行渗透胁迫。3天后检测小
麦幼苗各抗旱性指标。用磺基水杨酸法和茚三酮比
色法测定叶片脯氨酸含量(张殿忠等, 1990; 郭蔼光
和郭泽坤, 2007); 用考马斯亮蓝G-250染色法测定
叶片可溶性蛋白含量(SP)。
1.3 数据统计分析方法
所用数据均用Excel 2007录入数据、制作图表
和计算, 以SPSS 13.0进行相关统计分析。
2 结果分析
2.1 渗透胁迫下两种固氮菌的生长规律
田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌均能在
渗透胁迫下生长繁殖, 其生长曲线如图1所示。在渗
透胁迫处理后, 田菁茎瘤固氮根瘤菌与对照相比繁
殖速率差异较小, 在6 h后均进入对数生长期(p >
0.05), 在9 h增长变缓进入平台期, 两者达到显著差
异(p < 0.05), 24 h后两者达到极显著差异(p < 0.01);
渗透胁迫处理后巴西固氮螺菌与对照相比生长减
缓, 延迟进入平台期, 两者在6 h后达到极显著差异
(p < 0.01)。两种固氮菌在渗透胁迫下最终的OD值都
达到1.4以上, 表明两种固氮菌在渗透胁迫下能生
长繁殖, 其本身具有一定的抗旱能力。
2.2 渗透胁迫下筛选对田菁茎瘤固氮根瘤菌敏感
的小麦品种
选用本实验室已筛选出的对田菁茎瘤固氮根
瘤菌敏感的4个小麦品种: ‘绵阳19’、‘西农979’、‘周
麦18’和‘小偃22’。在此基础上筛选出渗透胁迫下对
田菁茎瘤固氮根瘤菌敏感的品种。处理为渗透胁迫
同时接种田菁茎瘤固氮根瘤菌, 对照为渗透胁迫不
接种田菁茎瘤固氮根瘤菌。从表1的显著性分析中
得知, 渗透胁迫24 h后, 各处理与对照之间相对含
水量均没有显著性差异; 48 h后, 除了‘西农979’以
外, 其余3个品种的处理和对照之间相对含水量都
出现了显著性差异(p < 0.05); 72 h后, 各品种处理
与对照之间的差异达到极显著水平(p < 0.01), 说明
随着时间的推移, 田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦幼苗
的抗旱效果有逐渐加大的趋势。复水24 h后, 各品
种处理和对照之间仍然存在显著性差异(p < 0.05);
复水48 h后, 各品种之间和处理与对照之间几乎都
没有显著性差异(p > 0.05), 说明复水基本完成, 小
麦幼苗的含水量趋于正常水平。综合分析说明田菁
刘华伟等: 接种两种固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫及生长能力 73

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图1 渗透胁迫下田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌的生长曲线。
Fig. 1 Growth curve of Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense under osmotic stress.



表1 渗透胁迫下小麦叶片的相对含水量(平均值±标准偏差)
Table 1 Relative water content of wheat laminas under osmotic stress (mean ± SD)
渗透胁迫 Osmotic stress (%) 复水 Rehydration (%) 小麦品种
Wheat cultivar
菌根处理
Mycorrhizal treatment 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h
不接种 No infected 97.44 ± 0.947a 89.99 ± 2.326b 86.99 ± 0.803b 92.67 ± 1.042b 96.56 ± 1.581b ‘绵阳19’
‘Mianyang 19’ 接种 Infected 98.08 ± 1.782a 96.87 ± 1.160c 98.05 ± 0.949e 98.02 ± 0.179c 97.00 ± 0.399b
不接种 No infected 95.68 ± 0.322a 92.64 ± 2.056bc 77.74 ± 1.738a 94.46 ± 0.249b 95.08 ± 1.499ab‘西农979’
‘Xinong 979’ 接种 Infected 95.67 ± 0.847a 94.91 ± 2.992c 90.79 ± 0.292c 95.76 ± 0.020bc 97.62 ± 1.876b
不接种 No infected 97.28 ± 1.079a 82.48 ± 1.067a 74.67 ± 4.456a 93.48 ± 0.800b 96.27 ± 1.810b ‘周麦18’
‘Zhoumai18’ 接种 Infected 97.28 ± 0.606a 95.05 ± 1.959c 90.22 ± 0.695c 97.43 ± 2.094c 98.07 ± 1.480b
不接种 No infected 95.73 ± 0.371a 84.01 ± 0.773a 82.25 ± 1.723b 87.78 ± 1.824a 93.91 ± 0.292a ‘小偃22’
‘Xiaoyan 22’ 接种 Infected 95.79 ± 0.713a 97.86 ± 0.467c 93.66 ± 0.834d 97.05 ± 1.228c 92.06 ± 1.093a
同列不同小写字母表示处理间差异显著(p < 0.05)。
Different small letters in the same column indicate significant difference among treatments at p < 0.05.


茎瘤固氮根瘤菌能增强小麦幼苗的抗旱能力, 其抗
旱效果随着时间的推移变得更为明显。结合本实验
室前期研究结果(刘华伟等, 2009, 2012), 选择‘小偃
22’与田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌互作进
行渗透胁迫研究。
2.3 两种固氮菌对渗透胁迫下小麦种子萌发的影响
对‘小偃22’种子进行渗透胁迫, 观察两种固氮
菌对胁迫下种子发芽势的影响。渗透胁迫下‘小偃
22’种子的发芽势由正常情况下的0.813降至0.693,
差异达到极显著水平(p < 0,01), 接种了田菁茎瘤固
氮根瘤菌和巴西固氮螺菌的胁迫种子发芽势分别
为0.800和0.853, 两者差异达到显著水平(p < 0.05)
(图2)。
动态观察渗透胁迫下小麦种子的发芽率和发
芽指数的变化。与平行对照相比, 接种巴西固氮螺
菌的种子发芽率增长较快, 接种田菁茎瘤固氮根瘤
菌的种子发芽率走势与对照相似, 同时都在5天后
变化变缓。分析4组种子最终的发芽率, 渗透处理负
对照和其他3组发芽率均达到极显著差异(p < 0.01),
其他3组发芽率之间没有显著差异(p > 0.05) (图3)。
渗透胁迫处理的发芽指数与其他3组的发芽指数从
第3天开始出现显著性差异(p < 0.05), 而这3组发芽
指数之间没有出现显著性差异(p > 0.05) (图4)。综合
分析说明, 田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌都
能增强渗透胁迫下小麦幼苗的发芽率。
2.4 渗透胁迫下叶部涂抹固氮菌对小麦幼苗的促
生作用
向生长至第6天的‘小偃22’幼苗叶背面均匀涂
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图2 渗透胁迫下小麦种子接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西
固氮螺菌的发芽势(平均值±标准偏差)。A, PBS正对照; B, 渗
透胁迫处理负对照; C, 渗透胁迫下接种田菁茎瘤固氮根瘤
菌; D, 渗透胁迫下接种巴西固氮螺菌。
Fig. 2 Germinate potential of wheat seeds infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense under
osmotic stress (mean ± SD). A, PBS positive control; B, nega-
tive control under osmotic stress; C, treatment of infection by
Azorhizobium caulinodans under osmotic stress; D, treatment
of infection by Azospirillum brasilense under osmotic stress.




图3 渗透胁迫小麦种子接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固
氮螺菌的发芽率。A, PBS正对照; B, 渗透胁迫处理负对照;
C, 渗透胁迫下接种田菁茎瘤固氮根瘤菌; D, 渗透胁迫下接
种巴西固氮螺菌。
Fig. 3 Germination percentage of wheat seeds infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense under
osmotic stress. A, PBS positive control; B, negative control
under osmotic stress; C, treatment of infection by Azorhizobium
caulinodans under osmotic stress; D, treatment of infection by
Azospirillum brasilense under osmotic stress.

抹等量的固氮菌液(处理方式同上), 进行渗透胁迫,
在第15天检测幼苗形态指标。与对照相比, 接种单
一巴西固氮螺菌幼苗根长没有达到显著差异, 而接
种单一田菁茎瘤固氮根瘤菌幼苗根长表现出显著
差异(p < 0.05), 接种混合固氮菌幼苗根长达到极显
著差异(p < 0.01); 与对照相比, 接种单一巴西固氮
螺菌幼苗株高达到显著差异, 而接种田菁茎瘤固氮


图4 渗透胁迫下小麦种子接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西
固氮螺菌的发芽指数。A, PBS正对照; B, 渗透胁迫处理负对
照; C, 渗透胁迫下接种田菁茎瘤固氮根瘤菌; D, 渗透胁迫
下接种巴西固氮螺菌。
Fig. 4 Germination index of wheat seeds infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense under
osmotic stress. A, PBS positive control; B, negative control
under osmotic stress; C, treatment of infection by Azorhizobium
caulinodans under osmotic stress; D, treatment of infection by
Azospirillum brasilense under osmotic stress.


根瘤菌和混合固氮菌都表现出极显著性差异(p <
0.01) (图5); 与对照相比, 单一接种固氮菌根体积
没有显著性差异, 而接种混合固氮菌根体积达到极
显著差异(p < 0.01) (图6)。说明渗透胁迫下接种混合
固氮菌对小麦幼苗的促生作用强于接种单一固氮
菌。
在叶部接菌6天后利用平板计数法估算固氮菌
在小麦幼苗体内的分布规律, 其中在叶内田菁茎瘤
固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌定殖数目平均为1.27 ×
108和1.53 × 108; 在根内田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴
西固氮螺菌定殖数目平均为1.9 × 107和2.1 × 107 (表
2)。根内定殖数目少于叶内, 差异极显著(p < 0.01),
表明有一定量的固氮菌可从叶部进入小麦体内, 并
可向下迁移至根部, 此与激光共聚焦显微镜检测
GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌的分布趋势一致(图7)。
利用激光共聚焦显微镜对叶部涂抹GFP-田菁
茎瘤固氮根瘤菌的小麦幼苗叶、茎和根进行无损伤
逐层扫描, 结果显示吸附于叶背面的GFP-田菁茎瘤
固氮根瘤菌可从气孔进入小麦叶内(图7A、7B), 并
沿茎维管组织向下迁移到根部(图7C), 可定殖在根
维管组织中(图7D)。
2.5 叶部涂抹固氮菌对小麦幼苗抗旱性的影响
向生长至第6天的‘小偃22’幼苗叶背面均匀涂
抹等量的固氮菌液(处理方式同上), 进行渗透胁迫,
刘华伟等: 接种两种固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫及生长能力 75

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图5 渗透胁迫下接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌对小麦幼苗根长与株高的影响(平均值±标准偏差)。A, 接种田菁
茎瘤固氮根瘤菌; B,接种巴西固氮螺菌; C, 接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌; D, 对照。
Fig. 5 Effects of wheat seedling root length and plant height infected by Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense
under osmotic stress (mean ± SD). A, infected by Azorhizobium caulinodans; B, infected by Azospirillum brasilense; C, infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense; D, control.





图6 渗透胁迫下叶片接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮
螺菌小麦幼苗的根体积(平均值±标准偏差)。A, 接种田菁茎
瘤固氮根瘤菌; B,接种巴西固氮螺菌; C, 接种田菁茎瘤固氮
根瘤菌和巴西固氮螺菌; D, 对照。
Fig. 6 Root volume of wheat seedlings infected by Azorhizo-
bium caulinodans and Azospirillum brasilense under osmotic
stress (mean ± SD). A, infected by Azorhizobium caulinodans;
B, infected by Azospirillum brasilense; C, infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense; D,
control.



表2 接种6天后不同小麦幼苗器官中田菁茎瘤固氮根瘤菌
和巴西固氮螺菌定殖数目(3次重复)
Table 2 Colonization number of Azorhizobium caulinodans
and Azospirillum brasilense in different wheat seedling organs
after infected six days (three repeat)
茎瘤固氮根瘤菌
Azorhizobium
caulinodans
巴西固氮螺菌
Azospirillum
brasilense
叶 Leaf (×107) 14.2 11.9 12.1 16.4 15.2 14.2
根 Root (×107) 2.4 1.9 2.1 1.8 2.0 1.8


在第9天检测各生理生化指标。与对照相比, 接种单
一根瘤菌幼苗叶片的相对含水量没有显著差异(p >
0.05), 接种混合固氮菌幼苗叶片的相对含水量达到
了极显著差异(p < 0.01) (图8); 与对照相比, 接种巴
西固氮螺菌幼苗的脯氨酸含量没有显著差异(p >
0.05), 接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和混合固氮菌幼苗
的脯氨酸含量达到极显著差异(p < 0.01) (图9); 与
对照相比, 接种单一固氮菌和混合固氮菌幼苗的可
溶性蛋白含量都达到了极显著差异(p < 0.01) (图
10)。表明渗透胁迫下叶片涂抹混合固氮菌的幼苗叶
片相对含水量、脯氨酸含量和可溶性蛋白含量均比
对照组幼苗显著升高, 涂抹混合固氮菌优于单一
接菌。
3 讨论
3.1 田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌的抗旱性
一般认为, 不同抗性、不同生长型的固氮菌对
干旱胁迫的反应不同(Bushby & Marshall, 1977)。本
研究选用的田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌
在PEG渗透胁迫下能继续繁殖, 表明两种固氮菌及
其混合菌均对干旱胁迫有一定的耐受性。两种固氮
菌可在旱区植物小麦内部存活并繁殖, 对于提高小
麦等植物抗旱性具有潜在的应用价值。
3.2 干旱胁迫下混合固氮菌对小麦幼苗生长的促
生作用
固氮菌可在非豆科作物中内生定殖并有效繁
76 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2013, 37 (1):70–79

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图7 激光共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)-田菁茎瘤固氮根瘤菌在小麦体内的定殖。A, GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌吸附
在小麦的叶背面, 箭头所示为分布气孔处的GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌。B, GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌定殖在气孔处的局部放
大照片。C, GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌定殖在小麦茎的维管组织中。D, GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌定殖在小麦根的维管组织中。
Fig. 7 Colonization of green fluorescent protein (GFP)-Azorhizobium caulinodans in the wheat seeding via confocal laser scanning
microscopy. A, Colonization of GFP-A. caulinodans in the wheat blade back, arrow point to stomas. B, Amplifying colonization of
GFP-A. caulinodans in the middle of stoma. C, Colonization of GFP-A. caulinodans in the wheat stem vascular tissue. D, Coloniza-
tion of GFP-A. caulinodans in the wheat root vascular tissue.




图8 渗透胁迫下叶片接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮
螺菌小麦幼苗的相对含水量(平均值±标准偏差)。A, 接种田
菁茎瘤固氮根瘤菌; B,接种巴西固氮螺菌; C, 接种田菁茎瘤
固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌; D, 对照。
Fig. 8 Relative water content of wheat seedlings infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense under
osmotic stress (mean ± SD). A, infected by Azorhizobium
caulinodans; B, infected by Azospirillum brasilense; C, in-
fected by Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasi-
lense; D, control.


殖(Chi et al., 2005; Ji et al., 2010), 固氮菌在小麦体
内的群体密度与其对小麦幼苗不同部位不同程度
的促生密切相关, 伴随植株叶片与根系的发育, 固
氮菌定殖菌体数越多, 促生效果越明显。迟峰(2006)


图9 渗透胁迫下叶片接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮
螺菌小麦幼苗的脯氨酸含量(平均值±标准偏差)。A, 接种田
菁茎瘤固氮根瘤菌; B,接种巴西固氮螺菌; C, 接种田菁茎瘤
固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌; D, 对照。
Fig. 9 Proline content of wheat seedlings infected by
Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense under
osmotic stress (mean ± SD). A, infected by Azorhizobium
caulinodans; B, infected by Azospirillum brasilense; C, in-
fected by Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasi-
lense; D, control.


用田菁茎瘤固氮根瘤菌等根瘤菌侵染水稻、烟草种
子, 研究结果表明其均能提高植物光合作用效率,
促进植物生长。刘华伟等(2009, 2012)研究了田菁茎
瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌在小麦体内的定殖
刘华伟等: 接种两种固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫及生长能力 77

doi: 10.3724/SP.J.1258.2013.00008


图10 渗透胁迫下叶片接种田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固
氮螺菌小麦幼苗的可溶性蛋白含量(平均值±标准偏差)。A,
接种田菁茎瘤固氮根瘤菌; B,接种巴西固氮螺菌; C, 接种田
菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌; D, 对照。
Fig. 10 Soluble protein content of wheat seedlings infected
by Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasilense
under osmotic stress (mean ± SD). A, infected by Azorhizobium
caulinodans; B, infected by Azospirillum brasilense; C, in-
fected by Azorhizobium caulinodans and Azospirillum brasi-
lense; D, control.


规律, 并证明两种固氮菌均对小麦具有促生作用。
本研究用田菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌混
合固氮菌侵染小麦幼苗叶片, 经平板分离计数表明
在幼苗的叶片中有一定菌群数目的两种固氮菌分布,
同时在根部也分离到少量固氮菌, 表明固氮菌在小
麦幼苗体内可由上至下迁移。激光共聚焦检测结果
表明GFP-田菁茎瘤固氮根瘤菌首先吸附在小麦叶片
背部, 从叶片表面气孔等部位直接进入幼苗叶内,
并可沿茎维管组织向下迁移至小麦幼苗根部。
Athar和Johnson (1996)的研究表明在干旱条件
下苜蓿根瘤菌与紫苜蓿(Medicago sativa)能有效地
共生, 促进苜蓿的生长。这与渗透胁迫条件下固氮
菌对小麦幼苗促生试验结果一致, 叶片接种混合固
氮菌的渗透胁迫下幼苗生长优势明显, 其根长平均
增加了8.53%, 根体积增加了22.75%; 株高增加了
16.25%, 其中又以对干旱幼苗地上部分的促生最为
明显。
3.3 混合固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫性
种子的发芽率对其出苗率有着重要影响, 而干
旱会使种子的萌发受到抑制 (李友国和周俊初 ,
2002)。发芽势体现了种子的发芽速度与整齐度, 只
有发芽势高的种子, 其出苗才能齐而壮, 接种了田
菁茎瘤固氮根瘤菌和巴西固氮螺菌的干旱胁迫种
子发芽势近似或超出未胁迫水平, 较胁迫处理种子
均有提高, 表明渗透胁迫的种子在接种固氮菌后活
力增高, 在一定程度上增强了种子抵御渗透胁迫的
能力。发芽指数可反映出干旱胁迫对小麦种子的发
芽是否产生抑制作用, 发芽指数越大, 表示发芽速
度越快, 可作为评价种子抗旱能力的指标(王文恩
等, 2011)。本研究中, 小麦接种巴西固氮螺菌后种
子发芽指数持续最高, 在接菌后发芽速度明显快于
胁迫种子; 接种田菁茎瘤固氮根瘤菌后种子与未胁
迫对照的发芽指数接近, 接菌后发芽速度也接近对
照水平。表明混合固氮菌对渗透胁迫下小麦种子的
萌发具有缓冲、调节和促进适应的能力。
植物对干旱胁迫的响应机制是一个复杂的过
程, 干旱胁迫使植物分配到根的生物量、功能根的
数量和长度增加。适度干旱胁迫可以改善根系的形
态, 增加根分枝级数及深层根数量和长度, 提高根
系活力 , 使植物更加充分地利用土壤水分
(Kozlowski & Pallardy, 2002; Kase et al., 2004)。一些
根瘤菌通过与植物的联合固氮(Döbereiner et al.,
1972; 徐兴良等, 2003)或者分泌植物激素(潘佩平
和周鸿宾, 1995)来促进植物根的生长和增加根表面
积, 加强植物更好地利用土壤中的营养成分和水
分, 从而加强植物对干旱和其他胁迫的耐受力。根
瘤菌增强植物的抗旱能力也与脯氨酸积累有关, 在
干旱条件下脯氨酸含量升高, 有利于植物对干旱胁
迫的抵抗(陈少瑜等, 2004)。脯氨酸积累在初期可减
轻伤害, 在后期则是细胞凋亡的表现(刘慧芳等 ,
2004)。本研究中接种了田菁茎瘤固氮根瘤菌的小麦
幼苗相对含水量提高了8.87%, 渗透胁迫下小麦幼
苗接种混合固氮菌后脯氨酸含量显著升高, 表明混
合固氮菌进入幼苗体内后能减轻渗透胁迫对幼苗
的伤害。Timmusk和Wagner (1999)研究发现接种
PGPR菌株Paenibacillus polymyxa提高了拟南芥对
干旱的忍耐力 , 与对照相比 , 其干旱响应基因
ERD15转录的mRNA发生明显变化。
3.4 混合固氮菌作为叶面肥的可行性探索
苗期是小麦生长的关键时期, 苗期如遇到干旱
性天气, 受损根系从土壤中吸收到的水分难以补偿
蒸腾的消耗, 使植株体内水分收支平衡失调, 小麦
生长发育受到严重影响, 并最终导致减产和品质降
低(蔡衡和唐宏祥, 2011)。因此, 对叶表面直接施肥
比对受损的根部施肥更加直接, 效果会更加明显,
在叶片表面接种耐旱的内生固氮菌菌肥有望提高
非豆科作物的抗旱能力。
78 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2013, 37 (1):70–79

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基金项目 国家自然科学基金项目(30700489和
31071870)、陕西省科学技术研究发展计划项目
(2010K02-12-2)和西北农林科技大学基本科研业务
费专项资金项目(QN2009067)。
参考文献
Athar M, Johnson DA (1996). Influence of drought on compe-
tition between selected Rhizobium meliloti strains and
naturalized soil rhizobia in alfalfa. Plant and Soil, 184,
231–241.
Bushby HVA, Marshall KC (1977). Some factors affecting the
survival of root-nodule bacteria on desiccation. Soil Biol-
ogy & Biochemistry, 9, 143–147.
Cai H, Tang HX (2011). Agricultural drought assessment and
on wheat growth impact. Modern Agricultural Sciences
and Technology, (8), 292–293. (in Chinese) [蔡衡, 唐宏
祥 (2011). 农业干旱的评估及对小麦生长的影响. 现
代农业科技, (8), 292–293.]
Chen SY, Lang NJ, Li JY, Jia LQ, Wu LY, Mi FD (2004).
Changes of leaf relative water content, relative plasma
membrane permeability and proline content of seedlings
of three species under drought stress. Journal of West
China Forestry Science, 33(3), 30–33, 41. (in Chinese
with English abstract) [陈少瑜, 郎南军, 李吉跃, 贾利
强, 吴丽圆, 米方佃 (2004). 干旱胁迫下3树种苗木叶
片相对含水量、质膜相对透性和脯氨酸含量的变化. 西
部林业科学, 33(3), 30–33, 41.]
Chi F (2006). Migration of Rhizobia in Plants and Proteome
Analysis of Their Interaction. PhD dissertation, Institute of
Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing. (in Chi-
nese with English abstract) [迟峰 (2006). 根瘤菌在植物
内的迁移运动及其与植物相互作用的蛋白质组学研究.
博士学位论文, 中国科学院植物研究所, 北京.]
Chi F, Shen SH, Cheng HP, Jing YX, Yanni YG, Dazzo FB
(2005). Ascending migration of endophytic rhizobia, from
roots to leaves, inside rice plants and assessment of bene-
fits to rice growth physiology. Applied and Environmental
Microbiology, 71, 7271–7278.
de Oliveira AC, Varshney RK (2011). Root Genomics.
Springer, New York. 1–10.
Döbereiner J, Day JM, Dart PJ (1972). Nitrogenase activity in
the rhizosphere of sugar cane and some other tropical
grasses. Plant and Soil, 37, 191–196.
Fu B, Wang WW, Tang M, Chen XD (2009). Isolation and
identification of hydrogen-oxidizing bacteria producing
1-aminocyclopropane-1- carboxylate deaminase and the
determination of enzymatic activity. Acta Microbiologica
Sinica, 49, 395–399. (in Chinese with English abstract)
[付博, 王卫卫, 唐明, 陈兴都 (2009). 一株产1-氨基环
丙烷-1-羧酸脱氨酶的氢氧化细菌的分离鉴定及酶活力
测定及酶活力测定. 微生物学报, 49, 395–399.]
Fuhrmann J, Davey CB, Wollum AG (1986). Desiccation tol-
erance of clover rhizobia in sterile soils. Soil Science So-
ciety of America Journal, 50, 639–644.
Glick BR, Bashan Y (1997). Genetic manipulation of plant
growth-promoting bacteria to enhance biocontrol of phy-
topathogens. Biotechnology Advances, 15, 353–378.
Guo AG, Guo ZK (2007). Biochemical Experimental Technol-
ogy. Higher Education Press, Beijing. (in Chinese) [郭蔼
光, 郭泽坤 (2007). 生物化学实验技术. 高等教育出版
社, 北京.]
Ji KX, Chi F, Yang MF, Shen SH, Jing YX, Dazzo FB, Cheng
HP (2010). Movement of rhizobia inside tobacco and life-
style alternation from endophytes to free-living rhizobia
on leaves. Journal of Microbiology and Biotechnology,
20, 238–244.
Kang YJ, Cheng J, Mei LJ, Hu J, Piao Z, Yin SX (2010). Ac-
tion mechanisms of plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR): a review. Chinese Journal of Applied Ecology,
21, 232–238. (in Chinese with English abstract) [康贻军,
程洁, 梅丽娟, 胡健, 朴哲, 殷士学 (2010). 植物根际
促生菌作用机制研究进展 . 应用生态学报 , 21,
232–238.]
Kase H, Kochler M, Stuzel H (2004). Root growth and dry
matter partitioning of cauliflower under drought stress
conditions: measurement and simulation. European Jour-
nal of Agronomy, 20, 379–394.
Kozlowski TT, Pallardy SG (2002). Acclimation and adaptive
responses of woody plants to environmental stresses. The
Botanical Review, 68, 270–334.
Li XW, Li JM, Duan LS, Li ZH (2010). Primary study on in-
ducing effect of coronatine on drought tolerance of winter
wheat seedlings. Journal of Triticeae Crops, 30, 676–679.
(in Chinese with English abstract) [李相文, 李建民, 段
留生, 李召虎 (2010). 冠菌素诱导冬小麦幼苗抗旱性
的初步研究. 麦类作物学报, 30, 676–679.]
Li YG, Zhou JC (2002). Root colonization of Sinorhizobium
fredii pSym-cured strain HN01 in rhizosphere of Glycine
max. Acta Ecologica Sinica, 22, 1420–1424. (in Chinese
with English abstract) [李友国, 周俊初 (2002). 消除共
生质粒的费氏中华根瘤菌HND29SR在大豆根圈的定殖
动态. 生态学报, 22, 1420–1424.]
Liang Y, Chen SP, Gao YB, Ren AZ. (2002). Effects of endo-
phyte infection on the growth of Lolium perenne L. under
drought stress. Acta Phytoecologica Sinica, 26, 621–626.
(in Chinese with English abstract) [梁宇, 陈世苹, 高玉
葆, 任安芝 (2002). 内生真菌感染对干旱胁迫下黑麦
草生长的影响. 植物生态学报, 26, 621–626.]
Liu HF, Gao YB, Zhang Q, Li X, Li CL (2004). Physio-
ecological responses and their adaptation of different geo-
graphic Leymus chinensis populations to soil drought
stress. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis
刘华伟等: 接种两种固氮菌增强小麦幼苗抗渗透胁迫及生长能力 79

doi: 10.3724/SP.J.1258.2013.00008
Nankaiensis (Natural Science Edition), 37(4), 105–110.
(in Chinese with English abstract) [刘慧芳, 高玉葆, 张
强, 李欣, 李长林 (2004). 不同种群羊草幼苗对土壤干
旱胁迫的生理生态响应. 南开大学学报(自然科学版),
37(4), 105–110.]
Liu HW, Sun C, Yang H, Lin XJ, Guo AG (2012). Promotion
for wheat growth and root colonization after infecting
wheat seeds with Azorhizobium caulinodans. Plant Nutri-
tion and Fertilizer Science, 18, 210–217. (in Chinese with
English abstract) [刘华伟, 孙超, 杨呼, 林晓军, 郭蔼光
(2012). 田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦种子侵染的促生作
用及其在根系内的定殖 . 植物营养与肥料学报 , 18,
210–217.]
Liu HW, Wang QH, Zhang H, Wang R, Xiao HL, Guo AG
(2009). Colonization of Azospirillum brasilense Yu62 in
wheat via EGFP. Acta Botanica Boreali-Occidentalia
Sinica, 29, 2367–2372. (in Chinese with English abstract)
[刘华伟, 王庆贺, 张宏, 王蕊, 肖红利, 郭蔼光 (2009).
巴西固氮螺菌Yu62的EGFP标记及其在小麦体内的定
殖研究. 西北植物学报, 29, 2367–2372.]
Lu YH, Zhang FS (2006). The advances in rhizosphere micro-
biology. Soils, 38, 113–121. (in Chinese with English ab-
stract) [陆雅海, 张福锁 (2006). 根际微生物研究进展.
土壤, 38, 113–121.]
Pan PP, Zhou HB (1995). Plant hormones produced by
Azorhizobium caulinodans ORS 571. Microbiology, 22,
10–13. (in Chinese with English abstract) [潘佩平, 周鸿
宾 (1995). 茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)
ORS571产生的植物激素. 微生物学通报, 22, 10–13.]
Shen SH, Jing YX (2003). Present and prospect of nitro-
gen-fixing in China. Chinese Science Bulletin, 48,
535–540. (in Chinese) [沈世华, 荆玉祥 (2003). 中国生
物固氮研究现状和展望. 科学通报, 48, 535–540.]
Shi Y, Lin Q, Wei DB, Yu ZW (1996). Impacts of soil water
stress on photosynthesis and yield of winter wheat. Acta
Agriculturae Boreali- Sinica, 11(4), 80–83. (in Chinese
with English abstract) [石研 , 林琪, 魏东斌, 于振文
(1996). 土壤水分胁迫对冬小麦光合及产量的影响. 华
北农学报, 11(4), 80–83.]
Timmusk S, Wagner EGH (1999). The plant growth-promoting
rhizobacterium Paenibacillus polymyxa induces changes
in Arabidopsis thaliana gene expression: a possible con-
nection between biotic and abiotic stress responses.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 12, 951–959.
Wang WE, Li Y, Su N, Yu WC (2011). The effects of salt
stress on seed germination of Indigofera amblyantha.
Hubei Agricultural Sciences, 50, 321–324. (in Chinese
with English abstract) [王文恩 , 李颖, 苏农 , 余文成
(2011). 盐胁迫对多花木蓝种子萌发的影响. 湖北农业
科学, 50, 321–324.]
Xu XL, Guan XQ, Liu GS (2003). Effects of cooperation be-
tween associative azotobacteria and rhizobia on wheat
seedling. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 11(3),
66–68. (in Chinese with English abstract) [徐兴良, 关秀
清, 刘公社 (2003). 联合固氮菌与根瘤菌协同作用对
小麦幼苗的影响. 中国生态农业学报, 11(3), 66–68.]
Ye AH, Yuan Y, Yang L, Cai YP, Tian SN (2003). A com-
parison of the effects of two arbuscular mycorrhizal fungal
species on photosynthesis, transpiration and water use ef-
ficiency of wheat. Chinese Agricultural Science Bulletin,
19(3), 18–20. (in English with Chinese abstract) [叶爱华,
袁艺, 杨莉, 蔡永萍, 田胜尼 (2003). 两种丛枝菌根菌
抗旱效应的比较. 中国农学通报, 19(3), 18–20.]
Yu CQ (2011). China’s water crisis needs more than words.
Nature, 470, 307.
Zhang DZ, Wang PH, Zhao HX (1990). Determination of the
content of free proline in wheat leaves. Plant Physiology
Communications, (4), 62–65. (in Chinese with English ab-
stract) [张殿忠, 王沛洪, 赵会贤 (1990). 测定小麦叶片
游离脯氨酸含量的方法. 植物生理学通讯, (4), 62–65.]
Zhao SJ, Li SL, Wang ZQ (2004). Effects of VA mycorrhizal
fungi on drought resistance of spring wheat under
non-irrigation. Journal of Inner Mongolia Institute of Ag-
riculture and Animal Husbandry, 25(4), 43–46. (in Chi-
nese with English abstract) [赵士杰, 李树林, 王志强
(2004). VA菌根真菌对旱作春小麦抗旱性的影响. 内蒙
古农业大学学报, 25(4), 43–46.]
Zhou LP, Liu WJ, Ma HC, Wu JR (2010). Research progress
on drought resistance of rhizobium strains and plants in-
oculated with rhizobium. Journal of Anhui Agricultural
Sciences, 38, 11978–11980, 11983. (in Chinese with
English abstract) [周利平 , 刘文杰 , 马焕成 , 伍建榕
(2010). 根瘤菌菌株和接种根瘤菌植株的耐旱性研究进
展. 安徽农业科学, 38, 11978–11980, 11983.]
责任编委: 李凤民 责任编辑: 李 敏