全 文 ：植物生态学报 2014, 38 (9): 959–969 doi: 10.3724/SP.J.1258.2014.00090
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
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收稿日期Received: 2014-01-07 接受日期Accepted: 2014-04-14
* E-mail: pdh1987321@163.com
** 共同通讯作者Co-author for correspondence (E-mail: litao61@hotmail.com; liyr@gxaas.net)
间作大豆对甘蔗根际土壤细菌及固氮菌多样性的
影响
彭东海1* 杨建波1 李 健1 邢永秀1,2 覃刘东1 杨丽涛1,2** 李杨瑞1,2**
1广西大学农学院/广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 南宁 530004; 2中国农业科学院甘蔗研究中心/广西农业科学院/农业部
广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良生物技术重点开放实验室/广西农业科学院微生物研究所, 南宁 530007
摘 要 为探讨间作大豆(Glycine max)对甘蔗(Saccharum officinarum)根际土壤细菌及固氮细菌多样性的影响, 收集和开发固
氮菌资源, 筛选高效甘蔗联合固氮体系, 选用3个甘蔗栽培品种‘ROC22’、‘GT21’、‘B8’与大豆品种‘Guizao 2’进行间种栽培,
采用巢式PCR特异扩增细菌16S rRNA基因片段和固氮细菌nifH基因片段, 并结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术, 对间作大
豆的甘蔗根际土壤细菌及固氮细菌进行系统演化和多样性分析。聚类分析结果显示, 间作大豆改变了甘蔗根际土壤细菌及固
氮细菌原来的群落组成结构, 尤其对固氮菌群落组成的改变更大, 但对群落物种的优势度影响较小。Shannon-Wiener多样性
指数和Simpson多样性指数分析结果表明, 甘蔗-大豆间作显著影响甘蔗根际土壤中细菌和固氮菌的多样性, 其中对固氮细菌
多样性的影响较大。不同甘蔗品种的根际土壤细菌和固氮菌在间作大豆条件下表现出不同的多样性, ‘ROC22’和‘GT21’间作
处理甘蔗根际土壤固氮细菌的Shannon-Wiener多样性指数显著高于单作处理, 而‘ROC22’与大豆间作处理的甘蔗根际土壤固
氮菌多样性最为丰富。在大豆生长盛期, 间作处理的甘蔗根际土壤细菌多样性最为丰富, 不同处理间的差异也最大, 随后下
降。总体来看, 甘蔗-大豆间作显著地影响根际土壤细菌和固氮菌的群落结构和群落多样性, 有助于对甘蔗合理间作栽培模式
的认识和筛选高效甘蔗联合固氮体系。
关键词 变性梯度凝胶电泳, 间作, 固氮细菌, 大豆, 甘蔗
Effects of intercropping with soybean on bacterial and nitrogen-fixing bacterial diversity in
the rhizosphere of sugarcane
PENG Dong-Hai1*, YANG Jian-Bo1, LI Jian1, XING Yong-Xiu1,2, QIN Liu-Dong1, YANG Li-Tao1,2**, and LI Yang-Rui1,2**
1College of Agriculture/State Key Laboratory for Subtropical Agri-Bioresources Conservation and Utilization, Guangxi University, Nanning 530004, China;
and 2Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugar-
cane Genetic Improvement/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture/Microbiology Research
Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China
Abstract
Aims In order to investigate the effects of intercropping with soybean on the diversities of bacteria and nitrogen-
fixing bacteria in the rhizosphere of sugarcane (Saccharum officinarum), to collect and exploit nitrogen-fixing
bacterial resources, and to screen for efficient sugarcane-associative nitrogen fixation system, an experiment was
conducted by cultivating three sugarcane cultivars ‘ROC22’, ‘GT21’, and ‘B8’ with a soybean (Glycine max)
cultivar ‘Guizao 2’.
Methods Rhizospheric soil bacteria and nitrogen-fixing bacteria were measured in the rhizosphere of sugarcane
intercropped with soybean by using a nested-PCR combined with denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
technique. The specific bacterial 16S rRNA gene fragments and nitrogen-fixing bacteria nifH gene fragments were
amplified for phylogenetic and diversity analyses.
Important findings Cluster analysis of bacterial communities showed that the sugarcane-soybean intercropping
changed the community composition of rhizospheric soil bacteria and nitrogen-fixing bacteria, with the effect be-
ing greater on nitrogen-fixing bacterial communities than on the soil bacterial communities. The intercropping
system had a significant effect on the diversity of the rhizospheric bacteria and nitrogen-fixing bacteria; the
impact on the diversity of nitrogen-fixing bacteria was greater than on the soil bacteria, and was only minor on the
dominance of the bacterial species. Analyses of Shannon-Wiener index and Simpson index showed that the
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nitrogen-fixing bacteria differed in diversity among the treatments with different sugarcane varieties, and that the
sugarcane cultivar ‘ROC22’-soybean intercropping had the greatest diversity. The diversity of soil bacteria in the
rhizosphere of sugarcane varied greatly among different stages of crop growth; the booming stage of soybean had
the greatest diversity and variations in the diversity among treatments in soil bacteria in the rhizosphere of sugar-
cane, and thereafter the two variables decreased. In conclusion, the sugarcane-soybean intercropping system had
significant effects on the community structures and diversities of soil bacteria and nitrogen-fixing bacteria in the
rhizosphere of sugarcane. This is of help for understanding the beneficial effects of sugarcane-soybean intercrop-
ping and for identifying efficient sugarcane-associative nitrogen fixation systems.
Key words denaturing gradient gel electrophoresis, intercropping, nitrogen-fixing bacteria, soybean, sugarcane

甘蔗(Saccharum officinarum)是世界上最重要
的糖料和能源作物。我国甘蔗种植面积和产糖量均
居世界第三位, 仅次于巴西和印度。但是与国际先
进蔗糖生产国相比, 我国甘蔗生产成本较高, 过量
施用氮肥是原因之一。广西是我国最大的甘蔗产区,
氮肥施用量为500–700 kg·hm–2, 相当于巴西平均施
氮量的6–8倍。提高单位面积的甘蔗产量及其综合效
益是我国甘蔗糖业可持续发展的客观要求, 而甘蔗
间套作栽培和甘蔗联合固氮资源的利用是甘蔗生产
节本增效的重要途径(李杨瑞, 2010)。
甘蔗是种植行距较宽的作物, 通过与各类生长
快速、生长期短的作物合理地间套作, 可提高光能、
养分等农业资源利用效率和作物产量, 增加农民收
入。目前, 国内外已发展了甘蔗-禾本科植物(小麦
(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等)、甘蔗-蔬菜
(大白菜(Brassica pekinensis)、黄瓜(Cucumis sati-
vus)、马铃薯(Solanum tuberosum)等)、甘蔗-豆科植
物 (大豆 (Glycine max)、牧草 )等多种间作模式
(Kanwar et al., 1992; Bokhtiar et al., 2003; Zhong et
al., 2003; Suman et al., 2006; Kamruzzaman & Hasa-
nuzzama, 2007)。Jayabal等(1990)研究表明, 间作大
豆处理的甘蔗, 蔗糖糖分和蔗汁纯度均优于单作甘
蔗。吴建明等(2005)和李秀平等(2012)研究发现, 甘
蔗间作大豆能提高甘蔗鲜质量和干质量, 同时也提
高了甘蔗蔗糖糖分和大豆籽粒的蛋白质和油脂含
量。
近年来, 根际微环境研究已成为土壤学最活
跃、最敏感的研究领域 (Clemensson-Lindell &
Persson, 1992)。土壤微生物也是根际土壤环境的重
要组成, 其多样性代表着微生物群落的稳定性, 也
可反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响, 其
中遗传多样性是导致微生物代谢方式和生理功能多
样化的直接原因(姜成林和徐丽华, 1997)。不同的微
生物种群的遗传多样性差异明显, 因此可以通过研
究其差异来分析微生物群落及其遗传多样性。变性
梯度凝胶电泳(DGGE)技术作为微生物多样性研究
的方法最早用于DNA突变检测(Ferris et al., 1996),
现已广泛应用于各种环境微生物的生态研究中, 如
高热温泉、湖泊、江河、海洋、沙丘、土壤和根际
等方面(Baudoin et al., 2003)。李梓正等(2010)应用
PCR-DGGE技术研究了不同退化草地细菌群落多样
性的变化。罗青等(2008)利用PCR-DGGE技术研究
了福建省稻田土壤微生物的地区多态性。周岚等
(2013)利用PCR-DGGE技术研究了玉米-大豆轮作及
氮肥利用对土壤细菌群落结构的影响。由于DGGE
技术能克服传统培养技术大量丢失信息的缺点, 因
而能准确地反映土壤微生物的多样性。
已有研究表明, 间作大豆的甘蔗根际土壤真菌
和放线菌数量显著增加(Li et al., 2013)。但迄今未见
关于间作大豆对甘蔗根际土壤细菌种群、固氮细菌
多样性及它们在间作的不同阶段多样性变化影响的
报道。因此, 本研究应用DGGE技术分别进行细菌、
固氮细菌的目的基因片段分析, 以探讨间作大豆对
甘蔗根际土壤细菌及其中固氮细菌多样性的影响,
为相关研究和甘蔗生产提供参考依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
供试甘蔗品种为‘ROC22’、‘GT21’和‘B8’; 供试
大豆品种为‘Guizao 2’, 系广西农业科学院经济作
物研究所育成的高产优质春大豆新品种。
1.2 实验方法
1.2.1 材料种植及样品采集
在广西大学农学院试验田进行甘蔗-大豆间作
对比试验, 设甘蔗单作和甘蔗-大豆间作两个处理。
裂区设计, 小区行长5 m, 每一主区种植甘蔗12行,
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每个品种4行作为一个副区。甘蔗行距1.2 m, 甘蔗-
大豆间作区内甘蔗和大豆按1:2的比例种植, 即甘
蔗行间居中种植大豆2行, 大豆行距30 cm, 株距
20 cm。
甘蔗于2012年1月5日种植, 下种量为120 000
芽·hm–2, 双芽种, “品”状摆放, 覆土3–5 cm, 表土喷
除草剂阿特拉津后覆膜。于3月31日间种大豆, 每穴
下种3粒, 苗期间苗至2株。种甘蔗时, 将尿素45
kg·hm–2、钙镁磷肥11 255 kg·hm–2和农家肥4 500
kg·hm–2混匀后作基肥施入植蔗沟。分蘖末期(即大
豆收获后)进行甘蔗中耕培土, 每hm2追施尿素105
kg, 并叶面喷施钼酸钠150 g。分别于大豆生长盛期
(时期1, 5月22日)、大豆成熟期(时期2, 7月2日)和甘
蔗伸长期(时期3, 9月15日)取甘蔗根际土、大豆根际
土以及甘蔗单作区的甘蔗行间土壤(空白对照), 过
孔径2 mm的筛除去根系、砂石等, 无菌1.5 mL离心
管快速分装后, 用液氮速冻并带回实验室置于–80
℃冰箱保存备用。
1.2.2 土壤总DNA提取
采用OMEGA (Norcross, GA, USA)公司的
E.Z.N.ATM Soil Kit提取土壤总DNA, 实验操作参照
试剂盒操作指导。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
将所提取的总DNA进行1%凝胶电泳检测, 同
时用微量紫外分光光度计(Thermo Scientific Nano-
Drop 2000/2000C, Thermo Scientific, Waltham, USA)
检测土壤总DNA的浓度和纯度。
1.2.4 目的片段的扩增
目的片段扩增采用巢式PCR的方法, PCR过程
使用的2 × Es Taq MasterMix购自北京康为世纪公
司, 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,
核酸染料Gene Finde购自厦门致善生物科技有限
公司。
16S rRNA片段第一轮扩增采用引物对799f/
1492r, 第二轮扩增采用引物对 968f-GC/1379r,
968f-GC为5′端增加了长39 bp 的“GC夹板”的引物
968f。反应体系总体积25 µL, 包含2 × Es Taq
MasterMix 12.5 µL, 10 µmol·L–1引物各0.5 µL, 模板
1.0 µL, ddH2O 10.5 µL。扩增程序均为: 95 ℃预变性
3 min; 95 ℃变性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1
min, 35次循环; 最后72 ℃延伸10 min。
nifH片段扩增采用降落式PCR的方法, 第一轮
扩增采用引物对Zehr1-F /Zehr1-R (Zani et al., 2000),
第二轮扩增采用引物对Zehr2-F/Zehr2-R (Zehr &
Mcreynolds, 1989), Zehr2-F添加“GC夹板”。反应体
系总体积25 µL, 含2 × Es Taq MasterMix 12.5 µL,
10 µmol·L–1引物各2 µL, 模板1.0 µL, ddH2O 7.5 µL。
PCR扩增程序为: 95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性1
min, 退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 退火温度从67 ℃
降落至49 ℃, 每个循环降低1 ℃, 18次循环; 95 ℃
变性1 min, 49 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 22次循
环; 最后72 ℃延伸10 min。
1.2.5 DGGE分析
用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突变检测系统
(Agilent, Hercules, USA)对第二轮PCR产物进行聚
丙烯酰胺凝胶电泳分析, 上样量为20 µL。DGGE采
用1 mm厚聚丙烯酰胺凝胶, 丙烯酰胺浓度为8%。
16S rRNA基因的DGGE变性梯度为35%–55%, nifH
基因为40%–60%。电泳缓冲液为1 × TAE buffer, 16S
rRNA基因200 V电泳5 h, nifH基因200 V电泳4.5 h。
电泳结束后采用Gene Finde核酸染料(1:10 000稀释)
进行染色 , 在扫描仪 (Bio-Rad Molecule Imager,
Bio-Rad, Hercules, USA)上进行扫描 , 进而采用
Quantity One软件(Bio-Rad)对DGGE图谱进行数字
化处理和聚类分析。
1.2.6 数据处理与分析
Shannon-Wiener多样性指数(H)对稀疏种敏感,
是研究群落物种及其个体数与分布均匀程度的综合
指标, H = –Σ Pi lnPi (Shannon, 1948), 多样性指数
Pi = ni/N, 式中, i代表条带号, ni为每个DGGE条带的
亮度, N为某一样品所有带亮度的和。Simpson多样
性指数(D)反映群落中最常见的物种, 主要测定群
落的优势度, D = 1 – ∑(Pi)2 (Simpson, 1949)。多样性
指数Pi = ni/N, 式中, i代表条带号, ni为每个DGGE条
带的亮度, N为某一样品所有带亮度的和。
采用SPSS 15.0统计软件进行数据处理, 进行方
差分析比较各处理之间的差异显著性(α < 0.05)。采
用Bio-Rad公司的Quantity One 4.4软件进行 DGGE
指纹图谱分析, 采用Office Excel 2003作图。
2 结果和分析
2.1 土壤总DNA的提取
微量紫外分光光度计检测DNA浓度在30–60
ng·µL–1之间, 满足下游实验要求。土壤微生物总
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DNA提取产物采用1%凝胶进行检查, 结果显示提
取效果良好, 条带清晰(图1)。
2.2 土壤细菌和固氮细菌的目的基因片段扩增
本研究采用巢式PCR对土壤细菌和固氮细菌进
行了基因片段扩增。在用引物968f-GC/1379r进行
16S rRNA片段的第二轮PCR扩增后 , 得到条带
单一、大小约为451 bp的片段(图2)。
利用引物Zehr-F1/R1进行第一轮PCR扩增, 然
后以该PCR产物为模板 , 采用引物Zehr2-F2-GC/
Zehr2-R2对根际土壤固氮细菌nifH基因片段进行第
二轮PCR扩增可得到400 bp左右的单一条带(图3)。
2.3 DGGE图谱分析
2.3.1 土壤细菌DGGE图谱分析
对根际土壤细菌的第二轮PCR扩增产物进行



图1 土壤总DNA提取。1, 空白对照, 时期1; 2, 大豆根际土, 时期1; 3, 空白对照, 时期2; 4, 大豆根际土, 时期2; 5, ‘B8’根际
土, 单作, 时期1; 6, ‘B8’根际土, 间作, 时期1; 7, ‘B8’根际土, 单作, 时期2; 8, ‘B8’根际土, 间作, 时期2; 9, ‘B8’根际土, 单作,
时期3; 10, ‘B8’根际土, 间作, 时期3; 11, ‘ROC22’根际土, 单作, 时期1; 12, ‘ROC22’根际土, 间作, 时期1; 13, ‘ROC22’根际
土, 单作, 时期2; 14, ‘ROC22’根际土, 间作, 时期2; 15, ‘ROC22’根际土, 单作, 时期3; 16, ‘ROC22’根际土, 间作, 时期3; 17,
‘GT21’根际土, 单作, 时期1; 18, ‘GT21’根际土, 间作, 时期1; 19, ‘GT21’根际土, 单作, 时期2; 20, ‘GT21’根际土, 间作, 时期
2; 21, ‘GT21’根际土, 单作, 时期3; 22, ‘GT21’根际土, 间作, 时期3。M, 标准分子量DNA (Mark II, 北京天根)。时期1, 大豆
生长盛期(5月22日); 时期2, 大豆成熟期(7月2日); 时期3, 甘蔗伸长期(9月15日)。
Fig. 1 Extraction of total soil DNA. 1, control, stage 1; 2, rhizospheric soil of soybean, stage 1; 3, control, stage 2; 4, rhizospheric
soil of soybean, stage 2; 5, rhizospheric soil of ‘B8’, monoculture, stage 1; 6, rhizospheric soil of ‘B8’, intercropping, stage 1; 7,
rhizospheric soil of ‘B8’, monoculture, stage 2; 8, rhizospheric soil of ‘B8’, intercropping, stage 2; 9, rhizospheric soil of ‘B8’,
monoculture, stage 3; 10, rhizospheric soil of ‘B8’, intercropping, stage 3; 11, rhizospheric soil of ‘ROC22’, monoculture, stage 1; 12,
rhizospheric soil of ‘ROC22’, intercropping, stage 1; 13, rhizospheric soil of ‘ROC22’, monoculture, stage 2; 14, rhizospheric soil of
‘ROC22’, intercropping, stage 2; 15, rhizospheric soil of ‘ROC22’, monoculture, stage 3; 16, rhizospheric soil of ‘ROC22’, inter-
cropping, stage 3; 17, rhizospheric soil of ‘GT21’, monoculture, stage 1; 18, rhizospheric soil of ‘GT21’, intercropping, stage 1; 19,
rhizospheric soil of ‘GT21’, monoculture, stage 2; 20, rhizospheric soil of ‘GT21’, intercropping, stage 2; 21, rhizospheric soil of
‘GT21’, monoculture, stage 3; 22, rhizospheric soil of ‘GT21’, intercropping, stage 3. M, DNA mark (Mark II, Tiangen). stage 1, the
highest at soybean booming stage (22 May); stage 2, soybean maturity (2 July); stage 3, sugarcane elongation stage (15 Sept.).




图2 16S rRNA基因的第二轮PCR扩增产物。图注同图1。
Fig. 2 The products of 16S rRNA gene in second round of PCR amplification. Notes are the same as in Fig. 1.
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DGGE分析, 得到根际土壤细菌16S rRNA基因的
DGGE图谱(图4)。由图4可见不同样品的细菌DGGE
电泳条带多而密, 且绝大多数条带是各样品所共有
的, 仅在光密度上存在差异。
对DGGE图谱的条带数和亮度进行数字化处
理, 并据此进行各个土壤的聚类分析, 结果如图5所
示。在相似系数0.81处, 时期1的各样品聚为一大类,
时期2和时期3基本聚为另一大类。在时期1大类中,
除‘ROC22’的间作之外, 3个品种间作处理的甘蔗根
际土壤大约在相似系数0.83处首先聚为一类, 而
‘B8’和‘GT21’的单作的根际土壤则与同期的大豆根
际土聚在一起。而在时期2和时期3所聚的大类中,
时期2和时期3相似系数均为0.86, 各样品之间相似
系数都高于0.80, 与同时期空白对照相似系数为
0.76。在时期2和时期3中, 同一品种在相同时期不同
处理间的相似性相对较小, 往往首先与其他时期或
其他处理的样品聚为一类。甘蔗行间土壤细菌多样
性较差, 时期1和时期2的甘蔗行间土壤分别在相似


图3 nifH基因的第2轮PCR扩增产物。图注同图1。+、–分别为正负对照。
Fig. 3 The products of nifH gene in second round of PCR amplification. Notes are the same as in Fig. 1. “+” and “–” are positive
and negative controls, respectively.


图4 不同土壤样品中细菌16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱。1–22同图1。
Fig. 4 Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) bands of bacterial 16S rRNA gene in different soil samples. 1–22 are the
same as in Fig. 1.
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图5 不同土壤样品中细菌16S rRNA基因变性梯度凝胶电
泳(DGGE)图谱的聚类分析。1–22同图1。
Fig. 5 Cluster analysis on denaturing gradient gel electropho-
resis (DGGE) bands of bacterial 16S rRNA gene in different
soil samples. 1–22 are the same as in Fig. 1.


系数0.76以下和0.72以下才与其他某些土样聚为
一类。
根据DGGE图谱的数字化处理结果, 进一步计
算各样品多样性相关指数, 结果见图6。从图6A可以
看出: 在时期1各样品细菌Shannon-Wiener多样性
指数较高 , 其中 ‘B8’品种间作根际土壤细菌的
Shannon-Wiener多样性指数最高, 达到4.17, 而空白
对照最低, 为3.73。各个品种的间作处理和单作处理
相比, 土壤细菌多样性变化均达到了显著水平(p <
0.05)。而时期2与时期1相比, 大豆根际土和空白对
照土壤细菌多样性变化不大, 其他各样品都出现不
同程度的下降, 其中‘ROC22’的间作处理土壤细菌
多样性仍显著高于单作。在时期3, 各样品土壤细菌
多样性较时期2整体略微下降 , 但品种 ‘ B 8 ’和
‘ROC22’的间作处理土壤细菌Shannon-Wiener多样
性指数与单作处理间的差异仍达显著水平 , 而
‘GT21’处理间差异没有达到显著水平。整体而言,
随着生长期的推移, 根际及行间土壤的Shannon-
Wiener多样性指数有所下降并趋于稳定, 处理间差


图6 不同土壤样品中细菌群落的多样性(平均值±标准误
差)。不同字母表示不同处理间在p < 0.05水平上差异显著。
Fig. 6 Diversity of bacterial communities in different soil
samples (mean ± SE). Different letters represent significant
differences among treatmens (p < 0.05).


异也趋于不明显, 而‘ROC22’品种在各个时期整体
受间作处理影响最大。
Simpson指数对富集种的相对丰度敏感, 主要
用于测定群落的优势度。图6B显示, 在时期1, 品种
‘B8’间作根际土壤细菌Simpson多样性指数达到最
大, 为0.980, 其单作处理的最低, 为0.945; ‘B8’和
‘ROC22’品种间作处理根际土壤细菌Simpson多样
性指数与同时期的单作相比较, 达到显著水平, 而
‘GT21’间作处理根际土壤细菌的Simpson多样性指
数与同时期的单作对比差异不明显。在时期2, 3个品
种的间作处理根际土壤细菌Simpson多样性指数与
同时期的单作处理相比, 差异都达到了显著水平;
其中‘GT21’品种的差异最明显。时期3中 , 只有
‘ROC22’间作处理土壤细菌的Simpson多样性指数
与同时期的单作处理相比差异达到了显著水平, 其
余两个品种均没有达到显著水平。大豆和空白对照
彭东海等: 间作大豆对甘蔗根际土壤细菌及固氮菌多样性的影响 965

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根际土壤细菌在整个大豆生育时期的Simpson多样
性指数没有明显变化, 在时期2, 大豆和空白对照
Simpson多样性指数的差异达到显著水平; 其他样
品则是在时期1有最大值, 在时期2的Simpson多样
性指数降低, 然后到时期3时又略有增加, 但是低于
时期1, 其中‘GT21’在3个时期间变化最大 , 与其
Shannon-Wiener多样性指数变化趋势一致。而时期1
中‘B8’品种间作和单作根际土细菌Simpson多样性
指数最高, 为0.945–0.980, 且在时期1到时期3, 变
化不明显, 说明其优势度大, 与其Shannon-Wiener
多样性指数表现一致。
2.3.2 土壤固氮细菌DGGE图谱分析
土壤固氮细菌nifH基因的DGGE图谱(图7)中,
各泳道条带数量及亮度均有较大差异。DGGE图谱
聚类结果(图8)显示, 间作大豆对土壤固氮细菌多样
性的影响品种间差异较大, 在相似系数0.76左右可
将全部样品聚为5类: 时期1的‘B8’的单作和间作聚
为一类, 并与时期3单作的‘B8’在相似系数大约0.74
处聚为一类; 时期2、时期3的品种‘GT21’和‘ROC22’
的大部分土样聚为一类, 但单作样品与间作样品在
相似系数大约0.81处又分别聚为一小类, 其中, 间
作样品与时期2的大豆根际土样有较高的相似性;
第四类中土样在相似系数0.78–0.80之间也可以进一
步聚成单作样品和间作样品两个小类; 空白对照土
样聚在第5类中。
根据nifH基因DGGE图谱计算土壤固氮细菌多
样性的相关指数, 结果如图9A所示。在时期1, 除
‘B8’之外, ‘ROC22’和‘GT21’的间作处理根际土壤
固氮细菌的Shannon-Wiener多样性指数显著高于单
作处理, 其中以‘ROC22’根际土壤的最大, 约为
3.59, 而‘GT21’处理间的差异最大。在时期2, 间作
处理根际土壤固氮细菌的Shannon-Wiener多样性指
数与时期1相比均有增大, 且品种‘B8’和‘ROC22’间
作处理的根际土壤固氮细菌的Shannon-Wiener多样
性指数较同时期的单作处理有显著差异。而时期3
与时期2的情况相异, 只有品种‘GT21’根际土壤固
氮细菌的Shannon-Wiener多样性指数在间作和单作
处理之间差异明显。大豆根际土和空白对照土壤固
氮细菌的Shannon-Wiener多样性指数在两个时期间
的变化不大, 但前者的Shannon-Wiener多样性指数
显著大于后者。整体来看, 各根际土壤固氮细菌多
样性的Shannon-Wiener多样性指数呈现先上升后下



图7 不同土壤样品中固氮细菌nifH基因的变性梯度凝胶电泳图谱。1–22同图1。
Fig. 7 Denaturing gradient gel electrophoresis bands of nitrogen-fixing bacterial nifH gene in different soil samples. 1–22 are the
same as in Fig. 1.

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图8 不同土壤样品中固氮菌nifH基因变性梯度凝胶电泳图
谱的聚类分析。1–22同图1。
Fig. 8 Cluster analysis on denaturing gradient gel electropho-
resis bands of nitrogen-fixing bacterial nifH gene in different
soil samples. 1–22 are the same as in Fig. 1.


降的趋势, 但均不同程度地高于空白对照土样, 而
各甘蔗品种单作处理的根际土样固氮细菌多样性的
Shannon-Wiener多样性指数也小于同时期各个品种
的间作处理, 大豆根际土壤样品固氮菌的Shannon-
Wiener多样性指数与同期空白对照土壤相比差异
显著。
从图9B可知, 在时期1, 3个品种间作与单作处
理根际土壤固氮菌的Simpson多样性指数相比都达
到显著水平, 其中以‘ROC22’间作处理根际土壤固
氮菌的Simpson多样性指数最大, 为0.976; 最小的
为‘B8’单作处理的, 为0.929; ‘B8’处理间的差异最
大。到了时期2, ‘B8’单作处理的根际土壤样品固氮
菌Simpson多样性指数上升较为明显, 达到0.971,
比同时期的‘B8’品种间作处理的0.970大, 但是没有
达到显著水平。‘ROC22’和‘GT21’间作处理根际土
壤固氮菌Simpson多样性指数也上升了, 与同时期
的单作处理相比, 差异达到显著水平。到了时期3,
各品种各处理的固氮菌Simpson多样性指数都出现
了下降, 其中甘蔗品种‘B8’单作处理下降最为明显;
‘B8’和‘GT21’间作和单作处理的根际土壤样品固氮
菌Simpson多样性指数相比, 差异达到显著水平;

图9 不同土壤样品中固氮菌群落的多样性(平均值±标准误
差)。不同字母表示不同处理间在p < 0.05水平上差异显著。
Fig. 9 Diversity of nitrogen-fixing bacteria in different soil
samples (mean ± SE). Different letters represent significant
differences among treatments (p < 0.05).


‘ROC22’间作和单作处理相比差异不明显。品种
‘B8’和‘GT21’根际土壤中固氮菌的Shannon-Wiener
多样性指数和Simpson多样性指数从时期1到时期3
则表现为先升后降的趋势, 其中‘B8’根际土样品
Simpson多样性指数变化幅度较大, 在时期2达到最
大, 而在时期3下降。
3 讨论和结论
3.1 讨论
农业土壤中微生物的数量与种类受施肥技术、
耕作制度、作物种类等因素的影响(李倩等, 2005;
邓欣等, 2006)。有研究表明, 合理的轮、间、套作
有利于维持土壤微生物的多样性, 能提高有益微生
物的数量、活性甚至农作物产量, 还可以抑制在单
彭东海等: 间作大豆对甘蔗根际土壤细菌及固氮菌多样性的影响 967

doi: 10.3724/SP.J.1258.2014.00090
一栽培模式中易发生的有害微生物, 并抑制一般厌
氧性细菌和反硝化细菌的生长(雷娟利, 2006; 郑超
等, 2004)。在微生物多样性指数中, Shannon-Wiener
多样性指数反映微生物群落物种变化度和差异度,
受样本总数和均匀度影响(Magurran, 1988), Simp-
son多样性指数反映常见种优势度。在本研究中, 间
作处理细菌的Shannon-Wiener多样性指数、Simpson
多样性指数均高于同时期同品种的单作处理, 时期
2和时期3的两种指数均较时期1下降, 但是Simpson
多样性指数变化不明显, 说明间作对甘蔗土壤细菌
群落的丰富度产生了显著影响, 而对群落物种的优
势度影响较小, 这可能是由于随着间作处理时间增
加, 个别细菌类群生长加快, 抑制了其他种群的生
长, 降低了土壤微生物群落的丰富度。有研究指出,
在大豆生长过程中其土壤微生物总数量随生育期呈
先增加后下降的单峰曲线, 在成熟期达到最小值
(严君等, 2010), 本研究的结果与之相一致。吴凤芝
等(2008)的研究表明, 甘蔗-黄瓜轮套作在一定程度
上提高了黄瓜根际土壤细菌种群的多样性指数、均
匀度指数, 且土壤细菌种群多样性随黄瓜生育期的
变化而变化, 在盛瓜期达到最高。
宋亚娜等(2006)的研究认为, 不同间、轮作种植
体系对作物根际固氮菌群落结构没有明显影响, 但
蚕豆(Vicia faba)根际固氮菌群落结构组成与小麦和
玉米差异较大。在本研究中, 大豆根际与甘蔗根际
土壤固氮细菌多样性存在较大差异, 但间作大豆对
甘蔗根际固氮细菌多样性和群落结构有显著影响。
间作处理甘蔗根际土壤固氮细菌的Shannon-Wiener
多样性指数均高于同时期同品种的单作处理, 且在
3个时期呈“低—高—低”变化, 而除了‘B8’单作处理
在时期2的Simpson多样性指数高于间作外, 其余各
品种各时期间作处理的Simpson多样性指数均高于
相应的单作处理。这似乎反映出间作大豆的根瘤菌
可能在甘蔗生物固氮中发挥作用——间作大豆使得
大豆根系周围根瘤菌富集, 部分根瘤菌可能转移到
甘蔗根际土壤与甘蔗产生联合固氮或其他类似于互
利共生的作用。而随着大豆结实成熟和根瘤的衰老
解体, 更多根瘤菌可能转移至甘蔗根际土壤, 进一
步提高甘蔗根际土壤固氮细菌的多样性和某些固氮
细菌的优势度, 从而抑制了其他细菌的生长, 并使
得总细菌的多样性下降。 在大豆收获后的甘蔗伸长
期, 由于失去了大豆根系对根瘤菌的富集、活化及
供应, 甘蔗根际土壤固氮细菌多样性有所下降。在3
个时期中甘蔗品种‘ROC22’间作处理的根际土壤固
氮菌Shannon-Wiener多样性指数都保持在最高水平,
说明其土壤中固氮菌多样性最为丰富。
本研究的DGGE图谱分析显示, 在甘蔗根际土
壤中绝大多数的细菌种群是相同的, 只是相对丰度
有所不同, 而固氮细菌的多样性较土壤总细菌有更
大变化, 而且聚类分析表明根际细菌在不同生育期
之间存在较大差异。多样性分析进一步表明间作大
豆对甘蔗不同品种、不同生长期的根际土壤总细菌
和固氮细菌有不同程度的影响。后续的研究将结合
甘蔗根系等组织内生联合固氮菌多样性来进一步探
讨间作大豆的根瘤菌在甘蔗生物固氮中的作用, 另
一方面还可以进一步筛选合理的甘蔗间作栽培模式
和高效的甘蔗联合固氮体系。
3.2 结论
3.2.1 间作大豆改变了甘蔗根际土壤细菌及固氮细
菌原来的群落组成结构, 尤其对固氮菌群落组成的
影响更大, 但对群落物种的优势度影响较小。
3.2.2 甘蔗-大豆间作显著影响甘蔗根际土壤中细
菌和固氮细菌的多样性, 其中对固氮细菌多样性的
影响更大, 但这些影响在不同甘蔗品种之间以及不
同生育期之间存在差异。
3.2.3 3个甘蔗品种根际土壤细菌和固氮细菌多样
性对间作大豆处理表现不一样, 以‘ROC22’间作处
理的根际土壤固氮菌多样性最为丰富。
3.2.4 大豆生长盛期, 间作处理的甘蔗根际土壤细
菌多样性最为丰富, 不同处理间的差异也最大, 随
后下降。
基金项目 国家高技术研究发展计划(863计划)
(2013AA102604)、国家自然科学基金(31171504、
31101122和31240056)、广西自然科学基金创新团队
项目(2011GXNSFF018002)、广西八桂学者与特聘
专家专项经费(2013)、广西科学研究与技术开发计
划项目(桂科产1123008-1和桂科攻1222009)、广西农
科院团队项目(桂农科2011YT01)。
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责任编委: 郭良栋 责任编辑: 王 葳