NO和H2O2是参与植物抗非生物胁迫反应的重要信号分子, 为了确定NO和H2O2在大豆(Glycine max)根尖和根边缘细胞(root border cells, RBCs)耐铝反应中的作用及其相互关系, 以‘浙春3号’大豆为材料, 研究了铝毒胁迫下大豆根尖内源NO和H2O2的变化, 以及外源NO和H2O2诱导大豆根尖和RBCs的耐铝反应。结果表明, 50 μmol·L-1 Al处理48 h显著抑制大豆根的伸长, 提高Al在根尖的积累, 同时显著增加根尖内源NO和H2O2含量。施加0.25 mmol·L-1外源NO供体亚硝基铁氰化钠(Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O, sodium nitroprusside, SNP)和0.1 mmol·L-1H2O2, 能有效地缓解Al对大豆根伸长的抑制、根尖Al积累和RBCs 的死亡, 该缓解作用可以被0.05 mmol·L-1 NO清除剂2-(4- 羧基苯)-4,4,5,5- 四甲基咪唑-1- 氧-3- 氧化物, 钾盐(C14H16N2O4·K, carboxy-PTIO, cPTIO)和150 U·mL-1 H2O2清除酶(catalase, CAT)逆转。并且外源NO能够显著促进根尖H2O2的积累, 而外源H2O2对根尖NO的含量无显著影响。这表明NO和H2O2是诱导大豆根尖及RBCs耐铝反应的两种信号分子, NO可能通过调控H2O2的形成, 进而诱导大豆根尖及RBCs的耐铝反应。
Aims Nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) function as signaling molecules in plants. A role for NO and H2O2 in the regulation of many abiotic stress responses, including drought, salt, heat, heavy metal and Al stresses, has been proposed. Our objective was to investigate (a) the Al-dependent accumulation of endogenous NO and H2O2 in root tips and (b) the role of exogenous NO and H2O2 in alleviating Al toxicity in root tips and root border cells (RBCs). Methods Seedlings of soybean (Glycine max) ‘Zhechun No. 3’ were divided into two groups for hydroponic and aeroponic cultured experiments. In order to investigate the response of endogenous NO and H2O2 in root tips to 50 μmol·L-1Al, we determined root elongation, Al content in root apexes, endogenous NO and H2O2 content and their location in hydroponic cultured experiments. In the aeroponic culture experiments, seedlings were pretreated with exogenous NO and H2O2, then RBCs viability as well as the indicators in hydroponic cultured experiments were tested to clarify the role of exogenous NO and H2O2 on alleviating Al toxicity in root tips and RBCs. Important findings Al inhibited root elongation, increased Al content in root apexes and induced endogenous NO and H2O2 accumulation with the hydroponic culture. Results of the aeroponic experiments demonstrated that both 0.25 mmol·L-1 NO donor sodium nitroprusside (SNP) and 0.1 mmol·L-1 H2O2 alleviated the inhibitory effect of Al, decreased Al accumulation in root tips and enhanced RBCs viability. The 0.05 mmol·L-1 NO scavenger cPTIO (carboxy-PTIO) and 150 U·mL-1 H2O2 scavenger CAT (catalase) reversed the alleviating effect. Furthermore, the results indicated that exogenous NO promoted the accumulation of H2O2 in root apexes, while exogenous H2O2 did not significantly affect NO content in root apexes. All of these results suggested that the rise of NO and H2O2 were in accordance with defense response in root apexes and RBCs to Al toxicity in soybean, and the increase of NO may regulate the H2O2 production to protect soybean from Al toxicity.
全 文 :植物生态学报 2011, 35 (9): 981–989 doi: 10.3724/SP.J.1258.2011.00981
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
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收稿日期Received: 2011-03-09 接受日期Accepted: 2011-07-02
* 通讯作者Author for correspondence (E-mail: mzcai@zjnu.cn)
NO和H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的
作用
王芳妹1 蔡妙珍2* 张淑娜1 王 宁1 李华飞1,3 胡雪娜2 虞舒航2
1浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华 321004; 2浙江师范大学地理与环境科学学院, 浙江金华 321004; 3正始中学, 浙江宁波 315100
摘 要 NO和H2O2是参与植物抗非生物胁迫反应的重要信号分子, 为了确定NO和H2O2在大豆(Glycine max)根尖和根边缘
细胞(root border cells, RBCs)耐铝反应中的作用及其相互关系, 以‘浙春3号’大豆为材料, 研究了铝毒胁迫下大豆根尖内源NO
和H2O2的变化, 以及外源NO和H2O2诱导大豆根尖和RBCs的耐铝反应。结果表明, 50 μmol·L–1 Al处理48 h显著抑制大豆根的
伸长, 提高Al在根尖的积累, 同时显著增加根尖内源NO和H2O2含量。施加0.25 mmol·L–1外源NO供体亚硝基铁氰化钠
(Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O, sodium nitroprusside, SNP)和0.1 mmol·L–1H2O2, 能有效地缓解Al对大豆根伸长的抑制、根尖Al积累和
RBCs的死亡 , 该缓解作用可以被 0.05 mmol·L–1 NO清除剂 2-(4-羧基苯 )-4,4,5,5-四甲基咪唑 -1-氧 -3-氧化物 ,钾盐
(C14H16N2O4·K, carboxy-PTIO, cPTIO)和150 U·mL–1 H2O2清除酶(catalase, CAT)逆转。并且外源NO能够显著促进根尖H2O2的积
累, 而外源H2O2对根尖NO的含量无显著影响。这表明NO和H2O2是诱导大豆根尖及RBCs耐铝反应的两种信号分子, NO可能
通过调控H2O2的形成, 进而诱导大豆根尖及RBCs的耐铝反应。
关键词 铝毒, H2O2, NO, 根尖, 根边缘细胞, 大豆
Effects of nitric oxide and hydrogen peroxide on induction of a defense response in the root
tips and root border cells of soybean plants to Al toxicity
WANG Fang-Mei1, CAI Miao-Zhen2*, ZHANG Shu-Na1, WANG Ning1, LI Hua-Fei1,3, HU Xue-Na2, and YU
Shu-Hang2
1College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; 2College of Geography and Environmental Sciences,
Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; and 3Zhengshi Middle School, Ningbo, Zhejiang 315100, China
Abstract
Aims Nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) function as signaling molecules in plants. A role for NO
and H2O2 in the regulation of many abiotic stress responses, including drought, salt, heat, heavy metal and Al
stresses, has been proposed. Our objective was to investigate (a) the Al-dependent accumulation of endogenous
NO and H2O2 in root tips and (b) the role of exogenous NO and H2O2 in alleviating Al toxicity in root tips and
root border cells (RBCs).
Methods Seedlings of soybean (Glycine max) ‘Zhechun No. 3’ were divided into two groups for hydroponic and
aeroponic cultured experiments. In order to investigate the response of endogenous NO and H2O2 in root tips to 50
μmol·L–1Al, we determined root elongation, Al content in root apexes, endogenous NO and H2O2 content and their
location in hydroponic cultured experiments. In the aeroponic culture experiments, seedlings were pretreated with
exogenous NO and H2O2, then RBCs viability as well as the indicators in hydroponic cultured experiments were
tested to clarify the role of exogenous NO and H2O2 on alleviating Al toxicity in root tips and RBCs.
Important findings Al inhibited root elongation, increased Al content in root apexes and induced endogenous
NO and H2O2 accumulation with the hydroponic culture. Results of the aeroponic experiments demonstrated that
both 0.25 mmol·L–1 NO donor sodium nitroprusside (SNP) and 0.1 mmol·L–1 H2O2 alleviated the inhibitory effect
of Al, decreased Al accumulation in root tips and enhanced RBCs viability. The 0.05 mmol·L–1 NO scavenger
cPTIO (carboxy-PTIO) and 150 U·mL–1 H2O2 scavenger CAT (catalase) reversed the alleviating effect. Further-
more, the results indicated that exogenous NO promoted the accumulation of H2O2 in root apexes, while exoge-
nous H2O2 did not significantly affect NO content in root apexes. All of these results suggested that the rise of NO
and H2O2 were in accordance with defense response in root apexes and RBCs to Al toxicity in soybean, and the
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increase of NO may regulate the H2O2 production to protect soybean from Al toxicity.
Key words Al toxicity, hydrogen peroxide, nitric oxide, root apex, root border cells, soybean
土壤中的铝大部分以固态形式存在, 通常对植
物和环境没有毒害作用, 但在酸性条件(pH < 5)下,
固态铝易被活化而形成可溶态的铝。当土壤溶液中
Ca : Al接近1, 并且土壤溶液中Al的浓度达到1
mg·L–1时, 铝就会对植物产生毒害(Kawai, 1980)。目
前铝毒是酸性土壤上限制作物生产的主要因素之
一, 发生面积占世界耕地面积的40%–70%, 严重影
响着全世界酸性土壤上的作物生产(Horst et al.,
2010)。铝毒直接作用于根系, 可抑制根伸长并破坏
根尖结构。一方面, 根尖是识别铝毒胁迫的主要位
点, Delhaize和Ryan (1995)认为根尖积累的铝及其
所产生的损伤远远超过根的其他部位; 另一方面,
植物的根尖可通过提高根际pH或分泌有机酸、磷酸
和酚类等物质, 在根区与铝螯合, 使离子态的铝变
成螯合态的铝等途径缓解铝毒害(杨建立等, 2005;
Ma, 2007)。
大多数植物的根尖都有一群特殊的游离细胞,
被定义为“根边缘细胞(root border cells, RBCs)”, 它
在调节根际生态环境, 抵抗环境胁迫造成的根尖伤
害中起着多种防御和保护功能(Hawes et al., 2000)。
研究发现, 铝毒胁迫下植物根尖附着的RBCs能通
过形成黏液层(Miyasaka & Hawes, 2001)、或以其细
胞壁结合Al (Yu et al., 2009)、以及诱导RBCs发生程
序性死亡(Tamás et al., 2005), 并以死亡的细胞螯合
铝来对抗铝毒胁迫。目前, 在豌豆(Pisum sativum)
(Miyasaka & Hawes, 2001)、大麦(Hordeum vulgare)
(Tamás et al., 2005)和燕麦(Avena sativa) (Hawes et
al., 2000)等植物中都发现, RBCs能够通过以上途径
缓解铝毒害。但有关RBCs缓解铝毒的信号途径还不
清楚。
NO和H2O2都是可跨膜的信号分子, 参与了植
物对许多生物和非生物胁迫(如极端温度、臭氧、机
械伤害、干旱和冷害)的抗逆调控。并且, 在许多胁
迫情况下, NO和H2O2信号之间相互联系, 介导多种
信号途径(Neil et al., 2002)。已有报道表明, NO和活
性氧(reactive oxygen species, ROS)在促进过敏反应
(hypersensitive response, HR)中有协同效应, NO能
维持高的、持续的H2O2水平(Delledonne et al., 2001),
调控H2O2介导的番茄(Lycopersicum esculentum)对
炭疽菌(Colletrichum coccodes)的防卫反应(Wang &
Higgins, 2006), 并且NO和H2O2在活化防卫反应的
转录过程中具有互补功能(Polverari et al., 2003)。与
此相反 , Orozco-Cárdenas和Ryan (2002)和Tada等
(2004)指出, NO可作为抗氧化剂抑制H2O2的积累,
降低其在相关防卫基因中的表达效应。可见, NO和
H2O2在植物抗逆反应中的相互关系多样, 其在植物
耐铝反应中的相互关系有待明确。
近年来, NO或H2O2作为信号分子提高植物铝
毒耐性的研究取得了一些进展。铝毒分别引起红芸
豆(Phaseolus vulgaris) (Wang et al., 2010)和芙蓉葵
(Hibiscus moscheutos) (Tian et al., 2007)内源NO的
形成, NO既可作为抗氧化剂缓解铝诱导的决明子
(Cassia tora)根系的氧化胁迫(Wang & Yang, 2005),
也可作为信号分子提高决明子细胞壁过氧化物酶
活性和木质素的合成(Xue et al., 2008)。另外, 铝毒
害的症状之一是产生大量的活性氧(H2O2、O2–、·OH
等), 这将激活一系列信号转导途径来抵御铝毒伤
害(Pan et al., 2001; 李荣峰等, 2008)。李刚等(2010)
指出, 小麦(Triticum aestivum)根尖细胞壁的H2O2在
铝胁迫下根系的木质化和细胞壁的氧化交联中起
重要作用。
以往的研究表明, NO或H2O2分别参与了植物
的铝毒害和耐铝反应, 而两者在大豆(Glycine max)
耐铝毒中的相互关系未被阐明。并且, 虽然近年来
关于NO和H2O2间的相互作用在完整植物(Neil et
al., 2002; Zhang et al., 2007)以及抗病(Wang & Hig-
gins, 2006; 贾芝琪等, 2007; Fan et al., 2008)等反应
中已证实, 但在细胞水平的对植物抗逆调控的相互
作用关系有待于进一步研究。本试验以大豆为材料,
研究铝毒胁迫下大豆根尖内源NO和H2O2含量的变
化, 以及外源NO和H2O2诱导大豆根尖和RBCs的耐
铝反应及相互关系, 拟在完整植株和细胞水平揭示
植物耐铝的信号调控机制, 为酸性土壤区铝毒的防
控提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料和试验设计
材料为浙江省农业科学院大豆组提供的‘浙春3
王芳妹等: NO和 H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的作用 983
doi: 10.3724/SP.J.1258.2011.00981
号’大豆。种子露白后, 选取根长一致的幼苗, 分两
组实验:
实验一 大豆根尖内源NO和H2O2对铝毒的响
应。以水培的大豆幼苗为材料。将露白的大豆种子
沙培48 h (25 , 14 h℃ 全光照, 10 h黑暗), 挑选生长
状况接近的幼苗, 转移至装有处理液的试管(每支
试管装处理液18 mL, 培养一株大豆)中, 以0 (–Al)、
50 μmol·L–1 AlCl3 (Al)处理液处理, 处理液含0.5
mmol·L–1 CaCl2, pH 4.5。分别测定0、1、2、4、6、
8、12、24、36和48 h的根相对伸长率。Al处理48 h
后测定水培条件下的根尖Al含量、根尖内源NO和
H2O2含量, 并进行NO和H2O2积累的原位观察。
实验二 外源NO和H2O2在诱导大豆根尖及
RBCs耐铝反应中的作用。以悬空培养的大豆幼苗为
材料。为了获得一套完整的根尖RBCs并检测其活
性, 将露白的大豆种子分别播于悬空培养装置的
网上, 进行悬空培养(Yu et al., 2009)。每一装置播
种50颗露白大豆 , 并盖上保鲜膜 , 处理液每隔3
min以雾状形式处理大豆根尖40 s, 从而使RBCs保
持于根尖但不脱落。具体处理如下:先分别用
NO供体亚硝基铁氰化钠(SNP, Na2[Fe(CN)5NO]·
2H2O)、NO清除剂2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑
-1-O-3-氧化物,钾盐(cPITO, C14H16N2O4·K)、H2O2
或过氧化氢酶(CAT) (均含0.5 mmol·L–1 CaCl2, pH
4.5)溶液喷雾预处理24 h, 其中无Al组和单Al组用
0.5 mmol·L–1 CaCl2 (pH 4.5)预处理; 接着所有Al处
理组换用50 μmol·L–1 AlCl3溶液(含0.5 mmol·L–1
CaCl2, pH 4.5)喷雾处理48 h, 而无Al组换用0.5
mmol·L–1 CaCl2 (pH 4.5)处理48 h。各处理组设置如
下: (1) –Al:0 mol·L–1 AlCl3; (2) Al:50 mol·L–1
AlCl3; (3) Al + SNP: 50 mol·L–1 AlCl3 + 0.25 mmol·
L–1 SNP; (4) Al + cPTIO:50 mol·L–1 AlCl3 + 0.05
mmol·L–1 cPTIO; (5) Al + H2O2:50 μmol·L–1 AlCl3 +
0.1 mmol·L–1 H2O2; (6) Al + CAT:50 μmol·L–1 AlCl3
+ 150 U·mL–1 CAT。NO和H2O2供体及其清除剂预
处理24 h, Al处理48 h后测定悬空条件下的根相对
伸长率、根尖Al含量、RBCs活性及根尖NO和H2O2
含量。
1.2 根相对伸长率的测定
先测定Al处理前大豆的初根长, Al处理0、1、2、
4、6、8、12、24、36和48 h后测定对应幼苗的终根
长, 每个处理重复20次。根相对伸长率= (–Al组的根
伸长量/处理组的根伸长量) × 100%。
1.3 根尖Al含量的测定
铝处理后, 分别剪取0–10和10–20 mm的大豆
根段20个, 这些根段先用0.5 mmol·L–1 CaCl2清洗3
次, 再用蒸馏水清洗3次, 吸干后, 用2 mol·L–1 HCl
振荡浸提24 h。浸提液用电感耦合等离子光谱发生
仪(ICP)法(李刚等 , 2010)测定根尖Al含量(mg·g–1
DW), 每个样品重复3次。
1.4 根尖H2O2含量的测定及原位观察
剪取处理后10 mm长的根尖10个, 用预先冷藏
的丙酮研磨至匀浆, 10 714 rpm离心20 min, 上清液
为H2O2待测液。用二甲酚橙法(李忠光等, 2007)测定
根尖H2O2的含量, 每个样品重复3次。
原位观察参照Rodriguez-Serrano等(2006)文献。
取10 mm长的大豆根尖, 用磷酸缓冲液(phosphate
buffer solution, PBS)稀释DCF-DA母液(碧云天生物
技术研究所提供, 南通)至10 μmol·L–1, 在37 ℃孵
育20 min后用PBS洗涤3次 , 然后在荧光显微镜
(Zeiss, Jena, Germany)下进行观察并拍照。
1.5 根尖NO含量的测定及原位观察
将新鲜的10 mm长的根尖切成片段, 加入100
U CAT和100 U超氧化物歧化酶(SOD), 反应5 min
以除去活性氧。然后 , 加入HbO2至终浓度为10
μmol·L–1, 37 ℃孵育2 min, 取0.1 mL上清液在401和
421 nm处测定光吸收值以计算NO的积累量, 每个
处理重复3次(Murphy & Noack, 1994)。
原位观察参照Rodríguez-Serrano等(2006)文献,
取10 mm长的大豆根尖, 用试剂盒(碧云天生物技术
研究所)提供的DAF-FM DA稀释液稀释DAF-FM
DA, 使终浓度为5 μmol·L–1。用稀释好的DAF-FM
DA处理根尖 , 在37 ℃下 , 孵育30 min后 , 用20
mmol·L–1 HEPES/NaOH (pH 7.4)缓冲溶液清洗根
尖, 并在荧光显微镜下观察、拍照。
1.6 RBCs活性的测定
剪取处理后10 mm长的根尖10个, 放入预先装
有1 mL双蒸水的离心管中, 静置1–2 min待RBCs在
水中展开, 同时用吸管反复吸取溶液使RBCs在水
中充分散开, 形成RBCs悬浮液。死细胞与活细胞计
数参照Pan等(2001)文献, 重复10次。RBCs的活性=
活细胞数/(活细胞数+死细胞数) × 100%。
1.7 统计分析
除根相对伸长率测定重复20次和RBCs活性测
984 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (9): 981–989
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图1 不同铝毒害时间对大豆根长的影响(平均值±标准误
差)。不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 1 Time-dependent effects of Al toxicity on root elonga-
tion of soybean (mean ± SE). Different small letters mean
significant differences (p < 0.05).
定重复10次外, 其他各试验重复3次, 所得数据计
算平均值和标准误差, 并用SPSS 10.0软件进行方
差分析(p < 0.05)。
2 结果和分析
2.1 大豆根尖内源NO和H2O2对铝毒害的响应
2.1.1 根长
50 μmol·L–1Al处理6 h时便观察到大豆根伸长
明显受到抑制(p < 0.05), 随着处理时间的延长, 大
豆根伸长受抑制程度加剧, 在处理48 h时, 根相对
伸长率降低至42% (图1)。
2.1.2 根尖Al含量
Al处理48 h后, 大豆根尖0–10和10–20 mm根段
的Al含量均显著上升(p < 0.05), 0–10 mm根段的Al
含量为10–20 mm根段的1.55倍(图2)。可见, 根尖
0–10 mm是Al积累的主要部位。
2.1.3 根尖内源NO和H2O2的含量及原位观察
Al处理48 h, 大豆根尖的NO和H2O2含量分别
上升了30.5%和73.9% (图3)。另外, 荧光染色结果显
示, 在–Al处理下, NO和H2O2根尖荧光强度弱(图
4A、4C), 即NO和H2O2在根尖积累少。Al处理48 h
后, 荧光强度明显增加(图4B、4D), 这与NO和H2O2
的定量测定结果一致。说明铝毒诱导NO和H2O2在
大豆根尖积累。
图2 铝毒对大豆根尖Al含量的影响(平均值±标准误差)。不
同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 2 Effects of Al toxicity on Al content in soybean root
apex (mean ± SE). Different small letters mean significant dif-
ferences (p < 0.05).
图3 铝毒对大豆根尖内源NO和H2O2含量的影响(平均值±
标准误差)。不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 3 Effects of Al toxicity on endogenous NO and H2O2
contents in soybean root apex (mean ± SE). Different small
letters mean significant differences (p < 0.05).
图4 铝毒害下大豆根尖NO和H2O2积累的原位观察。A, B,
NO积累的原位观察(A, –Al; B, Al)。C, D, H2O2积累的原位观
察(C, –Al; D, Al)。
Fig. 4 The in situ observation of NO and H2O2 accumulation
in root apex of soybean under Al toxicity. A, B, the in situ ob-
servation of NO accumulation (A, –Al; B, Al). C, D, the in situ
observation of H2O2 accumulation (C, –Al; D, Al).
2.2 外源NO和H2O2在诱导大豆根尖及RBCs耐铝
反应中的作用
2.2.1 根长
Al处理显著抑制大豆根伸长, 根相对伸长率比
王芳妹等: NO和 H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的作用 985
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对照(–Al)下降了72.2% (图5A、5B)。先用SNP预处
理24 h, 再经Al处理48 h后, 根伸长受抑情况显著
缓解, 其根相对伸长率比单Al处理增加8.4%。而
cPITO (NO清除剂)预处理后, 根相对伸长率与单Al
处理的相比下降6.7%。说明SNP能显著缓解Al对大
豆根伸长的抑制, 而cPTIO作为一种NO清除剂, 在
适当的浓度下消除了这种缓解作用。
铝毒胁迫下, 外源H2O2预处理后, 其根相对伸
长率与单Al处理的相比增加了3.2%, 而经CAT
(H2O2清除剂)预处理后, 其根相对伸长率比单Al处
理下降3.3% (p < 0.05)。可见, 与NO一样, H2O2对铝
毒引起的大豆根伸长的抑制也具有缓解作用。
2.2.2 根尖Al含量
与单Al处理相比, SNP预处理时根尖Al含量下
降了35.3%, 而cPTIO预处理时根尖Al含量增加了
72.6% (图6A)。可见SNP减少Al毒胁迫下根尖的Al
积累, 而cPTIO作为一种NO清除剂, 可能清除了铝
胁迫下内源NO的积累, 即可能消除了大豆根尖的
部分耐Al毒调节能力, 从而导致大豆根尖耐Al能力
减弱, 根尖Al积累增加。
与单Al处理相比, H2O2预处理显著降低了根尖
Al含量(p < 0.05), 而CAT预处理后, 其根尖Al含量
比单Al处理增加95.6% (图6B)。推测H2O2的积累是
铝胁迫下大豆根尖耐Al毒的一种抗逆反应, CAT可
图5 NO和H2O2对铝胁迫下大豆根相对伸长率的影响(平均值±标准误差)。A, NO。B, H2O2。CAT, 过氧化氢酶; cPTIO, 2-(4-
羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-O-3-氧化物, 钾盐; SNP, 亚硝基铁氰化钠。不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 5 Effects of NO and H2O2 on relative root elongation in soybean under Al toxicity (mean ± SE). A, NO. B, H2O2. CAT,
catalase; cPTIO, 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyllimidazoline-1-oxyl-3-oxyde, potassium salt; SNP, sodium nitroprusside.
Different small letters mean significant differences (p < 0.05).
图6 NO和H2O2对铝胁迫下大豆根尖Al含量的影响(平均值±标准误差)。A, NO。B, H2O2。CAT, 过氧化氢酶; cPTIO, 2-(4-羧
基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-O-3-氧化物, 钾盐; SNP, 亚硝基铁氰化钠。不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 6 Effects of NO and H2O2 on Al content in root apex of soybean under Al toxicity (mean ± SE). A, NO. B, H2O2. CAT,
catalase; cPTIO, 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyllimidazoline-1-oxyl-3-oxyde, potassium salt; SNP, sodium nitroprusside.
Different small letters mean significant differences (p < 0.05).
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图7 Al毒胁迫下NO和H2O2对大豆根尖根边缘细胞活性的影响(平均值±标准误差)。A, NO。B, H2O2。CAT, 过氧化氢酶;
cPTIO, 2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-O-3-氧化物, 钾盐; SNP, 亚硝基铁氰化钠。不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 7 Effects of NO and H2O2 on root border cells (RBCs) viability in root apex of soybean under Al toxicity(mean ± SE). A, NO.
B, H2O2. CAT, catalase; cPTIO, 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyllimidazoline-1-oxyl-3-oxyde, potassium salt; SNP, sodium
nitroprusside. Different small letters mean significant differences (p < 0.05).
图8 Al毒胁迫下外源NO和H2O2对大豆根尖NO和H2O2含量的影响(平均值±标准误差)。A, NO。B, H2O2。CAT, 过氧化氢酶;
cPTIO, 2-(4-羧基苯)-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-O-3-氧化物, 钾盐; SNP, 亚硝基铁氰化钠。不同小写字母表示差异显著(p < 0.05)。
Fig. 8 Effects of exogenous NO and H2O2 contents in root apex of soybean under Al toxicity (mean ± SE). A, NO. B, H2O2. CAT,
catalase; cPTIO, 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethyllimidazoline-1-oxyl-3-oxyde, potassium salt; SNP, sodium nitroprusside.
Different small letters mean significant differences (p < 0.05).
能清除了铝胁迫下内源H2O2的积累, 即消除了大豆
根尖的部分耐Al毒调节能力, 从而导致大豆根尖Al
积累增加。可见, H2O2预处理能减少Al在大豆根尖
的积累。
2.2.3 根尖RBCs活性
Al处理显著降低了大豆根尖RBCs的活性(图
7A、7B)。与单Al处理的相比, SNP和H2O2预处理后,
其细胞活性均显著上升(p < 0.05)。表明NO或H2O2
缓解Al毒胁迫下大豆根尖RBCs的死亡。cPTIO和
CAT预处理后 , RBCs活性分别下降了 24.1%和
42.2%, 进一步验证了NO和H2O2缓解Al毒胁迫下大
豆RBCs的死亡。
2.2.4 根尖NO和H2O2含量
为了明确外源NO和H2O2对Al毒胁迫下大豆根
尖内源NO和H2O2的调节作用及其相互关系, 分别
测定了根尖内源NO和H2O2的含量。与单Al处理相
比, 经SNP预处理后, 大豆根尖的NO含量上升了
48.7%, 而经cPTIO预处理后, 大豆根尖的NO含量
下降了57.3% (图8A)。可见, 外源NO供体(SNP)显著
提高了铝胁迫下大豆根尖内源NO的含量(p < 0.05),
而外源NO的清除剂cPTIO确实清除了铝胁迫下大
豆根尖内源NO的积累。并且, 经SNP预处理, 大豆
王芳妹等: NO和 H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的作用 987
doi: 10.3724/SP.J.1258.2011.00981
根尖H2O2含量显著上升(p < 0.05), 而cPTIO处理则
显著降低了大豆根尖的H2O2含量, 其变化规律与
NO含量一致。表明NO对大豆根尖H2O2的积累有促
进作用。
经外源H2O2预处理, 大豆根尖H2O2显著积累,
CAT预处理减少了根尖H2O2的积累, 表明外源H2O2
供体促进了Al胁迫下根尖内源H2O2的积累, 而清除
剂则抑制了根尖内源H2O2的积累(图8B)。另外, Al
毒胁迫下, 经H2O2和CAT预处理, 大豆根尖的NO
含量无显著差异(p > 0.05), 表明H2O2对大豆根尖
NO的积累无明显作用。
3 讨论
NO和H2O2参与了植物对多种生物和非生物胁
迫的抗逆调控。许多植物在逆境胁迫下常见的早期
反应就是NO和H2O2的合成积累。例如, 在1 min内
就可检测真菌激发子刺激所引起的拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中NO和H2O2的形成 , NO和
H2O2的积累在6–12 min达到最高值(Clarke et al.,
2000); 热激可以迅速诱发金丝桃(Hypericum mono-
gynum)细胞内NO和H2O2含量的上升 (徐茂军等 ,
2008); 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)毒素能迅速
诱导棉花(Gossypium hirsutum)细胞的NO和H2O2爆
发, 因为此两者参与了棉花细胞对大丽轮枝菌毒素
的抗性反应(贾芝琪等, 2007)。本试验结果发现, Al
毒诱导大豆根尖内源NO和H2O2显著积累(图3, 图
4), 可见, NO和H2O2可能在大豆对Al毒的抗逆反应
中起一定作用。
为了验证NO和H2O2在植物抗逆反应中的作用,
采用NO或H2O2缺陷突变体(NO或H2O2水平极低甚
至没有)与野生型进行比较分析是较为科学和有效
的方法(Tian et al., 2007; Zhao et al., 2007), 但是由
于专一突变体难以获得, 目前除了在拟南芥等少数
植物的研究中采用该方法外, 在大多数植物中普遍
有效的方法是加入外源供体及清除剂 (Wang &
Yang, 2005; 贾芝琪等, 2007; Wang et al., 2010)。尽
管无法确定内源性NO和H2O2与外源性(人工添加)
的NO和H2O2在生物学效应上是否相同, 但如果能
验证通过人工加入NO和H2O2供体及清除剂分别显
著提高或降低逆境下植物的内源NO和H2O2水平,
则人工添加的处理方法是可以作为验证NO和H2O2
在抗逆反应中作用的有效方法(徐茂军等, 2008)的。
在本试验中, 外源NO和H2O2供体及清除剂分别显
著提高或降低铝毒下植物内源NO和H2O2的水平(图
8), 并且外源NO和H2O2诱导了大豆根尖及RBCs的
耐铝反应:缓解Al毒对大豆根伸长的抑制(图5), 减
少Al在根尖的积累 (图6), 缓解Al毒引起的大豆
RBCs的死亡(图7)。这些结果均说明NO和H2O2在诱
导大豆根尖及RBCs的耐铝反应中有积极作用。而外
源NO和H2O2的清除剂显著降低了铝胁迫下内源
NO和H2O2的积累, 加重了大豆的铝毒害, 进一步
表明大豆内源NO和H2O2含量与大豆根尖及RBCs
的耐铝能力呈正相关, 验证了铝胁迫下NO和H2O2
诱导了大豆根尖及RBCs的耐铝反应。
许多研究表明, NO和H2O2信号之间相互联系,
它们可以通过共享某些信号转导元件而使其信号
转导途径存在着一些重叠, 介导多种信号途径。最
近一些研究表明, NO和H2O2信号途径可以共享某
些信号转导元件。例如, 丝裂原活化蛋白激酶、Ca2+
以及Ca2+结合蛋白(钙际上调素)等, 它们可以同时
作用于NO和H2O2信号途径的下游(Kovtun et al.,
2000; Mittle et al., 2004)。目前有关Al毒胁迫下NO
和H2O2信号分子间的应答作用尚少见报道。本试验
结果表明, 外源NO诱导大豆根尖H2O2的积累(图
8A), 而H2O2对大豆根尖NO的积累无明显作用(图
8B)。可见, 在Al毒胁迫下H2O2可能位于NO信号通
路的下游, NO可以通过调控H2O2的形成, 进而诱导
大豆根尖及RBCs的耐铝反应。这与在炭疽菌与番茄
互作反应中NO调控H2O2介导的防卫反应(Wang &
Higgins, 2006)的结果一致。并且在大麦中也发现,
NO除了可以直接抑制顺乌头酸酶(aconitas)活性外,
还可以通过调控H2O2, 间接抑制顺乌头酸酶活性来
提高植物的抗氧化胁迫的能力(张文利等, 2002)。
RBCs是从根尖脱落的具有特殊生理活性和生
理学意义的活性细胞群, 其产生和脱落后的行为受
胞内和胞外信号的调节(禹艳红和宾金华, 2002)。本
试验中 , Al毒胁迫下 , 外源NO和H2O2预处理使
RBCs维持较高的活性, 而在NO和H2O2清除剂作用
下, RBCs活性均显著下降。可见在细胞水平也同样
表现出NO和H2O2对大豆耐Al性的调控作用。Tamás
等(2005)及Pan等(2002)发现, 一方面, 在Al毒害起
始阶段或低Al浓度诱导下, RBCs产生的H2O2可作
为信号分子激活根尖抗氧化防卫系统; 另一方面,
在高Al浓度下, RBCs能通过活跃地产生大量的ROS
988 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2011, 35 (9): 981–989
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诱导部分RBCs死亡以螯合Al, 阻止进一步的Al毒
害。李荣峰等(2008)也指出, RBCs的死亡是由ROS
作为信号分子激活细胞程序性死亡信号传导途径
而引起的细胞凋亡。据此, 我们推测Al毒诱导RBCs
产生H2O2或ROS是由NO调控的, 其中H2O2或ROS
可通过激活抗氧化系统或细胞凋亡信号途径来抵
御Al毒伤害。
综上所述 , Al毒胁迫下大豆根尖内源NO和
H2O2显著积累。外源NO供体SNP和H2O2可以有效
地缓解Al对大豆根伸长的抑制、Al在根尖的积累和
RBCs死亡。NO清除剂(cPTIO)和H2O2清除酶(CAT)
则逆转NO和H2O2的这种缓解作用。表明NO和H2O2
信号分子在诱导大豆根尖及RBCs的耐铝反应中起
作用。
致谢 国家自然科学基金(30800705)、浙江省自然
科学基金(3110561)和浙江师范大学地理与环境科
学学院第八期课题共同资助。试验过程得到吕洪飞
教授(浙江师范大学)的帮助, 在此表示感谢。
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责任编委: 段昌群 责任编辑: 黄祥忠