全 文 ：第 l2卷 第 l期
2 0 0 4年 1月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．12 No l
Jan．， 2004
红曲霉 SAGE文库中双标签的制备研究
熊勇华 许 杨 赖卫华
c麦育 鑫 譬南昌s 教部食品科学重点实验室 ⋯ ⋯⋯
摘 要 研 究探讨 了红 曲霉 SAGE文库构 建过 程 中总 RNA提取 、mRNA分离纯化 、cDNA合成 以及双标签(Ditags)
制备 方法，并通过 PCR条件 的优化获得双标 签 PCR的最佳模板稀释浓度及扩增循环数 。
关键词 红曲霉 SAGE文库 双标 签
Preparation of ditags in constructing SAGE library of Monasccus Ruber．X10NG Yong—Hua．XU Yang，LAI Wei·Hua
(Sino-Germany Joint Research Institute，Nanchang 330047)，CJEA，2004，12(1)：19～22
Abstract In this paper，the methods of total RNA and mRNA extraction，cDNA synthesis and ditags preparation are
discussed in constructing SAGE library of Monasccus Ruher The optima1 concentration of template and the number of
PCR cycles are obtained by optimizing the PCR conditions．
Key words Monasccus ruher．SAGE library，Ditags
红曲霉(Monasc“S ruber)为典型丝状真菌 ，红曲药用价值近年 已引起许多学者关注，尤其是红 曲发酵液
中诸多生物活性物质的发现，将国内外红曲研究推向新高潮。1995年法国学者 Blanc P．J． 在红曲霉发酵
产物中检测到 1种对人畜有害的真菌毒素——桔霉素(Citrinin)，使红曲霉产品在世界范围内应用受到限
制。随后几年该课题组通过同位素标记对红曲霉产毒(桔霉素)的生化代谢途径以及桔霉素与红曲色素，
Monacolin类生理活性物质的产生关系进行深入探讨 ，认为桔霉素的产生与红曲霉以上次生代谢产物的代谢
途径密切相关 。本实验室以往研究亦得到同样结论，并同时发现桔霉素的产生与红曲霉培养方式及培
养基组成有显著相关性。同一菌株不同条件下可能产毒或不产毒，以上结果预示红曲霉产桔霉素是其基因
组固有特性，不同条件下产毒差异的形成可能与外界因素诱导基因组产生差异表达有关。通过分子生物学
手段，若能获得同一菌株产毒与非产毒条件下其转录组 mRNA的所有信息，不仅为筛选与产毒相关的连锁
基因提供理论依据，且对分析红曲霉代谢过程中代谢网络的分布以及调控机制提供重要信息。基因表达的
系列分析(Serial analysis of gene expression，简称 SAGE)是以转录子 (cDNA)上特定 区域 9～1lbp的寡核苷
酸序列作为标签(tag)特异性代表该转录子 ，然后通过连接酶将多个标签(20～60个)随机串联并克隆到载体
中，建立 SAGE文库 · 。通过对全部标签的序列分析可获得基因转录的分布以及表达丰度状况(尤其可
检测低丰度表达基因)，从而充分了解基因转录组全貌。探讨基因组在特定时期转录水平的表达丰度以及表
达差异，可为研究基因组功能提供重要信息。本研究探讨了构建红曲霉 SAGE文库中双标签形成的实验过
程及其注意事项，为建立完整的SAGE文库奠定理论基础。
l 试验材料与方法
供试菌株为“AS3，4384”(橙色红 曲霉 ，Mo 口sf“s aurantiaeus)，红曲霉菌丝体的获得是将“AS3，4384”菌
株接种至土豆葡萄糖培养基，于 3512下 150r／min摇床培养 66h，收获菌丝体并用 PBS冲洗3次后抽滤除残
留水分，一70℃保存备用。
菌丝体总 RNA提取及完整性检测 。采用并改进的异硫氰酸胍方法，即将变性匀浆液抽提之前 ，菌丝
体采用液氮研磨成浆 (30rain以上)，异丙醇沉淀 RNA后 ，RNA—free水溶解 。3倍体积的 4mol／L NaAc 2次
沉淀 RNA，0℃过夜 ，1，3万 r／min离心 15min，75％乙醇洗涤沉淀 2次，空气干燥后备用 。RNA—free水溶解 ，
以紫外分光光度法确定总 RNA纯度及含量，一70*(2保存备用。
*江西省自然科学基金项目(0330040)资助
收稿 日期 ：2002一¨ 一28 改 回日期 ：2003—01—30
20 中 国 生 态 农 业 学 报 第 12卷
mRNA纯化与检测。根据 Promega公司产品说明书 ，采用 lmL磁珠 、5 L生物素偶合的 o1ig0(dT) 分
离 1mg总 RNA中的 mRNA，采用溴化乙锭点定量法测定 mRNA含量。
eDNA合成。参照 Invitrogen公司产品说明书 ，5 g RNA—free水溶解的 mRNA及 2．5 g5’生物素一oligo
(dT) 引物按说明书将 mRNA反转录成双链 eDNA。eDNA第 2链合成完毕后，等体积饱和酚／氯仿／异戊醇
抽提 ，上清液采用糖原法沉淀 eDNA(200txL样品加入 133~L 7．5mol／L NH OAC，3／xL 20rag／mL的糖原及
777~L无水 乙醇)，0℃静置 30min，于 4K?1．6万 r／min离心 30min，70％乙醇洗涤沉淀 2次，空气干燥后 20 I
DNA—free水溶解备用 ，取 5／xL电泳检测 cDNA的完整性。
双标签制备。取 10#L双链 eDNA加入 5tL Nlam(50单位)37℃酶切 反应 60min，之后加入等体积饱和
酚／氯仿／异戊醇抽提，糖原法沉淀酶切产物，沉淀溶解于 20txL Tris缓冲液 中。将酶切后 cDNA等分为 A、B 2
份 ，磁珠法吸附 eDNA 3’端酶切产物。将 100ng接头 A1及接头 Bl(接头序列见表 1)分别加入吸附有 eDNA 3’
端酶切产物的磁珠 A、B中，于 l6℃反应 l50rain后缓冲液洗涤磁珠 3次 ，加入 4单位 Bsmf I 65℃酶切反应
60rain，期问每隔 3～5rain摇匀磁珠 1次 ，反应结束后磁架分离磁珠并弃磁珠 ，上清液加入等体积饱和酚／氯
仿／异戊醇抽提 ，糖原法沉 淀标签 ，10t~L Tris缓冲液溶解沉 淀得 A2、B2两溶 液。加入 6单位 Klenow酶 、
25肛n1o1 dNTP，于 37℃反应 30min，上清液加入等体积饱和酚／氯仿／异戊醇抽提，糖原法沉淀标签 ，8／xL Tris
缓冲液溶解 A2、B2两沉淀，将 A2、B2溶液加入 2单位 T4连接酶，于 16℃连接过夜，同时设立阴性对照：
表 l 接头 A与 B正 、负链 引物序 列
Tab l The sense and unsense primer sequences of linker A and linker B
Sense linker A 5’TTT GG A TTT GCT GGT G(’A GTA CAA C1’A GGC TTA ATA GGG ACA IG一3’
Unsense linker A[amino mod C7：3’CCT AA． CGA(’CA CGT CA1、GTT( T CCG AAT FAT CCC Tph0sph0r lated一5
Sense linker B 5’T FT CTG (71、C GAA TTC AAG (”I F(、TA ACG T(； l、(、GGG GAC ATG-3’
Unsense linker B[amino mod (、7：3’一GAC GAG( I—I AAG TTC( A GAT FG(、TAC AT(；-(CCCT—phosI)horylated5’
*接 头末端磷酸化效果采用 自身连接反应验证：
PCR扩增双标签。将连接产物分别按 20倍 、50倍 、100倍和 200倍稀释 ，以之为模板进行 PCR扩增 ，同
时设立阴性对照。上游(引物 I)和下游(引物 Ⅱ)引物序列分别为 Upper primer 5’生物素一GGA TTT GCT
GGT GCA GTA CA 3’；Lower primer 5’生物素一CTG CTC GAA TTC AA( CTT CT 3’。扩增体系为 pH值
8．8，模板为 2％，Mg 浓度为 6．7／mml／~L，dNTP为 1．5／mlol／tL，引物 为 7ng／／~L，Platium Taq(热 启动
DNA聚合酶)为 0．1单位 L，二 甲基亚砜 0．06％。扩增条件为 95℃下 2rain 1个循环，95℃下 30s，55℃下
1min．70℃下 1min，25～30个循环 ，最后 70 、延伸 5rain：
2
图 1 红曲霉总 RNA甲
醛变性 电泳 图谱
2 结果与分析
2．1 红曲霉总 RNA的提取
制备高质量总 RNA对能否获得长片段 eDNA以及足量标签序列至关重要，同
时高质量 RNA是保证 SAGE文库中含有所有转录组完整信息的前提 红 曲霉属
典型丝状真菌 ，在液体摇床培养下菌丝体常缠结成球形，且因真菌细胞壁较厚实和
坚硬 ，故采用常规异硫氰酸胍方法难于将细胞 内 RNA释放出来 ：本研究采用液
氮碾磨红曲霉菌丝体可充分破碎细胞壁 ，且超低温环境有效抑制 RNA酶活性 ：真
菌生物含丰富多糖类物质 ，采用异硫氰酸胍方法获得的总 RNA常混有大量多糖类
物质及微量异硫氰酸胍污染 ，而异硫氰酸胍是 1种蛋白质强变性剂，在后一步 mR—
NA分离过程中使磁珠上亲和素蛋白变性 ，从而导致 mRNA提取率下降甚至失败一
本研究采用 3倍体积 4mol／L NaAC 2次沉淀 RNA，获得的总 RNA经紫外分光光
Fig 1=。 NA1(】 ? 度法检测230nm、260nm、280nm 3处吸光值，测定结果为OD! 。 ： =2．2，
SCus ruber eletropnores~s
*泳道1为10 g总RNA， OD 。 。 =2．1，这表 明该法 提取的总 RNA无 蛋 白质及异硫氰 酸胍污染 ：总
泳道 为 。p．g总R A：RNA甲醛变性 电泳结果(见图 1)显示 28SRNA条带亮度约为 18SRNA条带亮度
的 2倍 ，表明该法获得 的总 RNA分子完整性较好。
第 1期 熊勇华等 ：红 曲霉 SAGE文库 中双标 签的制备研 究
2．2 mRNA分离纯化及双链 cDNA合成
真核生物 RNA中 mRNA含量约 占 l％～5％，且在不同
发育阶段 mRNA水平呈一动态变化过程 。对微生物而言，在
菌体生长发育对数期 mRNA最丰富，但微生物次生代谢产物
多产生在发酵后期 ，此时菌体内 mRNA含量相对较低。本实
验 以 lmg总 RNA为材料采用磁珠法分离纯化 mRNA，通过
EB点定量法测定 mRNA含量结果表明，lmg总 RNA可收获
18t~g mRNA，其得率为 1．8％，表明红曲霉在发酵后期 mRNA
转录仍处于较高水平。红 曲霉属低等真核生物 ，维持生命过
程中蛋白质表达的种类 及蛋 白质结构均 比高等生物简单 ，转
录组 cDNA 片段长 度大多集 中在 300～5000bp间。本实验
cDNA电泳(见图 2)结果显示红曲霉 cDNA分子从 100～10kb
可见明显弥散条带 ，但大部分集 中在 200～4500bp间。
J9．30kb
7 74kb
6．22kb
4．25kb
3．47kb
2．69kb
1．882k
1．49kb
2．00kb
1．00kb
0．75kb
0．50kb
0．25kb
0，l 0kb
图 2 红 曲霉 cDNA琼脂 糖电泳图谱
Fig．2 cDNA of monascus ruber eletrophoresis
*泳道 l为 ·EcoTl4 I Marker，泳道 2为红越霉
cDNA，泳道 3为 DL2000Marker：
图 3 接头 自身连接产物
的反应电泳图谱
酶切
平均
A 片
验将
连接
产物
1种
ⅡS限制性内切酶 ，识别位点为 GGGAC，切割位点距识别位点 10～14bp)
酶切，标签序列从磁珠上释放下来?回收的标签序列采用 Klenow大片段
Fig· T H 。0“ 将粘性末端补平
。 将含有 Adaptor A和 Adaptor B的标签在连接酶作用下
*泳道l为Adaptor A，泳道2为AdaP一 连接形成双标签。PCR扩增引物依据 Adaptor内侧序列设计 ，因此只有含
：’ ， Ad印t。r A、B的双标签才能得到有效扩增。同时由于待扩增的片段均为
泳道5为Adapt。r B自身连接产物： 102bp，在 PCR放大过程 中转录组不 同转录子的丰度信息基本 不发生改
变，因此可有效保证转录组信息原貌 。由于影响PCR扩增 的因素较多 ，双标签扩增过程中PCR bufer~]引
物浓度 、dNTP含量以及扩增循环数对有效获得 目
的片段 ，减少非特异性扩增尤 为重要 。本试验在
参考 VelculeSCU V．E．等 方法基础上对模板稀释
倍数以及扩增循环数进行研究 ，电泳结果(见图 4
和图 5)表明泳道 l3中阴性对照未见任何条带 ，泳
道9～12在 102bp位置可见 明显扩增 条带 。当样
品稀释 200倍时扩增效率大大降低，从泳道 2～7
可见随扩增循环数的增加而非特异性大片段产生
量增多 ，综合考虑扩增效率 以及避 免非特异性条
带产生情况，本研究选择模 板稀释倍数为 100倍，
PCR扩增循环数为 28为最佳条件。
3 小 结
本研究根据丝状真菌细胞壁坚固厚实及多糖
类物质含量丰富等特征，在异硫氰酸胍方法基础
上通过增加液氮研磨， 4mol／L NaAC二次沉淀等
图 4 PCR扩增双标签最佳 图 5 PCR扩增双标 签最
模板稀 释浓度银 染图谱 佳扩增循环数银染 图谱
Fig．4 The optimal dilution of Fig 5 The optimal num～
tempiate in P(、R implification bers in PCR cycles
Big 13为阴性对照 ，Big 9～12模 泳道 l为 DL2000 Mar
． ．
ker·
板 倍数 为 竺 。 泳 7 PCR ~：数
倍和 200倍．PCR扩增循环数为 ⋯ ⋯
30．泳道 8为 DL2000 Marker。
22 中 国 生 态 农 业 学 报 第 l 卷
步骤提取红 曲霉总 RNA，所提取的 RNA产率和纯度等方面均能满足构建 SAGE文 库的要求。采用 P o—
mega公司mRNA分离纯化系统 ，从红曲霉总 RNA中分离纯化 mRNA其得率为 1．8％，并建立了 EB点定量
检测微量 mRNA 的方法。按 SAGE文库 构建 原理 ，成 功扩增 到 102bp红 曲霉 cDNA 双标 签
， 为红 曲霉
SAGE文库的建立奠定 了基础。
参 考 文 献
1 熊勇华，许 杨等 基因表达的系列分析方法研究进展 生物工程学报，2002，18(3)：377～380
2 金冬雁，黎孟枫译 分子克隆实验指南 北京：科学出版社，1998
3 李明春，王俊琦，邢来君等．丝状真菌深黄孢霉 RNA的提取方法 菌物系统，1999，18(1)：108～111
4 Blanc P J ，Laussac J P ，Le Bar J ，et a1．Characterization of monascidin from MotlasccH5 as citrinin lnternationa1 Journal 0f Food Mi
crobiology，1995，27：201～213
5 Hasan Hajaj，Alain Klaebe，Marie Oloret，et al Applied and Environmental Microbiology，1999．65：311～314
6 Hasan Hajaj，Philippe Blanc，Evelyne Groussac，et al Kinetic analysis of red pigment and eitrinin production by Monasccld$R“her as a func
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《中国生态农业学报》征稿启事
《中国生态农业学报》(原刊名《生态农业研究》)由中国科学院石家庄农业现代化研究所和中国生态经济
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