全 文 ：收稿日期:2013-09-09; 修订日期:2013-12-18
基金项目:国家自然科学基金( No． 21272136; 31270389) ;
湖北省教育厅自然科学研究项目( No． D20121301)
作者简介:曾 文( 1988-) ，男( 汉族) ，湖北麻城人，三峡大学化学与生命
科学学院在读硕士研究生，主要从事植物与微生物天然产物研究工作．
* 通讯作者简介:刘士平( 1974-) ，男( 汉族) ，湖北天门人，三峡大学化学
与生命科学学院副教授，博士学位，主要从事植物与微生物天然产物研究
工作．
吉祥草中 5 种提取物对神经细胞的抗氧化活性研究
曾 文，毕玉婷，孔玉珊，薛艳红，刘士平*
(天然产物研究与利用湖北省重点实验室，三峡大学化学与生命科学学院，湖北 宜昌 443002)
摘要:目的 明确吉祥草中的 5 种提取物对神经细胞的抗氧化作用功效。方法 经过提取分离、结构鉴定后，建立了 H2O2
所致人神经母细胞瘤株 SH － SY5Y细胞系氧化应激损伤模型，应用 MTT法探讨了 ＲC － 1、ＲC － 2、ＲC － 3、ＲC － 4 和 ＲC
－5 的细胞毒性及抗氧化保护作用。结果 ＲC － 1、ＲC － 2、ＲC － 3、ＲC － 4 均表现出一定的的抗氧化活性，在 10μg /ml时，
ＲC － 2、ＲC － 3 和 ＲC － 4 分别比模型组的存活率高 42． 8%、42． 9%和 47． 9%。结论 吉祥草及其提取物可以作为一种潜
在的抗神经退行性疾病药物进行开发和利用。
关键词:吉祥草; H2O2 ; SH － SY5Y细胞; 抗氧化活性
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 07． 005
中图分类号:Ｒ961; Ｒ946． 8 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 07-1549-02
Antioxidant Activity of Five Extracts from Ｒeineckea carnea to SH － SY5Y cells
ZENG Wen，BI Yu-ting，KONG Yu-shan，XUE Yan-hong，LIU Shi-ping*
( Hubei Key Laboratory of Natural Products Ｒesearch and Development，College of Chemistry and Life Science，
Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002，China)
Abstract: Objective To make clear the antioxidant effect of 5 extracts from Ｒeineckea carnea to nervecells． Methods After ex-
traction and purification，5 compounds named ＲC － 1 to ＲC － 5 were structurally identified． H2O2 oxidative damage model to hu-
man neuroblastoma strains SH － SY5Y cells was established，and then the cell toxicity and the protective effects under oxidative
stress were evaluated by MTT method． Ｒesults ＲC － 1，ＲC － 2，ＲC － 3，ＲC － 4 all show a certain antioxidant activity，the survival
rate of ＲC － 2，the ＲC － 3 and ＲC － 4 is respectively 42． 8%，42． 9% and 47． 9% higher than the model group． Conclusion Ｒei-
neckea carnea and its extracts can be developed as a potential drug for neurodegenerative diseases．
Key words: Ｒeineckea carnea; H2O2 ; SH － SY5Y cells; Antioxidant activity
吉祥草 Ｒeineckea carnea 又名观音草，是百合科吉祥草属的
一种多年生长绿草本植物，主要分布在我国长江以南，其中以西
南地区最为常见［1］。作为苗族百姓的地方药材，吉祥草具有多
年的应用历史［2］。据《本草纲目》、《全国中草药汇编》等记载，吉
祥草有润肺止咳、清热利湿之效，可用于肺结核、咳嗽咯血、慢性
支气管炎、哮喘等呼吸道疾病的治疗［3］。现代医学证明吉祥草
还可用于治疗风湿性关节炎、跌打损伤、骨折等。为进一步研究
吉祥草的药理活性，探明吉祥草对神经细胞的抗氧化保护作用，
本实验室从其全草中提取分离了 5 个单体化合物，将这些化合物
进行结构鉴定后，探讨了这些物质在神经元氧化损伤中的保护作
用，结果表明部分提取物对神经细胞具有较好的抗氧化保护能
力，可作为治疗神经退行性疾病(如帕金森症，阿尔茨海默病和
亨廷顿氏病等)药物的潜能，从而为新型神经退行性疾病药物的
开发和设计提供参考。
1 材料
1． 1 材料 吉祥草根茎采自湖北省长阳土家族自治县乐园，经三
峡大学化学与生命科学学院陈发菊教授鉴定为 Ｒeineckea carnea，
植物标本现保存于三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实
验室。人神经母细胞瘤细胞 SH － SY5Y 由华中科技大学同济医
学院实验动物中心惠赠。
1． 2 药品和仪器 实验中使用的药品和试剂有:胰蛋白酶(美国
GIBCO公司)，四氮唑蓝(MTT)(美国 AMＲESCO 公司)，新生小
牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，过氧化氢(H2O2，分析
纯，国药集团)，LDH、SOD、GSH 检测试剂盒(上海宝曼生物公
司)。其中 D － MEM/F － 12 完全培养基内含 2． 2 mg /ml NaH-
CO3，100 U /ml 青霉素，100μg /ml 链霉素，15% 新生小牛血清。
基础培养基将新生小牛血清降为 3%。所用的仪器有酶联免疫
检测仪(Genios Tecan);CO2 培养箱(日本三洋公司)，LD4 － 2A
离心机(北京医用离心机厂)，XDS － 1B倒置显微镜(重庆光学仪
器厂)和 96 孔板(美国 Corning公司)。
2 方法
2． 1 吉祥草 5 种化合物的分离与鉴定 取吉祥草全草于 48 ℃恒
温烘箱中干燥，中药粉碎机粉碎后过 60 目筛，用 95%乙醇浸泡
数小时后，反复多次回流提取，减压浓缩提取液(温度为 55 ℃)
得到棕色浸膏，将浸膏置于通风橱内冷冻干燥至无醇味，得到吉
祥草乙醇提取物。加适量水混悬至完全溶解，依次用石油醚、乙
酸乙酯和正丁醇萃取，每次加入 2 L萃取液与水混匀，超声萃取 2
h待两相分层后利用虹吸法吸出上层萃取液，在旋转蒸发仪上浓
缩并回收萃取液，合并每一种萃取溶剂的萃取物于通风橱中挥干
溶剂，将各萃取部分先通过大孔吸附树脂对正丁醇部位的糖类、
色素及盐类等杂质进行除杂，再采用凝胶色谱除去皂苷成分中残
留的色素成分，然后过反复硅胶柱色谱、高效液相色谱等进行精
制分离后，经硅胶薄层色谱和核磁共振确定其结构。
2． 2 细胞培养及 H2O2 损伤模型的建立 SH － SY5Y细胞用 D －
MEM/F － 12 完全培养基于 37 ℃、5% CO2 饱和湿度孵箱中培养。
待细胞 80% ～ 90% 铺满瓶底时进行传代、转板，贴壁细胞用
0． 25%的胰蛋白酶进行消化，传代按 1 ∶ 3 比例进行。采用 800
μmol /L的 H2O2 建立细胞损伤模型，具体方法参照作者研究
［4］
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 7 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 7 期
进行。
2． 3 提取物对神经细胞毒性检测 取对数生长期的 SH － SY5Y
细胞以 1 × 105 个 /ml的浓度接种于 96 孔板，100 μl /孔，培养 24
h贴壁后弃去旧培养基，分别加入浓度为 1 μg /L 和 10 μg /L的 5
种药物(含 3%血清的培养基配制)，同时设空白对照组，每组设
5 次重复，继续培养 24 h，MTT比色法在 492 nm处检测吸光值并
计算细胞存活率［5 ～ 7］［存活率(%)=处理组 OD 值 /空白组 OD
值 × 100%］。
2． 4 提取物对神经细胞抗氧化保护活性及量效关系分析 根据
毒性实验结果，选取 1 μg /L 和 10 μg /L 的 5 种药物浓度进行初
筛。弃去旧培养基后，模型组及给药组加入浓度为 700 μmol /L
的双氧水(无血清培养基配制)，培养 12 h后用 MTT比色法检测
细胞存活率。
2． 5 统计学处理 实验数据以 珋x ± s表示，采用 SPSS13． 0 进行统
计分析。
3 结果
3． 1 5 种提取物的结构鉴定 分离纯化后的 5 种样品均呈白色
粉末状，经结构鉴定和波谱分析，ＲC － 1 和 ＲC － 2 为核苷，ＲC －
3、ＲC － 4 和 ＲC － 5 为甾体化合物(见表 1)。
表 1 5 种化合物的结构与表征
编号 化学结构式 理化性质 编号 化学结构式 理化性质
ＲC －1
白色粉末 C10H13N5O4，
波谱数据与腺嘌
呤核苷一致［8］
ＲC －3 白色粉末
，分子式 C39H66O15，
甾体双糖皂苷［9］
ＲC －2
白色粉末 C10H13N5O3，
波谱数据与腺嘌呤
脱氧核苷一致［8］
ＲC －4 白色粉末，为甾体化合物［9］
ＲC －5 白色粉末，为甾体化合物［9］
3． 2 种化合物对神经母瘤细胞生长的影响 为明确这 5 种化合
物对神经细胞的生长是否具有毒害作用，并寻找到合适的药物浓
度范围，试验中我们考察了不同浓度的单体对 SH － SY5Y细胞存
活率的影响。结果显示(表 2)不同吉祥草单体化合物对神经细
胞的存活率效果有所差异，其中 ＲC － 2 的毒性作用最明显，在
1μg /ml时，存活率有 84． 09%;当达到 10μg /ml 时，存活率只有
66． 64%，说明其对细胞的毒性作用随着浓度的增加而增强。
表 2 5 种提取物对 SH － SY5Y细胞生长的影响
类别 浓度 /μg·L －1 OD492 相对存活率(%)
空白 0 0． 7625 ± 0． 0391 100 ± 2． 79
ＲC －1 1 0． 7068 ± 0． 0264 97． 73 ± 1． 46
10 0． 6232 ± 0． 0337* 81． 74 ± 2． 58*
ＲC －2 1 0． 6412 ± 0． 0289* 84． 09 ± 1． 93*
10 0． 5081 ± 0． 0413＊＊ 66． 64 ± 5． 65＊＊
ＲC －3 1 0． 7787 ± 0． 0254 102． 12 ± 2． 21
10 0． 7034 ± 0． 0520 92． 25 ± 6． 71
ＲC －4 1 0． 6975 ± 0． 0258 91． 48 ± 1． 70
10 0． 6952 ± 0． 0296 90． 81 ± 1． 88
ＲC －5 1 0． 7158 ± 0． 0334 93． 87 ± 2． 72
10 0． 7233 ± 0． 0195 94． 86 ± 1． 03
与空白组比较，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01，n =5
3． 3 种提取物的抗氧化能力分析 在建立了 800 μmol /L双氧水
氧化胁迫模型的基础上，我们分析了这 5 种提取物对人神经母细
胞瘤细胞 SH － SY5Y的抗氧化活性分析。MTT 比色法实验结果
显示 ＲC － 1、ＲC － 2、ＲC － 3、ＲC － 4 均显示出一定的保护作用，可
一定程度上保护细胞免于遭到双氧水的氧化损伤。在低浓度
(1μg /ml)时，ＲC － 1 显示出一定的保护效果;而在 10μg /ml 时，
ＲC － 2、ＲC － 3 和 ＲC － 4 的效果非常明显，分别比模型组高
42． 8%、42． 9%和 47． 9%。见图 1。
与模型组比较，* P ＜ 0． 05;＊＊P ＜ 0． 01，n = 5
图 1 5 种提取物对 SH － SY5Y细胞的抗氧化保护作用
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 7 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 7
4 讨论
活性氧对细胞的损伤是造成许多退化性神经系统疾病的一
种重要诱因，而合适的抗氧化剂可以保护神经元免受氧化损伤，
是防治该类疾病的有效途径［10］。本文探讨了从吉祥草中分离的
5 个单体化合物对神经母瘤细胞 SH － SY5Y 的抗氧化保护活性，
结果表明在 1 ～ 10 μg /ml浓度范围内显示出一定的抗氧化活性，
因此为神经退行性疾病的药物设计提供了一定的参考价值。但
是由于药物介导的神经细胞的抗氧化作用，其机制复杂多样，如
细胞膜的损坏程度，相关抗氧化酶系含量的变化等，其详细机理
还有待进一步研究。
参考文献:
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收稿日期:2013-08-27; 修订日期:2013-12-17
基金项目:国家自然科学基金( No． 20972168) ;
云南省中青年学术技术带头人后备人才项目( No． 2010CI048)
作者简介:张玉梅( 1973-) ，女( 汉族) ，四川南充人，西双版纳热带植物园
副研究员，硕士研究生导师，博士学位，主要从事天然药物化学研究工作．
马兰的化学成分研究
张玉梅1，宋启示1，冯 峰1，2
(1．中国科学院西双版纳热带植物园，热带植物资源可持续利用重点实验室，云南 昆明 650223;
2．昆明理工大学，云南 昆明 650500)
摘要:目的 研究马兰全草中的化学成分。方法 采用工业甲醇提取，硅胶柱、反向 C － 18 柱及凝胶柱等柱层析方法从马
兰全草中分离化学成分，并通过 MS和 NMＲ等波谱学方法进行结构鉴定。结果 分离得到 4 个化合物，分别为 ascleposide
E( 1) 、pimar － 15( 16) － β － ene － 8β，11α，20 － triol － 7 － O － β － D － glucopyranoside( 2) 、4＇－ O －芦 acetylsinapylangelate( 3)
和( 3β，5α，22E，24S) － campesta － 7，22 － dien － 3 － O －芦 β － D － glucopyranoside ( 4) 。结论 此 4 个化合物均为在该植物
中首次分离得到，且它们在体外人肿瘤细胞株 A549、BGC － 823 和 Hela上均不显示细胞毒活性。
关键词:马兰; 化学成分; 细胞毒活性
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 07． 006
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 07-1551-02
马兰为菊科马兰属植物马兰 Kalimeris indica (L．)Sch． －
Bip．的全草，具有清热解毒以、消食积、利小便、散瘀止血的功效，
民间也将其幼苗当做野菜食用，俗称“马兰头”［1］。现代药理则
证明其具有抗菌、抑制血小板活化因子以及保肝等作用［2 ～ 4］。由
于马兰在我国南方大部分地区均有分布，前人主要对采自贵阳、
杭州及合肥等地的马兰进行过一些化学成分研究，其化学成分主
要有三萜、甾醇、酚类、甘油酯、烷烃和烷醇等［3 ～ 9］。为了进一步
明确马兰的化学成分和药效物质基础，我们对采自云南昆明的马
兰进行了进一步的化学成分研究工作，从其全草的甲醇提取物中
首次分离得到了 ascleposide E (1)、pimar － 15(16)－ β － ene －
8β，11α，20 － triol － 7 － O － β － D － glucopyranoside (2)、4＇ － O －
acetylsinapylangelate (3)和(3β，5α，22E，24S)－ campesta － 7，22 －
dien － 3 － O － β － D － glucopyranoside (4)等 4 个化合物，并对其
进行了体外抗肿瘤细胞毒活性测试。
1 仪器与材料
MS用液相离子阱色谱质谱联用仪 BＲUKEＲ HCT /ESQUIＲE
测定。NMＲ用 Bruker AM －400 和 Bruker DＲX － 500 超导核磁共
振仪测定，TMS 为内标。凝胶 Sephadex LH － 20 为瑞士 Pharmacia
公司生产，柱层析硅胶为青岛化工厂生产，ＲP － C18 柱层析材料
为德国 Merck 公司生产。TCL薄层板为青岛化工工厂生产，显色
方法为 254，365 nm荧光，8% 硫酸乙醇溶液显色。
马兰全草采自云南昆明，经中国科学院昆明植物所李荣博士
鉴定为马兰 Kalimeris indica (L．)Sch． － Bip．，标本保存于中国
科学院西双版纳热带植物园民族药研究组。
2 方法与结果
2． 1 提取分离 马兰全草 5． 5kg，晾干粉碎后用工业甲醇 15L 冷
浸提取 3 次，6 天 /次，合并减压回收甲醇得浸膏 224 g。浸膏加热
水溶解，再分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压蒸馏得到
石油醚(45 g)、乙酸乙酯(63 g)、正丁醇(50)和水部分(66g)。将
石油醚部分(45 g)通过硅胶柱(200 ～ 300 目)，用石油醚 /丙酮(0
∶ 1 ～ 1∶ 0)梯度洗脱，得到 8 个流分(Fr1 ～ Fr8)。Fr3 通过硅胶
柱(SiO2，石油醚 /丙酮 = 3 ∶ 1)反复柱层析，得到化合物 3(320
mg)。乙酸乙酯部分(63 g)通过硅胶柱(20 ～ 300 目)，用氯仿 /甲
醇(1∶ 0 ～ 0∶ 1)梯度洗脱，得到 6 个流分(FrA ～ FrF)。FrD经反
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 7 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 7 期