全 文 ：文章编号:1000-2375(2006)03-0313-04
铜胁迫下两种来源野胡萝卜的
膜脂过氧化水平比较
吴　燕 ,万永红 ,谢明吉
(湖北大学 生命科学学院 , 湖北 武汉 430062)
摘　要:研究了在不同浓度的铜处理下 , 两种来源野胡萝卜(矿区:湖北铜绿山铜矿;正常土壤:湖北武汉
严西湖)膜脂过氧化水平和生长情况.结果表明:在相同浓度的铜处理下 ,非矿区种的丙二醛(MDA)、氧自由基
以及过氧化氢含量明显高于矿区种 ,显示非矿区种体内膜脂过氧化水平较高 ,受到较严重的过氧化伤害;矿区
海洲香薷更能耐受铜胁迫 ,矿区种已经形成了抗性生态型.
关键词:野胡萝卜;铜;丙二醛(MDA);氧自由基;过氧化氢(H2O2);抗性生态型
中图分类号:X173　　文献标志码:A
收稿日期:2005-10-21
作者简介:吴燕(1957-　),女 ,实验师
生长在受污染生态环境中的植物 ,在与生境的长期作用中 ,由于适应作用而形成抗性生态型.研究
抗性生态型和敏感生态型的生理生化差异是揭示植物抗性机理 ,使重金属污染的植物修复技术得到广
泛应用的一条重要途径.研究表明 , 过量的重金属在植物体内产生活性氧并且打破其清除机制的动态
平衡 ,造成过氧化伤害[ 1 ～ 5] .本实验所选用的材料———野胡萝卜是铜矿区的一种优势植物 ,不仅能在铜
含量很高的土壤中生长 ,而且体内可以富集铜[ 6 ,7] .本文中选取了两种不同来源(一种来自正常土壤 ,一
种来自铜矿区)的野胡萝卜进行不同浓度的铜处理 ,研究比较其膜脂过氧化水平 、氧自由基 ,过氧化氢积
累 ,以期能揭示抗性植物的生理机制.
1　材料与方法
1.1　材料　野胡萝卜(Daucus carota L.):矿区种子采自湖北铜绿山铜矿 ,对照种子采自湖北武汉严西
湖.铜绿山古铜矿土壤基本理化性质如下:土壤 pH为 5.5 ～ 6.0;平均总铜含量为 7 789mg·kg-1;有效态
铜含量为 704mg·kg-1;有机质含量为22.76 g·kg-1;阳离子交换量(CEC)为 20.22 cmol·kg-1.正常土壤采
自农科院油料所 ,基本理化性质如下:土壤 pH 为 7.1;平均总铜含量为 58.6 mg·kg-1;有效态铜含量为
9.6mg·kg-1;有机质含量为 18.4 g·kg-1;阳离子交换量(CEC)为 15.8 cmol·kg-1 ,土壤风干 ,过筛 ,用于植
株培养.
1.2　材料培养
1.2.1　萌发　将种子分别用 0.1 %的NaClO浸泡消毒 30min ,再用自来水冲洗干净 ,平铺于垫了多层滤
纸的培养皿中置于光照培养箱中催芽.培养条件为 ,光照 16 h ,温度 25 ℃;黑夜8 h ,温度 20 ℃.
1.2.2　移栽　选取露白的种子移栽到土壤中 ,土壤组成:一般土/花土/沙土=3/1/1 ,每盆中土壤干重 0.4
kg.培养一段时间后间苗 ,保证每盆植株数目相同且生长一致 ,每隔4 d将盆栽换位 ,以使光照一致.
1.2.3　处理　自播种45 d后用硫酸铜毒液处理 ,野胡萝卜处理浓度梯度设为:0 、50 、300 、800 mg·kg-1
(以 Cu2+计),每个浓度设 3个重复.
1.3　实验方法
1.3.1　丙二醛(MDA)含量的测定　参照 Heath和 Parker[ 8]的硫代巴比妥(TBA)法测定MDA 含量:准确
第 28 卷第 3期
2006 年9 月
湖北大学学报(自然科学版)
Journal of Hubei University(Natural Science)
　Vol.28　No.3　
Sep., 2006
称取 0.2 g 左右鲜叶 ,用 2mL 的 10 %三氯乙酸将鲜叶研磨成匀浆 ,4 000 g离心 10min.取 2mL上清与 2
mL 的 0.6 %TBA混匀 ,沸水浴显色 15min ,迅速冷却后 4 000 g 离心 15min ,上清液用可见分光光度计测
定450 、532 、600 nm处光吸收值 ,计算MDA含量.
1.3.2　过氧化氢(H2O2)的测定　准确称取 0.4 g左右的样品 ,用 4mL 预冷的 pH6.8磷酸缓冲液在冰浴
下将鲜叶研磨成匀浆 ,4 ℃下 10 000 g 离心 20min ,2mL 上清加入 1mL的 0.1 %TiC14溶液振荡均匀 ,室温
下3 000 g 离心 15min ,取上清于 410 nm 波长下测定光吸收值 ,按公式计算 H2O2 的含量.
1.3.3　氧自由基含量的测定　根据植物生理学实验指导[ 9] ,准确称取 0.2 g叶片 ,用 2mL预冷的 pH7.8
的磷酸缓冲液研磨至匀浆 ,匀浆于 4 ℃下 10 000转离心 20 min收集上清.
(1)亚硝酸根标准曲线的制作:1mL 系列浓度的NaNO2(0 、5 、10 、15 、20 、30 、40和 50μmol/L)分别加入
1 mL对氨基苯磺和1mL α-萘胺 ,于 25 ℃中保温 20min ,然后测定 530 nm处的光吸收值 ,以[NO-2 ]和测
得的吸光度互为函数作图 ,制得亚硝酸根标准曲线.
(2)样品测定:0.5mL 样品提取液中加入 0.5mL 的 50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液 , 1mL 的 1mmol/L
盐酸羟胺 ,摇匀 ,于 25 ℃中保温1 h ,然后再加入1mL的 17mmol/L对氨基苯磺酸和1mL 的7mmol/L α-
萘胺 ,混合 ,于25 ℃中保温20min ,然后测定 530 nm处的光吸收值.根据测的光吸收值查标准曲线 ,换算
为[ NO-2 ] ,再按定量关系换算成氧自由基含量.
2　结果与分析
图 1　不同浓度下野胡萝卜两个
种群的 MDA积累量
图 2　不同浓度下野胡萝卜两个
种群的 H2O2 含量
2.1　MDA含量　图 1是两种野胡萝卜的MDA 含量 ,在不同
浓度的 CuSO4 处理 7 d 后 ,严西湖野胡萝卜的 MDA 含量随
CuSO4浓度升高而上升 ,由对照组的 7.16 nmol/g(FW)上升至
12.32 nmol/g(FW)(800mg/kg Cu2+处理下),高处理浓度下严
西湖野胡萝卜的 MDA 含量与对照组存在极显著差异(P <
0.01).铜绿山野胡萝卜MDA 含量随 CuSO4浓度变化的趋势
与严西湖野胡萝卜大不相同:对照组的 MDA 含量最高 , 为
10.81 nmol/g(FW),50mg/kg Cu2+处理下其MDA 含量下降至
8.99 nmol/g(FW),与对照组存在极显著差异(P <0.01),而
后MDA含量变化不明显 ,均与50mg/kg Cu2+处理下无显著差
异(P >0.05).在高浓度处理下 ,严西湖野胡萝卜的MDA含
量分别是铜绿山野胡萝卜的 1.22 倍(400 mg/kg Cu2+处理
下)、1.45倍(800mg/kg Cu2+处理下).
过量的重金属可以引发植物体内活性氧自由基大量生
成 ,引起过氧化反应.多不饱和脂肪酸对过氧化过程很敏感 ,
而脂质的过氧化会导致膜结构和功能的破坏[ 10] .MDA是脂质
过氧化产物之一 ,通常作为过氧化程度的测定指标.有研究证
明[ 11] ,过量的铜可引起植物体内 MDA 含量上升 ,且中毒程度与 MDA含量成正比.由实验结果可以看
出:非矿区海洲香薷的膜脂过氧化程度随铜处理浓度上升急剧升高 ,而矿区海洲香薷的膜脂过氧化程度
基本无变化.在较高浓度铜处理时 ,非矿区海洲香薷的膜脂过氧化程度远高于矿区海洲香薷 ,非矿区种
受到的由重金属铜引起的过氧化伤害明显比矿区种严重.
2.2　野胡萝卜的过氧化氢含量　图 2是两种野胡萝卜中 H2O2 含量随CuSO4处理浓度的变化 ,由图可以
看出 ,矿区和非矿区野胡萝卜的 H2O2 含量变化趋势明显不同.矿区种的 H2O2 含量在对照组最高 ,
100mg/kg Cu2+处理下迅速降至对照组的 46.76 %,而后变化趋于平稳 ,与 100mg/kg Cu2+处理相比均无
显著差异(P >0.05).非矿区野胡萝卜体内的H2O2含量在较低浓度处理下无明显变化 ,但在处理浓度
升高至 400mg/kg时开始显著上升 ,分别达到对照组的 1.29倍(400mg/kg Cu2+处理下)、1.69倍(800mg/kg
314 湖北大学学报(自然科学版) 第 28 卷
图 3　不同浓度下野胡萝卜两个种群氧自由基含量
Cu
2+处理下),与相同处理浓度下的矿区种相比明显偏
高 ,分别是其 2.06倍(400 mg/kg Cu2+处理下)、2.70 倍
(800 mg/kg Cu2+处理下).
2.3　野胡萝卜的氧自由基含量　图 3是两种野胡萝卜中
氧自由基含量 ,矿区种的氧自由基含量随处理浓度升高
而变化不大 ,即使在高处理浓度下(800 mg/kg Cu2+),其
自由基含量都与对照组无显著差异(P >0.05).而严西
湖野胡萝卜自由基含量先略降低后升高 ,且在各处理浓
度下均显著高于铜绿山野胡萝卜.
3　讨论
光合作用受重金属胁迫影响.当植物的光合作用受
到抑制时 ,便容易产生光抑制.光抑制是指光合机构所吸收的光能超出其利用的量时 ,过剩的光能造成
光合作用反应中心的功能下调 ,使反应中心失活 、破坏或降解 ,从而引起光能转化效率下降的现象.这
样 ,植物在光抑制过程中不能充分利用叶绿素所吸收的光能 ,O2 便在电子传递过程中 ,溢漏而形成活性
氧(O-2 ),进而通过各种反应产生 H2O2 以及 O-2 , ·OH等氧自由基 ,氧自由基是机体代谢过程中产生的重
要自由基 ,在生物体内具有很强的毒害作用 ,氧自由基可以攻击蛋白质的氨基酸残基 ,形成羰基衍生物 ,
另一方面 ,氧自由基可通过酶促反应歧化成 H2O2 和 O2 ,而 H2O2能够通过Haber Weiss反应产生更为活
跃 、更有毒性的 OH.导致膜脂过氧化[ 7] .
多不饱和脂肪酸对过氧化过程很敏感 ,而脂质的过氧化会导致膜结构和功能的破坏.MDA是脂质
过氧化的主要产物之一 ,能破坏蛋白质和酶的结构 ,也能引起叶绿体和过氧化物体中一些酶的活性下降
并抑制光合作用.MDA是生物膜系统脂质过氧化产物之一 ,其浓度表示过氧化程度和膜系统伤害程度 ,
所以是逆境生理指标.有研究证明 ,过量的铜可引起植物体内 MDA含量上升 ,且中毒程度与 MDA含量
成正比[ 12] .
通过对不同浓度铜处理下矿区与非矿区野胡萝卜体内丙二醛 、过氧化氢 、氧自由基含量的比较可以
看出:非矿区种的膜脂过氧化水平和体内自由基积累都要高于矿区种 ,说明非矿区种所受氧化胁迫比矿
区种严重 ,受重金属铜的毒害更强烈.在长期的适应过程中 ,矿区野胡萝卜已经成为了抗性生态型.
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The MDA accumulation in two Daucus carota L.populations under copper stress
WU Yan ,WAN Yong-hong ,XIE Ming-ji
(School of Life Science ,Hubei Universty ,Wuhan 430062 , China)
Abstract:Daucus carota L .is the most widely distributed copper-tolerant plant in the area along the middle
and lower streams of Yangtze River ,China.Choose two populations of Daucus carota L .(one from mining area ,
Tonglvshan;the other from normal soil ,Wuhan , all in Hubei province , China).The result showed that , Daucus
carota L.from normal soil accumulate more MDA compared with plant from mining area.It suggested that Daucus
carota L.from mining area has been evolved to copper tolerant ecotype.
Key words:Daucus carota L .;copper;malondialdehyde (MDA);oxygen-derived free radicals;hydrogen
peroxide(H2O2);tolerant ecotype
(责任编辑　游　俊)
(上接第 295页)
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Studies on interaction of calix[ 8] arene and protein
by spectral methods
CHEN Juan ,YAN Qiu-jun ,HE Yu ,SONG Gong-wu
(School of Chemistry and Material Science ,Hubei University ,Wuhan 430062 , China)
Abstract:The interactions of p -sulfonic sodium calix[ 8] arene and BSA were studied by the methods of fluo-
rescence and UV.The compositions and resultant constants of the BSA-Calix[ 8] arene system were determined by
fluorescence method.Calix[ 8] arene can quench the fluorescence intensity of BSA by static quenching style.The op-
timum reaction conditions and the way of interaction between Calix[ 8] arene and BSA were discussed.
Keywords:BSA(bovine serum albumin);p-sulfonated sodium of calix[ 8] arene;calixarene;fluorescence
method
(责任编辑　游　俊)
316 湖北大学学报(自然科学版) 第 28 卷