全 文 ：植物生态学报 2010, 34 (7): 876–888 doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.013
Chinese Journal of Plant Ecology http://www.plant-ecology.com
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收稿日期Received: 2009-08-18 接受日期Accepted: 2010-03-30
* E-mail: minxia95@126.com
豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展
丑敏霞1* 魏新元2
1西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100; 2西北农林科技大学食品科学与工程学院, 陕西杨凌 712100
摘 要 豆科植物与根瘤菌共生互作的结果导致了一个新的植物器官――根瘤的形成, 根瘤菌生活在根瘤中, 它们具有将氮
气转化为能被植物同化的氨的能力。该文阐述了根瘤的形成过程和类型, 并主要以模式豆科植物蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula)和日本百脉根(Lotus japonicus)为例, 对近年来共生结瘤过程中宿主植物对根瘤菌结瘤因子的识别和信号传递、侵
入线形成和固氮的分子基础, 以及宿主植物对根瘤形成的自主调控机制、环境中氮素营养对结瘤的影响研究进行了综述, 指
出当前豆科植物与根瘤菌共生互作研究存在的问题, 并对今后的研究方向作了分析与展望。
关键词 豆科植物, 根瘤形成, 结瘤素基因, 信号传递, 共生固氮
Review of research advancements on the molecular basis and regulation of symbiotic
nodulation of legumes
CHOU Min-Xia1* and WEI Xin-Yuan2
1College of Life Sciences, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China; and 2College of Food Science and
Engineering, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract
The symbiosis between leguminous plants and rhizobia leads to the formation of a novel root organ, the nodule. In
mature nodules, rhizobia provide the host plant with ammonium, which is produced through bacterial nitrogen
fixation. The symbiotic interactions involve the perception of bacterial signaling factors called Nod factors (NFs)
by plant host, the NF signaling pathway, the formation of infection threads and the development of nodule in the
cortex. Although this nodule formation is beneficial for host plants to secure a nitrogen resource, overproduction
of nodules could deleteriously affect plant growth. Legume plants avoid this by utilizing a negative feedback
regulation known as autoregulation of nodulation (AON), in which earlier formed nodules suppress further
nodulation through shoot-root communication. We summarize nodule formation and types and highlight recent
studies on the molecular basis underlying NF signaling cascade, AON and effects of environmental nitrogen
conditions on nodulation. We also discuss current research problems and reflect on the future of this field.
Key words legumes, nodule formation, nodulin genes, signaling, symbiotic nitrogen fixation

空气中约含80%的氮气, 因其化学惰性而无法
被高等生物直接利用。只有固氮微生物具有将氮气
转化为能被植物同化的氨的能力, 此即为生物固
氮。据联合国粮农组织(FAO) 1995年粗略估计, 全球
每年由生物固定的氮量已近2 × 1011 kg (相当于4 ×
1011 kg尿素), 约占全球植物需氮量的3/4。所以, 生
物固氮是地球上最大规模的天然氮肥加工厂。
根据固氮微生物与其他生物的关系, 可将生物
固氮系统分为自生固氮、联合固氮和共生固氮3种
不同的体系。其中, 共生固氮体系是自然界中主要
的固氮体系, 包括根瘤菌与豆科植物、弗兰克氏菌
与非豆科植物、固氮蓝细菌与植物(如满江红(Azolla
imbricata)、苏铁 (Cycas revoluta)和根乃拉草
(Gunnera tinctoria)), 以及蓝细菌与真菌的地衣共
生体等, 这一体系具有根瘤等特殊的共生结构, 固
氮效率极高, 因而始终是生物固氮研究的焦点之
一, 其中尤以豆科植物的共生固氮最为突出。世界
上有豆科植物约19 700种, 其中已知可以结瘤固氮
的有2 800多种, 占15% (Dénarié & Roche, 1991)。截
止2003年, 全球种植豆科植物的面积达1.8亿hm2,
占地球可耕地的12%和世界主要农作物产量的27%
(Graham & Vance, 2003)。它们非凡的共生固氮能力
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已使其成为人类食物蛋白的一个重要来源, 同时也
是自然界和农业生态系统的重要氮素来源之一, 它
们的次生代谢产物的重要价值也日益受到关注。此
外, 豆科植物还能与真菌共生形成内生菌根。
豆科植物与根瘤菌共生互作的结果导致了一
个新的植物器官——根瘤的形成。根瘤菌生活在根
瘤中, 它们具有将氮气转化为能被植物同化的氨的
能力。近年来, 人们对共生固氮的研究取得了长足
的进展, 特别是植物方面涉及共生结瘤的研究已经
全面展开, 主要表现在: 结瘤早期重要的信号传导
过程初露端倪; 许多结瘤素基因从不同豆科植物中
被分离筛选, 部分基因的功能得以阐明; 围绕模式
植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和日本百脉根
(Lotus japonicus)进行的结构、比较、功能基因组学
及蛋白质组学的研究正如火如荼地展开。本文主要
以蒺藜苜蓿和日本百脉根的各种突变株为例, 对近
年来豆科植物在共生固氮方面特别是共生结瘤过
程中的信号传导研究进展进行了综述, 并对当前存
在的问题和以后的研究方向作了分析与展望, 以期
为豆科植物与根瘤菌的共生互作研究提供参考。
1 根瘤的形成与类型
豆科植物可以与土壤中的根瘤菌属 (Rhizo-
bium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中华根瘤
菌属 (Sinorhizobium)、中慢生根瘤菌属 (Mesorhi-
zobium)及固氮根瘤菌属(Azorhizobium)等根瘤菌共
生结瘤, 这些共生的革兰氏阴性菌伙伴被统称为根
瘤菌, 它们之间的共生互作起始于共生双方的分子
对话。首先, 植物分泌类黄酮至根际, 诱导根瘤菌
结瘤基因的表达并合成结瘤因子(Nod factor, NF)。
这 些 结 瘤 因 子 是 一 些 脂 壳 寡 糖
(lipochitooligosaccharides, LCOs), 它们被植物特异
性地识别后, 植物的根迅速作出一系列反应, 如钙
峰及离子流(Ca2+、Cl–、H+)的形成、根毛顶端膨胀
和新的顶端生长、根毛分枝和卷曲(Dénarié et al.,
1996; Cárdenas et al., 2000; Shaw & Long, 2003)。在
卷曲的根毛内, 附着的根瘤菌进入细胞壁之间并开
始形成侵入线。侵入线是一个管状结构, 由修饰过
的植物细胞壁的局部降解及质膜内陷而成。与此同
时, 某些皮层细胞进行有丝分裂, 根瘤原基开始形
成(Timmers et al., 1999)。以类似顶端生长的方式,
侵入线在根毛内向前推进并穿过皮层细胞, 最后在
根瘤原基细胞中释放根瘤菌, 后者进一步分化成被
膜包围着的可以固氮的类菌体, 共生体形成, 根瘤
原基逐渐发育为根瘤(van Brussel et al., 1992; van
Spronsen et al., 1994; Brewin, 1998)。
结瘤因子主要由3–5个β-1, 4糖苷键连接的乙酰
氨基葡萄糖寡聚体骨架和非还原端脂肪酸链组成,
其侧链上羟基的取代基团、脂酰链的长度及不饱和
度决定着NF的活性和特异性, 并与根瘤菌的宿主
专一性紧密相关。有效的共生侵入需要特殊取代基
团的存在, 但这些取代基团并非对NF诱导的所有
反应都是必需的。例如, 在蒺藜苜蓿与中华根瘤菌
的共生互作中, 侵入线的形成严格要求结瘤因子葡
糖胺骨架非还原端具有乙酰基, 但钙峰形成、一些
特异基因的转录及根瘤原基的发生则没有这样严
格的要求(Ardourel et al., 1994; Oldroyd et al., 2001;
Wais et al., 2002)。因此, 有人提出了在Medicago中
NF存在两类受体: 信号受体与进入受体, 前者是诱
导结瘤过程早期反应所必需的, 后者则介导着根瘤
菌在根表皮中的侵入过程, 对NF的结构有着更严
格的要求(Ardourel et al., 1994)。
从结构上看, 根瘤一般可分为定型根瘤和不定
型根瘤(图1)。前者主要在热带豆科植物如大豆
(Glycine max)、豇豆(Vigna unguiculata)等的根上形
成, 这类根瘤只在发育早期出现细胞分裂, 随后只
进行细胞的伸长生长。在成熟的根瘤内, 包含固氮
细胞的中央组织是均一的。不定型根瘤则通常形成
于温带豆科植物上, 如蒺藜苜蓿、豌豆(Pisum sa-
tivum)、蚕豆 (Vicia faba)及白花三叶草 (Trifolium
repens)等, 它们具有明显的分层: I层为顶端分生组
织; II层为含有根瘤菌的侵染区; 然后是富含淀粉
粒的II-III中间带, 主要的转录变化即发生于此; III
层为固氮区, 其中充满能固氮的类菌体; 最后是接
近衰老的IV层(Vasse et al., 1990; Brewin, 1991;
Hirsch, 1992)。要注意的是, 日本百脉根虽然和蒺藜
苜蓿同属于温带豆科植物, 但却形成定型根瘤。
实际上, 定型根瘤与不定型根瘤的区别不仅表
现在结构上, 在发育早期, 它们就已经显示了不同:
不定型根瘤的根瘤原基形成于内皮层, 而定型根瘤
的根瘤原基形成于外皮层; 不定型根瘤早期伴随有
胞质桥的发生 , 而定型根瘤则不一定 , 如菜豆
(Phaseolus vulgaris)就不像日本百脉根一样形成胞
质桥(van Spronsen et al., 2001)。另外, 类菌体在不
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图1 定型根瘤与不定型根瘤示意图。A, 不定型根瘤结构模式图。B, 紫云英不定型根瘤纵切图。C, 大豆定型根瘤纵切图。
A和B来自Naito等(2000), C由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室生物固氮研究室提供。
Fig. 1 Diagram of the determinate- and indeterminate-type nodule. A, Schematic representation of the five distinct regions of an in-
determinate type nodule. B, The vertical dissection of an indeterminate type nodule of Astragalus sinicus. C, The vertical dissection
of a determinate type nodule of soybean. A and B are derived from Naito et al., 2000; C is provided by the laboratory of Biological
Nitrogen Fixation, State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.


同类型根瘤中的形成与代谢也各异。在定型根瘤中,
共生体间可以相互融合, 或者同一共生体中的类菌
体进一步分裂, 结果形成几个类菌体共存于一个共
生体中的局面; 而在不定型根瘤中, 单个的共生体
连同类菌体一起分裂, 结果更多地是一个共生体中
只包含一个类菌体(Prell & Poole, 2006)。研究表明,
在侵入线发育过程中, 聚羟基丁酸(PHB)在根瘤菌
细胞中大量贮存(Lodwig et al., 2003, 2005)。在不定
型根瘤的类菌体形成过程中, PHB颗粒裂解; 同时,
以不产PHB的根瘤菌突变体接种豌豆, 其不定型根
瘤中的类菌体在发育过程中消耗了更多的植物淀
粉(Lodwig et al., 2005), 表明PHB在类菌体形成中
作为碳源和能源被利用, 分解代谢的急剧增强导致
了PHB的消耗。但在定型根瘤中, 即使是成熟的类
菌体, 仍然继续积累着大量的PHB。类菌体固定形
成的NH4+进入植物细胞后, 在许多豆科植物特别是
结不定型根瘤的植物细胞中, NH4+被结合形成谷氨
酰胺或天冬酰胺, 而在热带结定型根瘤的豆科植物
中, NH4+被结合为酰脲(Lodwig & Poole, 2003)。
然而, 无论哪种根瘤, 其形成和发育都离不开
植物基因的调控和参与。van Kammen (1984)将在结
瘤过程中被诱导表达或表达增强了的植物基因定
义为结瘤素基因, 表达产物称为结瘤素。根据表达
时间的早晚, 结瘤素基因可以分为早期结瘤素基因
和晚期结瘤素基因, 前者在开始固氮前表达, 主要
参与根瘤的形成和发育; 后者则在发育完全的、成
熟的根瘤中表达, 与根瘤的功能有关, 包括一些参
与初级代谢的酶、维持根瘤完整结构的蛋白质等,
其中研究得较为清楚的是豆血红蛋白基因(Nap &
Bisseling, 1990)。
因为植株个体矮小、生育期短、基因组小、自
花授粉和可被转化等优点, 蒺藜苜蓿和日本百脉根
分别作为不定型根瘤和定型根瘤结瘤系统的代表
植物而受到广泛研究。利用反向遗传学手段, 人们
从这两种模式植物中获得了各种结瘤缺失突变植
株, 从而开始了结瘤信号识别途径的研究。这些突
变株一般分为两类: 不能结瘤的突变株Nod–和不能
固氮的突变株Fix–。此外, 还有超结瘤突变株。
2 根瘤形成早期的信号传导
根瘤形成早期信号传导基因的分离主要通过
对突变株的研究获得, 该类突变株不能形成根瘤、
在结瘤因子信号传导中存在缺陷。最重要的突变之
一应是来自日本百脉根的 nfr1和 nfr5突变株
(Radutoiu et al., 2003), NFR1和NFR5基因编码LysM
类丝氨酸/苏氨酸受体激酶(LysM RLKs)。LysM是一
个肽聚糖结合结构域, 最初在细菌溶素和溶菌酶中
发现, 一般存在于和细菌细胞壁及病原相关的蛋白
质中。由于结瘤因子的基本结构是N-乙酰葡糖胺以
β-1,4糖苷键相连的多聚体, 类似于肽聚糖的结构
(N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺通过β-1,4糖苷键相
连的多聚体), 因此, 虽然缺乏生化上的证据, NFR1
和NFR5被公认为是直接与结瘤因子相作用的受体,
存在于质膜上。通过序列比较, 类似的突变株nfp
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(Nod factor perception)和sym10 (symbiosis 10), 相继
在蒺藜苜蓿(Amor et al., 2003)和豌豆(Walker et al.,
2000)中发现 , 其中的相关基因同样编码LysM
RLKs。在LysM类受体激酶突变株中, 所有结瘤因
子诱导的反应(包括钙流和钙峰这一结瘤因子信号
传导途径中最早出现的反应)均被破坏。
在蒺藜苜蓿中, 还发现一组不能形成侵染(do
not make infections)的突变株: dmi1、dmi2、dmi3,
dmi1和dmi2突变株不能被结瘤因子诱导产生钙峰,
钙流的存在也较野生型短暂(Wais et al., 2000; Shaw
& Long, 2003; Ané et al., 2004)。DMI1由氨基端序列
介导定位于蒺藜苜蓿根及根瘤细胞的核膜上, 羧基
端包含一个钾离子电导率调控蛋白结构域(RCK),
与产甲烷杆菌中的钾离子通道蛋白(MthK)有着高
度的相似性, 包括RCK在内的羧基端缺失突变明显
干扰了根瘤的形成, 并使得G蛋白拮抗物胡蜂蜂毒
素诱导的钙峰不能形成。研究者们认为, DMI1并没
有直接参与结瘤因子诱导的钙离子变化, 而是调控
着钙离子通道蛋白(Riely et al., 2007; Peiter et al.,
2007)。DMI1在日本百脉根中有两个同源蛋白质:
POLLUX和CASTOR, 它们的突变株虽能发生根毛
分枝与变形, 但不发生根毛卷曲, 也不能形成侵入
线; 与DMI1不同, POLLUX和CASTOR定位于质体
上, Imaizumi-Anraku等(2005)推测它们可能形成复
合物, 调节钙离子流穿过质体膜。近年的研究表明,
POLLUX和CASTOR也为另一更古老的共生体
系――植物与真菌的共生互作所需, 在豆科植物和
非豆科植物中广泛存在且高度保守(Banba et al.,
2008; Chen et al., 2009)。DMI2编码一个含有重复的
亮氨酸丰富结构域的类受体激酶(LRR-RLK), 定位
于质膜和侵入线膜上(Endre et al., 2002; Limpens et
al., 2005), 它的同源物有: 来自日本百脉根和田菁
(Sesbania cannabina)的SYMRK (symbiosis receptor
kinase; Stracke et al., 2002; Capoen et al., 2005)、紫
花苜蓿(Medicago sativa)的NORK (nodulation recep-
tor kinase; Endre et al., 2002)和豌豆的 SYM19
(Stracke et al., 2002)。dmi3编码钙离子/钙调素依赖
的蛋白激酶(CCaMK) (Lévy et al., 2004), 日本百脉
根中与其同源的基因为SNF1 (spontaneous nodule
formation 1)。CCaMK含有一个自抑制结构域, 在与
钙调素结合后自抑制结构域释放, 使得CCaMK的
激酶活性得以表达, 从而激活根瘤的形态发生过
程。和dmi1、dmi2一样, dmi3不能共生结瘤, 但该突
变株能形成钙峰。在不接种根瘤菌的情况下, 自激活
的CCaMK能诱导早期结瘤素基因ENOD11的表达,
并在植株上形成根瘤(Gleason et al., 2006; Tirichine
et al., 2006)。除了负责转换钙峰信号以外, DMI3还可
能通过磷酸化的方式控制NSP1的表达(Smit et al.,
2005)。
nsp1、nsp2 (nodulation signaling pathway 2)具有
和dmi3类似的突变表型, 遗传学分析表明, 它们位
于dmi3的下游, 编码属于GRAS家族的蛋白质(Kaló
et al., 2005; Smit et al., 2005)。GRAS结构域包含两
个亮氨酸丰富区和一些小的稳定的保守序列, 如
VHIID、PFYRE和SAW, 这个家族的成员与植物赤
霉素和光敏色素的信号传导有关, 推测是一些转录
调控因子。NSP1、DMI3均定位于根表皮细胞和皮
层细胞的细胞核上(Smit et al., 2005), NSP2则定位
在核膜和内质网上(Kaló et al., 2005)。研究表明, 蒺
藜苜蓿经结瘤因子处理后, 一些早期结瘤素基因迅
速表达, 其中包括ENOD11。自激活的CCaMK也能
诱导ENOD11的表达, 同时还需要NSP1、NSP2及
ERN1等基因参与调控(Gleason et al., 2006; Tirichine
et al., 2006; Middleton et al., 2007), 表明CCaMK传
递的钙信号正是通过上述NSP1、NSP2、ERN (ERF
required for nodulation)等转录调控因子激活了靶基
因的表达。ERN1及其同源蛋白ERN2、ERN3直接
作用于ENOD11的启动子, 其中, ERN1和ERN2为转
录激活物 , 而ERN3则起抑制作用(Andriankaja et
al., 2007)。最近的研究证实, 在体外, NSP1可直接
结合于ENOD11、ERN1、NIN等早期结瘤素基因的
启动子部位, 表明这些基因的诱导需要NSP1; 而在
体内, NSP1与ENOD11启动子的相互作用还需要
NSP2, 亦即以NSP1-NSP2异源多聚体的形式与之
结合(Hirsch et al., 2009)。ERN类调控因子和NSP1
与ENOD11启动子之间的结合位点仅相距26 bp, 推
测这两类蛋白质之间可能存在着一定的相互作用。
可见, 在NF信号传导途径中, 钙离子作为第二信
使, 负责着宿主细胞质膜对根瘤菌NF的识别到细
胞核中基因的表达变化之间的信号链接。
与ERN一样, EFD (ERF required for nodule dif-
ferentiation)也属于乙烯响应因子群V (ethylene re-
sponse factor group V, ERF V)的转录因子, 但是,
EFD的氨基酸序列及表达方式均明显有别于ERN蛋
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白质(Vernié et al., 2008)。研究表明, EFD负调控着根
瘤菌引起的侵染结瘤, 并为有固氮功能的根瘤形成
所必需; 另外, EFD激活了细胞分裂素的初级受体
基因Mt RR4的表达, 可能因而阻遏了细胞分裂素信
号传递过程, 结果抑制了新的根瘤起始, 却促进了
已起始根瘤分生组织细胞的分化 (Vernié et al.,
2008)。因此, EFD很可能是连接根瘤形成早期和晚
期阶段的一个关键调控因子。来自日本百脉根的调
控因子LjERF1属于另一个不同的乙烯响应因子群
IX (Asamizu et al., 2008), LjERF1 在 根 瘤 菌
Mesorhizobium loti对宿主的成功侵染过程中发挥着
重要作用。接种后, LjERF1只在根的表皮细胞中表
达, 在根瘤中没有任何表达, 推测是根瘤形成早期
的正调控因子。
Kanamori等 (2006)报道了一个核孔蛋白
NUP133, 它的基因突变导致了日本百脉根的温敏
型结瘤缺失, 即使在适宜的温度下, 也只能形成无
效瘤, 侵入线中的少量根瘤菌不能被释放; 而且,
它对钙峰的诱导是必需的; NUP133定位于核膜上。
因此, 在宿主植物识别相应的根瘤菌后, NUP133可
能在核-质信息交流中起着一定的作用。在对上述突
变株的研究中还发现, dmi类和nup133突变株也不能
与菌根真菌共生, 真菌不能在植株体内定殖, 表明
在这个古老的共生体系中, DMI及NUP类基因在菌
根真菌的早期信号传导中同样起着重要作用(Endre
et al., 2002; Stracke et al., 2002; Ané et al., 2004; Mitra
et al., 2004; Lévy et al., 2004; Kanamori et al., 2006)。
其他重要的不结瘤突变株还有在根瘤发育或
起始信号转换上存在缺陷的日本百脉根突变株nin
(Schauser et al., 1999)、来自蒺藜苜蓿的不能发生根
毛卷曲的hcl (Wais et al., 2000)等。这两种突变株虽
然能够感知结瘤信号并表现根毛变形及显示钙峰,
nin (nodule inception)甚至可以发生个别根毛的过度
卷曲, 但它们不能形成侵入线、根瘤原基等。NIN
含有跨膜结构域和一个DNA结合结构域, 推测是一
个转录因子, 从豌豆中分离到它的同源基因SYM35
(Schauser et al., 1999; Borisov et al., 2003)。对蒺藜
苜蓿同源突变株Mtnin的研究显示, NF早期信号传
递过程并不需要NIN, 但NIN调控着ENOD11的空
间表达, 并因此可能控制着结瘤数量; 而且, MtNIN
对于自激活CCaMK诱导的自发结瘤过程是必需的。
尽管hcl (hair curling)突变株与Mtnin有着相似的表
型, 但HCL对于CCaMK诱导的根瘤形成却并非必
不可少(Marsh et al., 2007)。研究表明, HCL编码的
LYK3受体蛋白与日本百脉根中的NFR1同源, 也含
有LysM结构域, LYK3控制着根毛卷曲, 并以依赖
于结瘤因子结构的方式控制着侵入线的形成, 可能
是结瘤因子的进入受体(Limpens et al., 2003; Smit
et al., 2007)。
综上所述, 可以将目前已知的豆科植物早期共
生结瘤过程中的信号流及生理反应表示为图2。
3 侵入线的形成及固氮的分子基础
这方面的研究主要通过Fix–突变株揭示, 该类
突变株虽可结瘤或形成瘤状物, 但不能固氮。从蒺
藜苜蓿中分离到了不少这种类型的突变株, 如形成
小的、肿块状的无效根瘤的lin、nip、Mtsym1。lin
(lumpy infections)只能形成根瘤原基, 侵染过程仅
限于根表皮细胞, 皮层细胞中没有侵入线的形成,
接种后的根中检测不到乙炔还原活性(Kuppusamy
et al., 2004)。nip (numerous infections and polyphe-
nolics)虽然有侵入线的形成, 但发育很不正常, 且



图2 共生结瘤早期结瘤因子的信号传导途径。
Fig. 2 The Nod factor signaling pathways during early sym-
biotic nodulation.
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极少释放根瘤菌至宿主细胞或根瘤菌不能完成分
化, 一些与植物防御有关的基因表达增强(Veere-
shlingam et al., 2004)。在Mtsym1 (Bénaben et al.,
1995)中, 晚期结瘤素基因如LB1、CAM1、N31不能
表达, 也没有乙炔还原活性。最近, Teillet等(2008)
从蒺藜苜蓿中分离到一个api (altered nodule pri-
mordium invasion)突变株, 表现为根瘤菌的侵染过
程刚好在进入根瘤原基之前失败, 结果在与根瘤原
基相邻的外皮层中形成大的侵入袋(侵入线变形增
大后形成的袋状结构), 在根上形成一些小的瘤状
物。研究显示, API与乙烯代谢及结瘤因子信号传递
没有关系 ; 遗传图谱及上位分析显示 , API应在
ERN1和LIN的下游及NIP的上游行使功能。
从蒺藜苜蓿中, Starker等(2006)还筛选到了8个
dnf (defective in nitrogen fixation)突变株, 它们均结
白色小瘤。其中, 除了dnf3、dnf6可显示少量乙炔还
原活性外, 其余突变株均检测不到固氮酶活性; 包
括LB1、CAM1、N31在内的晚期结瘤素基因在大多
数dnf突变株中都能正常表达, 只有dnf1、dnf5、dnf2
例外: dnf1、dnf5不表达所有上述基因, dnf2则不表达
N31。这些突变株中根瘤菌基因nodF (与侵染起始及
根瘤发育有关)、exoY (与侵染有关)、bacA (为根瘤
菌在宿主细胞中的存活所需)和nifH (固氮基因)的
表达结果显示, dnf2中只有少量根瘤支持表达nodF
和bacA; dnf1、dnf2和dnf5不能启动nifH的表达, 其
余突变株表达nifH的根瘤数量只有野生型的26%
(dnf4)、32% (dnf7)或一半(dnf3、dnf6); exoY在dnf3、
dnf5、dnf6中的表达显著下降。可见, 一个有功能的
根瘤不仅已经完成了组织分化, 还需要为根瘤菌提
供合适的环境, 激活相关基因的表达, 才能发挥其
固氮功能。
另外, 来自日本百脉根的crinkle (Ljsym79)突变
导致侵入线不能穿过表皮细胞, 少数根瘤含有形状
不规则的能固氮的类菌体, 能够表达豆血红蛋白基
因; 植物本身也出现了异常发育(Tansengco et al.,
2003)。在alb1 (Ljsym74)突变株形成的无效瘤中, 根
瘤中的维管束发育不全, 根瘤菌被包裹在异常增大
了的侵入线中, 不能释放进入植物细胞(Imaizumi-
Anraku et al., 2000)。
4 豆科植物结瘤的自主调控分子机制
根瘤的形成虽然有利于植物在氮素营养不足
的环境中生存, 但这毕竟是一个耗能的过程, 根瘤
数目过多将对植物的生长造成不利的影响, 为了解
决这一矛盾, 豆科植物在长期进化中已经发展出一
套负反馈调节机制: 已经形成的根瘤能够抑制新的
根瘤的形成。豆科植物的这一自主调控机制
(autoregulation of nodulation, AON)主要通过根-茎-
根之间的长距离信号交流实现: 受结瘤因子刺激
后, 根部产生某种信号分子被运至茎部, 茎解读此
信号后合成出新的信号分子再输送到根部, 从而对
根瘤的数目进行控制。除此之外, 我们认为, AON
调控体系还应该包括细胞-细胞间的短距离信号交
流。另外, AON调控体系不仅控制着根瘤的数目, 同
时也可能控制着根瘤的类型。
4.1 长距离交流体系中根产生的信号分子
日本百脉根超结瘤突变株har1–与野生型植株
之间的嫁接试验表明, 超结瘤表型由茎的基因型决
定, 从而引出茎产生的某种物质对根瘤数量进行控
制的推测。序列分析显示, HAR1 (hypernodulation
aberrant root formation 1)编码一个富含亮氨酸的类
受体激酶, 和来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的
CLAVATA1 (CLV1)有着很高的同源性(Krusell et al.,
2002; Nishimura et al., 2002a)。CLV1是一个类受体
激酶, 在拟南芥中, 通过与经由CLV3加工而来的小
分子多肽相结合, 以细胞-细胞的短距离信号传递
方式 , 调控着茎和花顶端分生组织细胞的增殖
(Ogawa et al., 2008) 。 CLV3 属 于 CLE 家 族
(CLAVATA3/ESR-related family)成员 , 研究表明 ,
CLE家族所编码的蛋白或加工后的小分子多肽常常
作为胞外多肽激素发挥作用。此外, 大豆、豌豆和
蒺藜苜蓿的同源基因产物NARK (nodule autoreg-
ulation receptor kinase; Searle et al., 2003)、SYM29
(Krusell et al., 2002)、SUNN (super numeric nodules;
Schnabel, et al., 2005)对根瘤数量的控制也都是通
过茎-根之间的长距离信息交流实现的, 这些AON
基因均与CLV1有着极高的序列相似性。因此, 有理
由认为, AON信号调控系统也可能以CLE蛋白作为
多肽激素, 激活了HAR1类受体激酶。
近年 , 从日本百脉根中分离到2个CLE基因 :
LjCLE-RS1和LjCLE-RS2, 研究表明, 这两个基因都
只在根中表达, 并在接种根瘤菌后的24 h内表达量
迅速上升; 发根转化实验结果显示, 它们在野生型
植株根中的过度表达强烈抑制了根瘤的形成, 而
882 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 876–888

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且, 这种抑制效果还能传递至未转化的根; 同时,
HAR1这一类受体激酶对于LjCLE-RS1/RS2发挥抑
制作用必不可少(Okamoto et al., 2009)。此外, 在蒺
藜苜蓿中也发现了两个与根瘤数目控制有关的基
因 : RALFL1 (rapid alkalinization factor-like 1)和
DVL1 (devil 1), 与LjCLE-RS1/RS2类似, 二者的超
表达同样引起根瘤数目的急剧下降(Combier et al.,
2008a)。但是, 这两个基因是否也作为AON基因行
使功能, 尚待进一步研究。已经证实, 乙烯能够以
局部调控的方式控制根瘤数目, 这种抑制作用不同
于AON的系统控制。蒺藜苜蓿的乙烯不敏感突变体
sickle, 也表现过度结瘤现象, 且具备完整的AON
调控系统; 其中的相关基因MtSkl1与拟南芥中的乙
烯信号传导基因Ein2同源(Penmetsa et al., 2008)。因
此, 也可能与MtSkl1类似, MtRALFL1和MtDVL1介
导了结瘤因子与乙烯调控系统之间的某种分子
对话。
4.2 长距离交流体系中茎对来自根的信号分子的
响应
已有研究表明, LjHAR1的启动子主要在叶、茎,
以及根瘤组织中的韧皮部表达 (Combier et al.,
2008a)。而韧皮部被普遍认为是长距离信号传递通
道 (Lough & Lucas, 2006)。鉴于此 , Magori和
Kawaguch (2009)认为, 来自根部的小分子多肽如
CLE-RS1/2被输送到茎部 , 直接或间接地激活了
CLV1类受体激酶, 而CLV1的主要作用可能是介导
茎中合成相应的信号分子并与之结合, 随后通过韧
皮部运至根部, 并与相应的受体结合。然而, 茎中
合成的信号分子究竟是什么, 目前尚无确切的报
道, 尽管有一些研究表明, 茉莉酸、生长素等植物
激素可能在AON系统中发挥作用, 但实验结果往往
相互矛盾。此外, 类黄酮也可能通过介导生长素的
极性运输而影响根瘤的形成(Hirsch, 1992)。在蒺藜
苜蓿和大豆中, 类黄酮合成途径中相关基因的表达
沉默导致结瘤减少, 同时增强了生长素由茎到根的
运输水平(Subramanian et al., 2006; Wasson et al.,
2006)。但是, 在大豆中, 类黄酮合成酶基因的沉默
导致的结瘤下降可以通过加入结瘤因子等方法解
除(Subramanian et al., 2006), 说明至少在大豆中,
类黄酮对结瘤过程的影响也许并不是通过对生长
素运输的调控实现的。
虽然来自茎的因子尚未证实, 但其在根中的可
能受体或信号中间载体已经被报道: 嫁接试验表
明, 与har1不同, 日本百脉根突变株tml (too much
love)超结瘤表型是由根的基因型控制的, 而且har1
突变不能使tml的根瘤数目明显增加; 此外, TML对
结瘤的抑制作用不能在根与根之间传递。因此 ,
TML可能是茎信号分子的根部受体, 在har1下游起
作用(Magori et al., 2009)。考虑到AON的系统调控
方式, 显然, 在TML下游应该有可移动信号分子的
产生, 以使茎对根瘤形成的抑制效应能在根与根之
间传递。
除了CLV1类受体激酶, KLAVIER(KLV)是另一
个自日本百脉根的茎中获得的AON信号体系成员。
但是, klavier突变株除了根瘤数目增多外, 还出现
叶脉凸起、开花延迟、植株矮化等现象(Oka-Kira et
al., 2005)。日本百脉根的另一突变株astray, 能形成
二倍于野生型的根瘤, 且提早结瘤, 在非共生条件
下 , 此突变株对重力和光的反应存在缺陷
(Nishimura et al., 2002b)。ASTRAY能够在植物的叶
片、子叶、茎、胚轴、根及根瘤等组织中表达, 根
部是否接种根瘤菌对其表达没有明显影响。ASTRAY
编码蛋白质LjBzf, 其C端具有亮氨酸锌指结构域,
与拟南芥HY5蛋白高度同源, HY5是一个与光形态
发生有关的调控因子; LjBzf的N端含有一个RING-
finger和一个酸性区域。Nishimura等(2002b)认为,
LjBzf中包含的结构域组合为豆科植物所特有的,
负控制着根瘤的形成。这些现象说明 , KLV和
ASTRAY可能是植物生长发育过程中一个多功能的
普遍性调控因子, 不仅控制着根瘤的形成, 同时还
调控着植物的其他生理过程。
4.3 细胞与细胞之间短距离交流对根瘤形成过程
的控制
实际上, 除了茎与根之间长距离信号传递体系
外, 根瘤起始和根瘤数目的调控应该还包括细胞与
细胞之间的短距离分子对话, 后者可能主要以胞间
连丝作为交流通道(plasmodesmata, PD)。通过荧光
跟踪、绿色荧光蛋白(GFP)报告系统等方法, 研究人
员分析了蒺藜苜蓿中PD介导的韧皮部与根瘤原基
之间的信息交流情况(Imlau et al., 1999; Complain-
ville et al., 2003)。研究发现, 接种根瘤菌后, 在刚刚
开始分裂的皮层细胞中, 即可检测到GFP信号, 而
根瘤原基正是由这些皮层细胞分裂形成的。在这些
根瘤起始细胞中, GFP在细胞分裂完成前即已表达,
丑敏霞等: 豆科植物共生结瘤的分子基础和调控研究进展 883

doi: 10.3773/j.issn.1005-264x.2010.07.013
这与PD网络重新排布相一致, 说明PD介导了NF激
活后的植物细胞与其他部分之间的分子交流, 这对
根瘤的形成可能非常重要 (Complainville et al.,
2003)。AON体系中最终能在根与根之间进行某种
抑制因子的传递, 可能正是经由PD的短距离交流
实现的。
4.4 茎对根瘤类型的控制
茎不但控制着结瘤数量, 而且在决定根瘤的类
型上也起着重要作用。通常情况下, 蒺藜苜蓿与
Sinorhizobium meliloti共生形成不定型根瘤, 而日本
百脉根与Mesorhizobium loti共生形成定型根瘤。两
者之间的嫁接试验表明, 嫁接了蒺藜苜蓿茎的日本
百脉根的根能与M. loti共生形成定型根瘤, 它的超
结瘤突变株har1-1的根嫁接到蒺藜苜蓿茎上后可恢
复野生型结瘤现象; 然而, 当蒺藜苜蓿的根与日本
百脉根的茎嫁接后, 无论接种S. meliloti还是M. loti,
都不能结瘤, 说明日本百脉根的茎不能支持蒺藜苜
蓿的根与相应根瘤菌之间的结瘤, 不定型根瘤的形
成也许还需要某种来自茎的因子的参与(Lohar &
VandenBosch, 2005)。茎对根瘤类型的控制可能也是
AON体系的一部分。
5 环境中的氮素营养对根瘤形成的影响
豆科植物根瘤的形成不仅涉及共生双方的分
子对话与调控, 同时也与环境因素有关, 如水分、
矿质营养元素、温度、重金属、钠盐、CO2、土壤
类型以及pH等, 其中, 研究较为深入的是结合态氮
素的影响。土壤中氮素养料的匮乏是根瘤形成、发
育乃至发挥固氮功能必不可少的先决条件, 高浓度
的硝酸盐或铵盐的存在能够完全抑制根瘤的形成
(Oka-kira et al., 2005; Barbulova et al., 2007), 而低
浓度的氮能促进植物生长并促进结瘤(Fei & Vessey,
2009)。实际上, 来自不同豆科植物的超结瘤突变株
都表现出了对硝酸盐的耐受性(Krusell et al., 2002;
Nishimura et al., 2002a; Searle et al., 2003; Schnabel
et al., 2005)。在日本百脉根中, 结合态氮的存在抑
制了NF诱导的皮层细胞的分裂; 相对于生长在无
氮条件下的植株, 在高浓度硝酸盐或铵盐环境中生
长的野生型日本百脉根, 在受NF诱导或接种M. loti
24 h后仍无NIN基因的表达; 对于har1-3超结瘤突变
株, 即使在培养基中添加10或20 mmol·L–1 KNO3的
情况下, NIN仍能被高水平诱导, 但是, 当加入10
mmol·L–1 NH4NO3或琥珀酸铵时, NIN的表达与野生
型一样被抑制。说明硝态氮和铵态氮可能在根瘤原
基形成的不同时期发挥抑制作用, 而NIN则在硝态
氮的抑制信号途径中起关键作用(Barbulova et al.,
2007)。此外, 硝酸盐增强了LjCLE-RS2在植物根中
的表达, 因此, har1超结瘤突变株之所以在有硝酸
盐的环境中仍然结瘤, 可能正是因为与硝酸盐信号
途径相关的LjCLE-RS2失去了识别受体(Okamoto et
al., 2009)。
6 展望
6.1 信号传递相关基因的分离与根瘤形成的基因
调控网络的完善
共生固氮分子机制涉及到宿主植物对细菌结
瘤因子的特异性识别及宿主结瘤素基因的表达激
活, 其中包括与信号传导有关的基因, 例如相关激
酶和转录因子的表达。目前, 对宿主植物对NF早期
反应的分析、NF受体的克隆及部分信号传导基因的
分离, 已经在共生互作与植物信号传递之间打开了
一道门。尽管已从不同的豆科植物中分离到不少结
瘤素基因, 但是, 大部分基因在结瘤过程中的具体
作用并不完全清楚。例如, 大量的编码根瘤特异性
的富含半胱氨酸簇的蛋白质(cysteine cluster protein,
CCP)基因在不定型根瘤中被分离(Mergaert et al.,
2003; Chou et al., 2006), 这些CCP具有抗微生物的
保护蛋白的结构域, 它们在根瘤中的转录明显增
加, 其生物学功能尚待研究。从上面的介绍中也可
以看到, 迄今分离到的与根瘤形成有关的转录因
子, 如NSP、ERN、NIN等, 在根瘤形成中的具体功
能需要进一步证实。而且, 目前对类似的调控根瘤
形成的结瘤素基因仍然知之甚少。无疑, 包括植物
激素在内的共生早期信号分子的分离及其功能研
究, 仍将继续是共生领域的研究热点; 而随后的共
生过程, 如侵入线形成、根瘤菌的进入与释放等现
象的探明也非常令人期待, 这将为最终建立一个完
整明确的根瘤形成的基因调控网络提供依据。
6.2 转录因子与小分子RNAs的作用
基因的转录动力学不仅与转录过程本身有关,
而且与mRNA的稳定性相关, 特别是在真核细胞中,
mRNA的稳定性与细胞分化有着重要关系, 并受到
不编码的小分子RNAs (microRNAs, miRNAs)的调
控。许多转录因子组成复杂的调控网络, 负责器官
884 植物生态学报 Chinese Journal of Plant Ecology 2010, 34 (7): 876–888

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发生 , 根瘤的形成也不例外。在植物细胞中 ,
miRNAs调节着转录因子的活性, 编码转录因子的
mRNAs正是miRNAs的作用目标(Brodersen et al.,
2008)。根瘤的形成中, 也发现了类似的调控方式。
来自蒺藜苜蓿的MtHAP2.1是目前分离到的少数在
根瘤分生组织细胞中表达的基因之一 , 编码
CCAAT结合蛋白家族的转录因子, 其表达在根瘤
的顶端分生组织中最为丰富, 在与之毗邻的侵染带
的细胞中表达降低, 而在根瘤的其他组织中均检测
不到。研究显示, MtHAP2.1的表达受到microRNA-
169 (MIR169)的调控, MIR169的过度表达与利用
MtHAP2.1 RNAi的实验结果相似, 都表现为根瘤的
发育受阻; 而MIR169介导的转录后调控功能的丧
失则导致根瘤发育迟缓 (Combier et al., 2006,
2008b)。因此, MIR169可能通过限定MtHAP2.1的空
间表达以及快速的转录后降解来促使根瘤细胞分
化。在蒺藜苜蓿中, 另一个小分子RNA――MIR166
能够对HD-ZipIII (Class-III homeodomain-leucine
zipper)家族的转录因子进行转录后调控, 后者在根
的维管组织中表达并与根瘤形成有关。MIR166的过
度表达至少降低了3个HD-Zip III家族成员的转录,
并因此影响了根维管组织的发育, 阻碍了根瘤和侧
根的形成起始(Boualem et al., 2008)。可见, 在根瘤
器官发生的起始分化和根瘤细胞形成过程中 ,
miRNAs调控着其间涉及的转录因子的时空表达方
式。在不久的将来, 可能会有更多的与根瘤形成有
关的小分子RNAs被鉴定。因此, 更多转录因子及其
靶位启动子的证实和生物学活性的探明, miRNAs
的分离及其功能研究, 特别是豆科植物特异性的
miRNAs的研究, 应是未来豆科植物-根瘤菌共生互
作领域的一个研究热点。
6.3 根瘤形成的进化研究
前文述及的参与根瘤形成的激酶、转录因子等
调控基因同时也参与了侧根的形成, 或者与植物和
菌根真菌的共生互作有关, 后者是一个植物王国中
更为广泛、更为古老的共生体系; 并且, 已经分离
到的大多数结瘤素基因, 包括调控基因在内, 都能
在非豆科植物中找到同源序列, 其中包括激酶、转
录因子等参与调控的基因。Szczyglowski和Amyot
(2003)认为, 在进化过程中, 豆科植物可能是通过
利用植物业已存在的发育调控机制或其中的调控
因子建立起与根瘤菌的共生关系的。因此, 不难想
象, 在豆科植物与根瘤菌的共生互作中, 植物可能
通过对根形态发生的调控方式的重新调整, 而不是
或不完全是通过产生新的蛋白质来促使根瘤形成。
豆科植物之间、豆科植物与非豆科植物之间比较基
因组学的研究将有助于解答这个问题。
6.4 AON信号途径的明确及其对环境因子的响应
根瘤的形成是共生体系内部的信息交流及其
与环境因子相互作用的结果, 这就需要一个能将
内、外信号链接起来的系统调控方式。与NF信号体
系相比, AON信号途径正是这样一个不仅能对共生
体系内部信号(如NF)作出反应, 同时还能对外界环
境因子(如氮素浓度)作出回应的系统调控体系。某
些环境因子(如氮素营养)对共生结瘤的影响也许就
是通过AON实现的。然而, 目前关于AON的研究才
刚刚起步, 其信号传递的具体途径仍不明确, 这需
要进一步分离AON相关基因并对其功能进行研究。
同时, 环境因子影响根瘤发育过程的分子机制问
题, 也是目前共生固氮研究领域里的一个薄弱环
节。应用反向遗传学手段, 将AON信号传递体系与
环境因子, 特别是不同结合态氮素对结瘤的影响相
结合, 将更有利于揭示这一豆科植物特有的自主调
控方式。
致谢 陕西省自然科学基金(2009JM3011)和西北农
林科技大学基本科研业务费专项资金(QN2009068)
资助项目。华中农业大学农业微生物学国家重点实
验室生物固氮研究室给予支持, 在此表示感谢。
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责任编委: 高玉葆 责任编辑: 王 葳