全 文 ：研究与探讨
2013年第18期
Vol . 34 , No . 18 , 2013
茶枝柑皮多糖对PC12细胞氧化损伤的
保护作用
张小英1，周 林1，黄庆华1，*，游明霞2，周子雄1，源瀚祺1
（1．广东药学院，广东广州 510006；
2．广东汤臣倍健生物科技股份有限公司，广东珠海 519040）
摘 要：目的：研究茶枝柑皮多糖对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用。方法：MTT法检测细胞存活率，建立
H2O2诱导PC12细胞氧化损伤模型。比色法测定细胞内丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽过氧
化物酶（GSH-Px）的活性。结果：100μmol/L H2O2诱导PC12细胞4h，细胞呈现明显损伤形态，细胞内MDA含量升高，SOD
和GSH-Px活性降低。茶枝柑皮多糖可明显改善PC12细胞损伤，显著降低细胞MDA含量，极显著提高SOD和GSH-Px活
性。结论：茶枝柑皮多糖对H2O2诱导PC12细胞损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与提高PC12细胞的抗氧化
酶活性有关。
关键词：茶枝柑皮多糖，抗氧化，PC12细胞，H2O2
Study on antioxidant effect of polysaccharide from
Citrus reticulata ‘Chachi’ Peel
ZHANG Xiao-ying1，ZHOU Lin1，HUANG Qing-hua1，*，YOU Ming-xia2，ZHOU Zi-xiong1，YUAN Han-qi1
（1.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangzhou 510006，China；
2.Guangdong By-Health Biotechnology Co.，Ltd.，Zhuhai，Zhuhai 519040，China）
Abstract：Objective：To study the protective effect of polysaccharide from Citrus reticulata ‘Chachi’ Peel on
H2O2-induced oxidative injury in PC12 cells. Methods：Cell viability was assayed by MTT method，the toxicity
model was established by treating PC12 cells with H2O2. The level of MDA，SOD and GSH-Px were measured
by spectroscopy，respectively. Results：After being exposed to 100μmol/L H2O2 for 4 hours，typical morphological
characteristics of injury were observed. The level of MDA increased significantly，while that of SOD and GSH-
Px decreased significantly in H2O2-induced group compared with that of the sham group. Polysaccharide from
Citrus reticulata ‘Chachi’ Peel could decrease MDA content and increase SOD and GSH-Px activity significantly.
Conclusions：Polysaccharide from Citrus reticulata ‘Chachi’ Peel had protective effect on PC12 cells injury
induced by H2O2 in culture. The protective effect might be related to the increased activity of antioxidant
enzymes.
Key words：polysaccharide from Citrus reticulata ‘Chachi’ Peel；antioxidant activity；PC12 cells；H2O2
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2013）18-0099-04
收稿日期：2013－04－01 * 通讯联系人
作者简介：张小英（1988-），女，硕士研究生，研究方向：保健食品开发
与研究。
基金项目：珠海市科技工贸和信息化局企业技术创新项目（珠经贸字
（2009）414号）。
陈皮为芸香科橘（Citrus reticulata Blanco）及其
栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾、燥湿化痰
之功效，其主要成分有黄酮类化合物、挥发油和果胶
多糖等 [1]。其中广东新会茶枝柑（Citrus reticulata
‘Chachi’）的成熟干燥果皮，是广东道地药材“广陈
皮”的来源[2]。莫云燕等曾对陈皮多糖体外抗氧化活
性进行研究，发现陈皮多糖体外能显著清除羟自由
基、DPPH自由基和还原Fe3+[3]。H2O2是一种常用的细
胞氧化应激诱导剂，广泛用于诱导细胞建立氧化应
激模型[4]。PC12细胞株即大鼠嗜铬细胞瘤的细胞克
隆，是目前广泛用来研究神经细胞功能、分化和死亡
的一种组织细胞培养模型[5]。本文采用H2O2诱导PC12
细胞氧化损伤建立模型，考察不同分子量的茶枝柑
皮多糖对PC12细胞氧化损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
PC12大鼠嗜铬瘤细胞株 上海细胞库；茶枝柑
皮提取物 [2] 本实验室自制；DEAE-Sepharose Fast
Flow填料、Sephadex G-100填料 美国GE公司；葡聚
糖标准品系列（Dextran Standard Mw5200~1482000u）、
胰蛋白酶 Sigma公司；DMEM（高糖培养液）、新生胎
牛血清 Hyclone公司；细胞培养板 Costar公司；丙
99
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.18.005
Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
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二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧
化物酶（GSH-Px）活力测定试剂盒 南京建成生物
工程研究所；其他试剂 均为分析纯。
GLZ-0.2B冷冻干燥机 上海浦东冷冻干燥设备
有限公司；凝胶渗透色谱（GPC）系统（Waters 1525
Binary HPLC Pump、Waters 717自动进样器、Waters
2414示差检测器） 美国Waters公司；R-201旋转蒸
发仪 巩义予华仪器公司；HL-2B恒流泵、BSZ-100
自动部分收集器、中低压层析柱2.5cm×60cm、中低压
层析柱1.5cm×100cm 上海沪西分析仪器厂；Bio-
Tek ELX800光吸收酶标仪 美国宝特公司；CO2培养
箱 SANYO公司；CKX41倒置显微镜 OLYMPUS公
司；超净工作台 苏净集团安泰公司；TD3台式低速离
心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV-2100
型分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；BS210S
电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司。
1.2 茶枝柑皮多糖的制备
称取提取物200g，加入2000mL蒸馏水，80℃水浴
提取3h，分别提取3次，提取液抽滤合并，浓缩至
100mL左右。往浓缩液中加入乙醇使其乙醇体积分
数达到50%，4℃冰箱中静置保存12h，减压抽滤，收集
沉淀并冷冻干燥，得50%乙醇沉淀[6]。依次将上清液
调节乙醇体积分数为70%和90%，抽滤并将醇沉物收
集冷冻干燥，最后得出3个分步醇沉多糖，根据乙醇
的体积分数分别命名为CCP50、CCP70和CCP90，用
于PC12细胞抗氧化活性实验。
将分步醇沉所得多糖CCP50、CCP70和CCP90分
别通过DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100
柱层析纯化，收集洗脱液、浓缩并冷冻干燥，再分别
通过凝胶渗透色谱测定分子量 [7]。从而得到多糖
CCP50、CCP70和CCP90的重均分子量MW分别为
72059、47433、18743u。
1.3 细胞培养
PC12细胞按常规培养于含10%胎牛血清及1%
抗生素（青霉素100U/mL，链霉素100U/mL）的DMEM
培养基中，置于5% CO2饱和湿度、37℃培养箱内培
养。根据细胞生长情况，贴壁约80%时用0.25%的胰
蛋白酶消化传代。
1.4 H2O2诱导PC12细胞损伤模型的建立
将生长良好的PC12细胞制成细胞悬液，按1×105
个/mL接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5% CO2培
养至细胞贴壁约80%。吸弃培养基，随机分为：正常
组、H2O2组，每组10个复孔。正常组：细胞不做任何处
理正常培养4h；H2O2组：分别加入不同浓度的H2O2培
养液处理4h[8]。
1.5 茶枝柑皮多糖最佳保护浓度的筛选
取对数生长期的PC12细胞，按1×105个/mL接种
于96孔细胞培养板中，于37℃、5% CO2培养至细胞贴
壁约80%。吸弃培养基，随机分为：正常组、模型组、
多糖组，每组6个复孔。正常组：细胞不做任何处理正
常培养；模型组：细胞正常培养24h后加入100μmol/L
的H2O2处理4h；多糖组：分别加入不同浓度的3种多
糖培养24h后加入100μmol/L的H2O2处理4h。
1.6 细胞存活率检测
细胞存活率检测：MTT法。细胞分组处理培养结
束后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h后
吸弃上清液，每孔中加入100μL的DMSO以溶解紫色
结晶，检测波长570nm。漩涡振荡数次，在倒置显微镜
下观察直到紫色结晶全部溶解，以空白对照孔为调
零孔，全自动酶标仪测定570nm波长处每孔的吸光度
值。计算细胞存活率[9]。
细胞存活率（%）＝实验组OD值/正常组OD值×100
1.7 抗氧化指标的测定
取对数生长期的PC12细胞，按1×106个/mL接种
于6孔细胞培养板中，于37℃、5% CO2培养至细胞贴
壁约80%。吸弃培养基。随机分成：正常组、模型组、
多糖组，每组6个复孔。正常组：细胞不做任何处理正
常培养；模型组：细胞正常培养24h后加入100μmol/L
的H2O2处理4h；多糖组：分别加入不同浓度的3种多
糖培养24h后加入100μmol/L的H2O2处理4h。参照试
剂盒说明书测定细胞内GSH-Px、SOD活性和MDA
含量[10]。
1.8 统计分析
采用SPSS 20.0统计软件进行统计，差异显著性
检验采用独立样本t检验和单因素方差分析（One Way
ANOVA，LSD）。所有数值以平均值±标准误（x±s）
表示。
2 结果与分析
2.1 H2O2浓度的选择
结果如图1所示，采用H2O2处理PC12细胞4h，会
导致细胞存活率显著下降，并与H2O2呈剂量依赖性。
100μmol/L时细胞存活率为58.0%±2.04%（n=10），即
PC12细胞受到一定程度的损伤，但还没达到不可逆
转的状态，故选择100μmol/L H2O2作用4h来建立
PC12细胞氧化损伤模型。
2.2 茶枝柑皮多糖最佳保护浓度的筛选
采用MTT法测定细胞存活率确定最佳给药浓
度。由图2可知，在0～640μg/mL范围内，低浓度多糖
对PC12细胞均有保护作用，但是高浓度的多糖反而
有抑制作用。其中，3种多糖的最佳保护浓度均为
160μg/mL。
图3结果表明，160μg/mL的三种多糖对PC12细
图1 不同浓度H2O2对PC12细胞增殖的影响（n=10）
Fig.1 Effect of H2O2 on proliferation of PC12 cells（n=10）
注：**，与空白组相比差异极显著，p＜0.01。
正常 50 100 200 400 800
120
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
（
%）
H2O2浓度（μmol/L）
**
**
** ** **
100
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组别 MDA（nmol/mg protein） SOD（U/mg protein） GSH-Px（U/mg protein）
正常对照组 4.86±0.13 117.03±0.17 320.69±0.86
H2O2模型组 16.08±0.59Δ 95.84±0.98Δ 270.46±1.04Δ
CCP50 10.06±0.82** 113.91±1.68** 289.37±0.98**
CCP70 11.63±0.83** 110.25±0.88** 285.42±1.03**
CCP90 13.75±0.94* 109.34±0.81** 280.87±0.87**
表1 茶枝柑皮多糖对SOD和GSH-Px活性以及MDA含量影响（n=6）
Table 1 Effect of polysaccharide from Citrus reticulata‘Chachi’Peel on the activities of SOD，GSH-Px and MDA of PC12 cell（n=6）
图2 茶枝柑皮多糖最佳保护浓度的筛选（n=6）
Fig.2 Screening of best protective concentration of
polysaccharide from Citrus reticulata‘Chachi’Peel（n=6）
0 100 200 300 400 500 600 700
100
80
60
40
细
胞
存
活
率
（
%）
茶枝柑皮多糖质量浓度（μg/mL）
CCP50 CCP70 CCP90
图3 茶枝柑皮多糖最佳保护浓度的筛选（n=6）
Fig.3 Screening of best protective concentration of
polysaccharide from Citrus reticulata‘Chachi’Peel（n=6）
注：与正常组相比，△：p＜0.01；与模型组相比，*：p＜0.05，
**：p＜0.01；表1同。
CCP50 CCP70 CCP90
100
80
60
40
20
0
细
胞
存
活
率
（
%）
茶枝柑皮多糖种类
正常组
160μg/mL
模型组
320μg/mL
40μg/mL
640μg/mL
80μg/mL
*
△
△ △**
**
**
**
****
*****
* *
* *
*
胞的氧化损伤均有极显著的保护作用。综合考虑细
胞存活率，确定3种多糖的最佳保护浓度是160μg/mL。
2.3 抗氧化指标的测定结果
表1的数据显示，模型组与正常组相比，MDA水
平极显著升高；SOD和GSH-Px活力极显著降低。3种
多糖组与模型组相比，MDA水平：CCP90组显著降
低，而CCP50组和CCP70组极显著降低；SOD和GSH-
Px活力均极显著升高。除此之外，随着多糖重均分子
量的增大（CCP90→CCP70→CCP50），抗氧化作用越
明显。
3 讨论与结论
H2O2损伤模型操作简单，容易控制，被广泛用于
体外实验模拟细胞的氧化损伤[11-12]。MTT法能快速准
确地测定细胞的增殖率，是国际惯用的评价细胞存
活与损伤的监测指标[13-14]。机体内存在大量具有清除
自由基功能的抗氧化酶系，在抵抗细胞和组织氧化
损伤方面发挥着重要的作用[15]。
本实验选用H2O2诱导PC12细胞氧化损伤，通过
MTT法检测细胞存活率，建立PC12细胞氧化损伤模
型，在此基础上研究不同分子量茶枝柑皮多糖对
PC12细胞氧化损伤的保护作用及其可能机制。结果
表明：100μmol/L的H2O2作用4h可显著抑制PC12细胞
增殖，因此选择100μmol/L H2O2作用4h来建立PC12
细胞氧化损伤模型。抗氧化指标测定结果显示，模型
组的SOD和GSH-Px活性极显著下降，MDA水平极显
著升高。而3种茶枝柑皮多糖处理后各组的抗氧化酶
活性均有所提高，MDA水平均降低，并且随着多糖分
子量增大作用越显著。
综上所述，茶枝柑皮多糖具有较强的抗氧化活
性，对H2O2诱导的PC12细胞的氧化损伤具有明显的
保护作用。其作用机制可能与提高SOD和GSH-Px活
性，降低MDA水平，减少氧化应激对神经细胞的损
伤，保持细胞的完整性，从而发挥抗氧化作用有关。
另外，据有关文献报道[16]，多糖的抗氧化作用与其分
子量大小有关。因此，茶枝柑皮多糖的抗氧化作用与
多糖分子量的关系尚需进一步研究。
参考文献
[1] 陈思，黄庆华，谢燕钿，等. 陈皮多糖脱色工艺优化[J]. 安徽
农业科学，2010，38（34）：19364-19366.
[2] 莫云燕，黄庆华，游明霞. 多抗氧化指标响应面法优化茶枝
柑皮提取工艺[J]. 食品工业科技，2012，33（15）：215-219.
[3] 莫云燕，黄庆华，殷光玲，等. 新会陈皮多糖体外抗氧化作
用及总糖含量测定[J]. 今日药学，2009，19（20）：22-25.
[4] 温旭敏，魏涛，白利萍，等. 川芎嗪对H2O2诱导PC12细胞凋
亡的保护作用研究[J]. 中国药物与临床，2013，13（1）：25-27.
[5] 蔡卫斌，张百芳，汪炳华，等. 银杏内酯B对H2O2诱导 PC12
细胞氧化损伤的影响[J]. 武汉大学学报，2002，23（1）：14-16.
[6] 耿安静，陈健. 香菇精多糖乙醇沉淀规律的研究[J]. 食品科
学，2010，31（4）：99-102.
[7] 郑必胜，唐芳勇，何禄英，等. 凝胶渗透色谱法表征广东虫
草多糖柱层析分离纯化效果的研究[J]. 食品科技，2009，34（5）：
298-303.
[8] Scolastici C，Alves de Lima R O，Barbisan L F，et al.
Antigenotoxicity and antimutagenicity of lycopene in HepG2 cell
line evaluated by the comet assay and micronucleus test [J].
Toxicology in Vitro，2008，22：510-514.
[9] Piga R，Natito Y，Kokura S，et al. Protective effect of
（下转第105页）
101
研究与探讨
2013年第18期
Vol . 34 , No . 18 , 2013
serotonin derivatives on glucose-induced damage in PC12 rat
pheochromocytoma cells[J]. British Journal of Nutrition，2010，103
（1）：25-31.
[10] 张慧芸，申云翔，任国艳. 丁香多酚细胞抗氧化活性的研
究[J]. 食品工业科技，2012，33（19）：147-149.
[11] Li W G，Francis J，Miller J，et al. H2O2-induced superoxide
anion production by a non-phagocytic NAD（P）H oxidase cause
oxidant injury[J]. J Biol Chem，2001，276（31）：29251-29256.
[12] Chai X Y，Li F F，Bai C C，et al. Three new acylated
glycosides from the stems of Casearia velutina and their protective
effect against H2O2-induced in paiment in PC12 cell[J]. Planta
Med，2010，76（1）：91-93.
[13] 李磊，杨雨晗，王双，等. 细胞活性检测方法之比较[J]. 生
物学杂志，2011，28（1）：87-90.
[14] 范英兰，任欢欢，韩东宁，等. 乳源β-酪啡肽-5对C2C12细
胞的抗氧化损伤作用[J]. 食品科学，2011，32（9）：257-260.
[15] 杨静秋. 抗氧化乳酸菌的筛选及其对氧化损伤的CT-26细
胞的保护作用[D]. 无锡：江南大学，2009.
[16] 鲍素华，查学强，郝杰，等. 不同分子量铁皮石斛多糖体外
抗氧化活性研究[J]. 食品科学，2009，30（21）：123-127.
图8 提取物对猪油AV的抑制
Fig.8 Inhibition rate of POV by different extracts from
Parthenocissus himalayana to lard
60
50
40
30
20
10
0
6 10 14
TBHQ
乙酸乙酯
75%乙醇
VC
蒸馏水
抑
制
率
（
%）
处理时间（d）
但接近或高于VC，对菜籽油AV的抑制效应强于猪
油。在相同条件下，爬山虎叶片不同溶剂粗提物对菜
籽油和猪油AV的抑制能力为：乙酸乙酯＞75%乙醇＞
蒸馏水。从对高温强制贮存过程中油脂POV和AV的
变化规律比较可见，爬山虎叶片不同溶剂提取物对
菜籽油和猪油POV的抑制能力都普遍强于AV，表明
它们在抑制油脂初级氧化中的效应可能更强一些。
3 结论
3.1 对油脂贮存过程中POV和AV动态变化的检测
结果表明，爬山虎叶片3种不同溶剂粗提物对菜籽油
和猪油均具有较强的抗氧化作用，对菜籽油的抗氧
化效应强于猪油。在添加量均为0.02%的条件下，除
水提取物外，乙酸乙酯和75%乙醇提取物对猪油和
菜籽油的抗氧化能力虽都弱于TBHQ但强于VC，如果
粗提物中的抗氧化有效成分进一步分离纯化，将会
较大幅度提高其抗氧化能力。
3.2 爬山虎叶片不同溶剂粗提物的抗氧化效应存
在一定差异，对菜籽油和猪油的抗氧化能力均为乙
酸乙酯＞75%乙醇＞蒸馏水，其中乙酸乙酯提取物抗
氧化能力最强，水提取物较差，这可能与溶剂及抗氧
化有效成分的理化性质相关。
3.3 爬山虎叶片不同溶剂提取物对菜籽油和猪油
POV的抑制率均高于AV，表明它们在抑制油脂初级
氧化、阻止过氧化物形成方面的效应可能更强一些。
参考文献
[1] 凌关庭. 抗氧化食品与健康[M]. 北京：化学工业出版社，
2004.
[2] 田云，卢向阳，易克，等. 天然植物抗氧化剂研究进展[J]. 中
草药，2005，36（3）：468-470.
[3] 刘品华，杨光红，田雪莲，等. 小黑药抗油脂氧化及抑菌效
果研究[J]. 食品工业科技，2011，32（10）：187-189.
[4] 张毅功，陆诗雷，孙振元，等. 爬山虎属植物利用研究[J]. 资
源科学，2005，27（5）：141-145.
[5] 李倩，李娜，巩江. 爬山虎属植物药学研究进展[J]. 安徽农
业科学，2011，39（14）：8385-8390.
[6] 余传隆，黄泰康. 中药辞海（第一卷）[M]. 北京：中国医药科
技出版社，1993.
[7] 周国海，杨美霞，于华忠，等. 不同方法对爬山虎中总黄酮
含量测定的影响[J]. 中国林副特产，2004（3）：3-4.
[8] 董爱文，赵虹桥，施立毛，等. 爬山虎多糖提取与含量的测
定[J]. 中国野生植物资源，2004，23（1）：55-57.
[9] 王双明. 爬山虎果实色素的提取及性质的初步研究[J]. 食
品科技，2005，52（3）：52-54.
[10] 卜晓英，董爱文，陈晓华. LSA-7 树脂分离纯化爬山虎果
实红色素工艺优化[J]. 食品科学，2011，32（12）：111-114.
[11] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.
GB 2760-2007. 食品添加剂使用卫生标准[S]. 北京：中国标准
出版社，2009.
[12] 葛林梅，郜海燕，陈杭君，等. 加工工艺对香榧油脂氧化和
抗氧化活性的影响[J]. 中国粮油报，2011，26（5）：42-46.
[13] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.
GB/T 5009.37-2003. 食用油脂卫生标准的分析方法[S]. 北京：
中国标准出版社，2004：303-308.
[14] 刘焕云，刘月英，陈延峰，等. 莲藕皮多酚的提取及抗氧化
性能研究[J]. 林产化学与工业，2011，31（2）：88-90.
[15] 王璋，许时婴，汤坚. 食品化学[M]. 北京：中国轻工业出版
社，2006，85-122．
[16] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.
GB 1536-2004. 食用菜籽油卫生标准[S]. 北京：中国标准出版
社，2005.
[17] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.
GB 10146-2005. 食用动物油脂卫生标准[S]. 北京：中国标准
出版社，2005.
[18] 徐金瑞，列丽坤，邓翌凤. 不同抗氧化剂协同效应对花生
油稳定性的影响[J]. 中国油脂，2009，34（11）：56-58.
[19] 陈向明，王华苓，马芹芬. 山核桃外蒲壳提取物对食用油
脂的抗氧化性研究[J]. 中国粮油学报，2007，22（6）：109-112.
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