全 文 ：第 ii卷 第 i期
2 0 0 3年 1月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．11 No．1
Jan．， 2003
IJI⋯百熄姆也熄由想商 直独咖全屠 莒售茳捌漪蜘后Ijfl 奎
UJ—兰厶 In 上 ¨ In I ‘ 、，， I‘ ：_聃 ，几 ’业 ，网 月、1J ～ 月 ，r_Jl胍 ’I V， ‘14_J I，0
马永清 水
由 甬 { 肖 睦
(束 莉’r筇水土保持研究所 杨陵 712100)
稻永 忍 杉本 幸裕 Babiker A．G．T．
(日本国鸟取大学乾燥地研究中心 鸟取 680—0001)(苏丹农业研究协同组合 Gezira研究试验站 苏丹)
摘 要 试验 研 究 了从 山豆根 (Menispermum dauricum DC．)组 培 根 中提取 、分 离独 脚金 属 杂革 『Str Pr n 拍 —
ca(De1)Benth]发芽刺激物质 ，其提纯、分离过程是首先将发芽刺激物质吸附在 XAD-4树脂表面后采用甲醇脱洗，
通 过 乙酸 乙脂 ：水 分 配提 取 ，活性 物质 在 一t-~p L·au~ex L}{2O开 口型人 工填 充 柱 上进 行 柱 层 析 ，活性 组 分合 并 后进 一步
采 用 商业提 供 的 C18 Sep—Pak(10g)柱 进行 柱 层析 ，之后 采用 分取 和 分 析高 效 液 相 色谱 提 纯 、分 离，每 一步 提 纯过 程
中均采 用 Striga种 子发 芽 实验 鉴定 活性 物质 的存 在 。高 效液 相色 谱分 析表 明有 3种活 性 物质 ，其 中主要 活 性 物质
与 Strigol有十分相似的色谱特性，最后经质谱鉴定为 Strigol或 Strigol类似物质，并首次报道 Strigol是植物的代谢
产 物 。
关键词 独脚金属杂草 山豆根 发芽刺激物质 分离 鉴定
L~o!ation of a ge_．,~n_inatlon stimulant for一,~⋯tri。o—n hermonthicu(De!)Benth from root culture of Menispermum dauricum
DC．MA Yong—Qing(Institute of Soil and Water Conservation，Chinese Academy of Sciences and Ministry of Water Re—
sources，Yanging 712100)，Shinobu iNANAGA，Yukihiro SUGiMOTO (Arid Land Research Center，Tottori Universi—
ty，Hamasaka，Tottori 680—0001)，Babiker A．G．T．(Sudan Agricultural Research Co rp．，Wad Medni，Sudan)，CJEA，
2003，11(1)：1～5
Abstract In this paper the isolation and purification of Striga kermontkica germination stimulant from M enispermum
daurlcum DC．root culture filtrate are reported．Purifcation and isolation were undertaken by absorption of the stimulants
onto XAD-4。solvent partitioning into ethyl acetate，and further separation on Sephadex LH20，C18 Sep—Pak Cartidge；
preparative and analytical HPLC columns．Each step involved in the isolation procedure was folowed by a bioassay using
conditioned S r拓蹿 hermonthica seeds．Three stimulants were detectcd in the filtrate． on⋯IJD I uf~thc maj。or otl‘mu’mnt
showed similar chromatographic behavior and CO—eluted with authentic strigo1．Furtherm ore。its UV and Mass spectra
were similar with those repo rted for strigol and strigol—like molecules．In this study，albeit no novel Striga germ ination
stimulant was isolated from M ．dauricum ro t culture，the investigation represents the first repo rt on isolation of strigol
or strigol—like molecule from tisue culture．Moreover，it provides unequivocal evidence that strigol and strigol—like mole—
culas are of plant origin．
Key words Striga weeds，M enispermum dauricum DC．，Germ ination stimulant，Isolation，Identification
据报道，独脚金属杂草共有 35种，其中有 l1种对农 田造成危害⋯，对人类经济生产造成巨大损失的是
“Striga hermonthica(Dei)Benth”和“Striga asiatica L，Kuntze”，2种杂草主要寄生于禾谷类作物 ，S．her—
monthica 主要分布于非洲及阿拉伯国家 ，S．asiatica则分布较广，除非洲广为分布外 ，还在东南亚(包括我国
南方部分省 市 )也 有分 布 。独 脚 金 属 杂 草 很 难 防 除 ，主 要 是 其 生 态 适 应 性 强 ，其 种 子 体 积 小 (0．2～
0．4mm)，1株植物可生产 3．7～5万粒种子 ，这些种子数量巨大且在土壤中可保持生存力长达 20年以
上 。但其种子发芽必须依赖于 1种外源刺激物质 ，在 自然条件下这种发芽刺激物质是 由寄主或非寄主
植 叨 明 脸根 提 供 明 ，获 得 ]【亥物 庾 后 ，脸 根 口J在 24h内长 出 种 反 ，之 后 在 吸 器 彤 成 诱 导 物 质 的 作 用 下 很 快 形 成
吸器 ，与寄主根吸着并穿入根中后与寄主根的木质部形成联结，从寄主植物那里竞争夺取水分／养分及生长
*该项研究工作是论文第一作者在中国科学院石家庄农业现代化研究所选派到日本攻读博士期间完成 ，得到同事们大力支持，谨表谢惹!
收稿 日期：2002—07—12 改回日期：2002—07—24
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2 中 国 生 态 农 业 学 报 第 11卷
激 素 ，在地下 开始生 长 ，出芽前约需 48～56d，这段时间里独脚 金属杂草对 寄主造 成相 当大 的危 害 。
科学家们经多年的研究探索 ，认为若在无寄主植物根存在或离其较远条件下将 Striga种子诱导发芽
后 ，不给 予寄生 的条 件从 而形成 自杀 发芽是 Striga防除 中最有 效 的方法 之一 。 目前 已有数 种 Striga发芽
刺激物质从寄主或非寄主植物的水耕栽培液中分离出来，但这些物质大多数是 Strigol(1种四环倍半萜烯)
或 Strigol类似物 ，这些类似物的人工合成已获成功，这些类似物的化学构造与 Striga发芽之间关系也正
在研 究 中，但 目前 因上述物 质在 土壤 中安定 性 不高 ，尚不能 在生 产 中应 用"]，且 以往 的研 究 多 采用 水耕 栽
培 ，在这种条件下很难维持无菌状态 ，而这些物质是否为植物代谢产物一直是该研究领域 尚未解决 的问
题 。笔者研究从中草药山豆根(Menispermum dauricurn DC．)组培根中寻找 S．hermonthica发芽刺激物
质 结果表明，非寄主植物培养根分泌 Striga发芽刺激物质 ，本文报道发芽刺激物质的分离及鉴定结果。
1 试验材料与方法
“S．hermonthica”种子于 1996～1997年由本研究合作者 Babiker A．G．T．教授在苏丹农业研究协同组
合 Gezira研究试验站收集(前茬作物为高粱)，种子消毒采用 Parker等 们¨描述的方法，将种子用含 0．5％有
效成 分的次氯酸钠 溶液浸 泡 3min，此 间连续搅拌 以使种子 表面与次氯 酸钠溶液充 分接触 ，3min后用 消毒蒸
馏水充分冲洗直至无色为止，种子消毒后晾干收藏备用。在直径 90ram×高 20mm培养皿 内加入 6mL消毒
蒸馏水后 ，在滤纸 上均匀置放直径 约 8ram 的玻璃滤 片 ，将 20～60粒种 子 消毒后均 匀播 于滤纸 上 ，培养皿 用
Parafilm密封 后置 30℃培养箱 中培养 12～15d¨ 。取分 离提取 的溶液 20 L加 入培养皿 内预 先放 好的玻 璃
滤片上，置室温下 1h以挥发有机溶剂，之后在其上面放入预培养后的种子(用滤纸除去多余水分)并加入
40,uL蒸馏水 ，处理后种子在培养箱中培养 24h，于 目镜为 20倍的解剖镜下观察记录发芽与未发芽的种子数
量 ，若胚根长出种皮即认为该种子已发芽 ，每处理重复 3次 ，发芽数据经反正弦处理，分析处理间差异性后进
行 Back Arcsine Transformation处理 。
山豆根组培根的培养是在黑暗条件下置于 70r／min的恒温(27℃)摇床内进行，采用经过修饰的 B5液体
培养基 ，该 培 养 基 中 含 37．5mmol／L纯 N(No ／NH4+ 比率 为 1：42)、0．1mmol／L Fe¨ 、1．0mmol／L Ca¨ 、
0．55mmo1]L无机磷 、0．28mmol／L肌醇、4．1mmol／L烟酸、3．7mmol／L盐酸吡哆辛、14．8／lmol／L盐酸硫胺、
1．0／lmol／L NAA和 4％的蔗糖 ，组培根 培养 56d后 ，将生长过 山豆根 的培养液过滤 ，收集置 4℃恒温室储藏备
用。将过滤后的培养液用 XAD一4树脂吸附，然后用 甲醇脱洗，再经减压浓缩，将 1玻璃柱(50mm×400mm)
用 500g XAD一4树脂充填后 ，用蒸馏水充分洗柱上载过滤培养液至饱和，其饱和的检查则通过将流出柱的溶
液用独脚金属杂草种子发芽实验来决定。将达到饱和的 XAD-4树脂从柱中取出，加入甲醇后在超声波处理
器内常温提取 5次(每次 500mL)，用旋转蒸发仪除去甲醇后将残留物置低温冻干机冻干，将 20L过滤培养
液经 XAD一4树脂处理后的残留物溶于 150mL蒸馏水中，用乙酸乙脂萃取(每次 400mL)，用旋转蒸发仪除去
甲醇后再将残留物溶于 5mL的甲醇 ：水 =1：1溶剂中。将 1个(35mm×400mm)玻璃柱用溶于甲醇 ：水为
1：1的 Sephadex LH20填充至 350mm高度 ，将经乙酸 乙脂萃取的残留物上柱 ，控制流速为 0．40ml／min，每
25min收集 1个样品，共收集 100个样品。经发芽实验(原液和稀释 50倍)后合并有活性的组分，除去溶剂
后再溶于 10mL蒸馏水 中注入 C18 Sep—Pak柱中 ，进 样 之前 C18 Sep—Pak柱 (10g)先用 50mL甲醇 清洗后 再
用 50mL蒸馏水活化，进样后采用 0％～100％(v／v)甲醇 ：水溶液[以 10％(V／V)浓度递增]各 50mL进行洗
柱 ，每种溶液 的流 出液分别 收集 在试 管 中(10mL 1个样 品)，然后 进行 发芽试 验 。经 C18 Sep—Pak柱层 析分
离后的活性物质溶于 2mL甲醇中，用岛津公司生产的高效液相色谱分析仪进行分取 、分离 ，分取液相采用
ODS—UG一5(20mm×250mm)分取柱 ，采用 65％甲醇 ：水 (v／v)作流动相 ，流速 为 6．Oml／min，紫外 吸收为
245nm，分析液相采用 CN—UG-5(250mm×4．6mm)高效液相色谱分析柱中，采用 50％甲醇 ：水作流动相 ，流
速为 0．5ml／min，紫外吸收为 245nm，进样后每 min收集 1个流出样，分别进行生物测定 ，Strigol也在同样条
件下进行 ，经分析液相色谱柱分离的活性物质除去溶剂后进行质谱分析，采用 Joel JMS—AX505HA电子撞击
质谱仪 ，探测器温度逐渐从 50℃增至 210℃ ，离子化能和发射电流分别为 70eV和 300 。,uA
2 结果与分析
发芽刺激物质能高效吸附在 XAD·4树脂表面，稀释后的提取物发芽实验结果表明大多数活性物质经提
取 4次后可提取出来(见表 1)，第 1次、2次、3次、4次提取物在未稀释时诱导发芽率分别为 79％、79％、80％
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第 1期 马永清等：从山豆根组培根 中提取 、分离独脚金属杂草发芽刺激物质的研究 3
表 1 从 XAD-4树 脂表 面提 取 S．hermonthica发 芽 刺激 物质 的效 率
Tab．1 Efficiency of extracting S．hermonthica germination
stimulants from XAD一4 resin
*括 弧 内 是 反 正 玄 转 换 数 据 。
合并所有从 XAD一4树脂 上提 取 的活 性 物 质 (源 于 20L
过滤培养液)，除去溶剂后得 25．6g干物质，经乙酸乙脂萃取
后得活性物质 1．8g。乙酸 乙脂萃取物在浓度为 1．0mg／mL
时可诱 导 43％的独脚金属种 子发 芽(见表 2)，稀释 10～1000
倍 时发芽率为 56％～94％ ，稀释 1万倍 时仍有较 高的发芽刺
激诱导能力 ，发芽率为 56％。经乙酸 乙脂 萃取的活性物质
上 Sephadex LH20充填柱进行柱层 析 ，顺序 分离 出的物质 发
芽实验表 明大部 分活 性物 质集 中分 布 在 27个 样 品 中(见 图
1)，发芽率最高 (89％)的样品其分取数为 50。活性组分合
并后得 900rag干物质 ，未稀释的样品(1．0mg／mL)虽仅诱导
45％的发芽率，但稀释 1万倍的样品仍保持较高(76％)的发
芽率(见表 2)。经 Sephadex LH20充填柱进行柱层析分离的
活性物质 进一步再用 C18柱层 析 可 回收 20mg干物 质 ，表 2
可知未稀释的样 品、稀释 10倍、100倍 、1000倍 的样品均诱
导独脚 金属杂草种子 发芽 能力较 高 ，发 芽率 为 58％～91％，
稀释 1万倍后其发芽率明显降低。
表 2 提纯 过程 对 山豆 根培 养液 中分 离 s．hermonthica
发芽 刺 激物 质活 性 的影 响
Tab．2 Activity of S．hermonthica germination stimulants from
M ．dauricum culture filtrate as influenced by purification procedure
稀 释倍 数
Dilutions
发芽率／％ Germ ination ratio
乙酸乙脂 LH20充填柱 C18柱
Ethyl acetate Sephadex LH 20 C18 Sep。Pak
*括弧内是反正玄转换数据 ；未稀释样品浓度为 1mg／mL。
和 56％，但当稀释 1000倍和 1万
倍时第 1次、2次和 4次的提取物
诱导很 少 (16％～26％)和可 以忽
略(1％)；而第 3次提取物表 现出
较高发芽刺激能力，分别为 48％和
38％；第 5次 提取物在未稀 释、稀
释 10倍 和 100倍 时可 分 别刺 激独
脚金 属 杂 草 发芽 率 为 57％ 、43％、
22％；第 6次提取物在稀释 10倍后
几乎丧失刺激发芽的活性 (发芽率
为 7％)。
图 l 山豆根 培养 根过 滤培 养 液在 Sephadex LH20
充填 柱上 层析 发 芽 实验结 果
Fig．1 Stimulant from M ．dauricum culture filtrate
separated on Sephadex LH20．
*活性物质用1：1甲醇：蒸馏水(v／v)洗提，每25rain收集lOmL样
品，取20t&稀释50倍后进行发芽实验，垂直的棒表示标准差。
经 C18柱层 析 后 的 活性 物 质 进行 分 取 液 相
色谱分析，图2表明从分取柱 中流出的有 3组活性
物质 ，它们在液相中滞 留时间(t )分别为 17min、
19rain和 31min，分别称之为 A、B和 c组分 ，将这
些组分进行 100倍稀释后，组分 A和 B均无刺激
独脚金属种子发芽活性 ，而组分 c尚保留 30％的
发芽率。经分取液相分离的组分 c进一步进行分
析液 相分离 ，其结果 是在滞 留时间为 19rain和
20min时组 分 C有活性物 质出现 ，稀 释 100倍后 仅
在 20min时有活性物质出现 ，其发芽率为 60％(见
图 3)。
单独分析合成的 Strigol和从山豆根中分离出
来 的发 芽 刺 激 物 质 时 两 者 在 同 一 滞 留 时 间
(tn20min)出现，在对比液相分析时两者以 1个吸
收峰的形式出现 ，同样分析条件下合成的独脚金
属杂草发芽刺激物质 Sorgolactone在滞留时间为 24min时出现吸收峰(见图 4)。
从山豆根中分离出来的发芽刺激物质具有同 Strigol类似物十分相近的紫外吸收光谱(见图 5)，同时其
在质谱图上显示 出同样的分裂特征 ，两者相同的离子峰(见图 6)分别是 C5 H5 02(m／e 97)、C 。H 04(role
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中 国 生 态 农 业 学 报 第 1l卷
鉴定 。
善
鲻
>
避
诗
保持 时1日J／mm
图2 C18柱层析后的回收物在分取液相ODs．UG。5
12one~25Omml中分析结果
Fig．2 Preparative HPLC ODS-UG-5(20mm 250ram)
analysis 0f residue of C18 Sep-Pak Cartidge
流动相为甲醇水溶液(65％)，紫外检测波长为245nm，流速
为6mI／rain,流出组分每lmin收集 1个样品，稀释 100倍后与
末稀释样品一同进行发芽实验．垂直的棒表示标准差。
光谱长度／rim
图4 从山豆根培养根中分离出独脚金属杂草发芽
刺激物质的紫外吸收光谱
陬 4 uv trum of Striga germinati。n stimu from
M．da“ricum culture fikra~
插图是合成的Stri l和Sorgolact。ne的紫外吸收光谱。
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图3 分取液相分离的组分c进行分析液相色谱分析
cN．UG．5l4．6minx 250mm)
Fig．3 Analytical I-IPLC CN-UG-5(4．6ram 250mm)
s∞aration 0f preparative HPLC purified frac1 0n L，’
流动相为甲醇水溶液(5O％)，流速为0 5ml／min,流出
组分每 lmin收集1个样品，稀释1oo倍后与未稀释
样品一同进行发芽实验，垂直的棒表示标准差。
保持时间／rain
图5 Stri# 。Sorgo!actone和从山豆根培养根中分离出
主要独脚金属杂草发芽科激物质对比色谙
Fig．5 Co-chrorntography of strigol，~rgda吐 ，and删 。
s￡却 gemilati0n stimulant[mm M． uric删 culture fihrate
采用的色谱柱，流速及流动项同图3。
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第 1期 马永清等：从山豆根组培根中提取 、分离独脚金属杂草发芽刺激物质的研究
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图 6 从山豆根培养根中分离的 Strigol和合成的 Strigol质谱图
Fig．6 Mass spectra of strigol isolated from M ．dauricum culturefiltrate(A)and authentic strigol(B)
发芽刺激活性。与之相反 Cl8柱层析仅回收 2．2％的干物质，同时高倍稀释后样品失去活性 ，表明该分离方法
使样品有较大的损失，本研究采用 C18柱层析导致样品活性下降与 Strigol及其类似物十分不稳定 的特性相
关。而生产量低及高度不稳定一直是限制这类化合物分离、提纯的障碍 J。
本研究虽未能从山豆根培养根中提取 、分离出稳定性好的独脚金属杂草发芽刺激物质 ，但本研究首次报
道了从植物组培根中分离出 Strigol及其类似物 ，证明 Strigol及其类似物是植物的代谢产物。而以往诸研究
是采用水培的方式获得发芽刺激物质 ，其中难以区分代谢产物究竟是来 自植物抑或是微生物。
致谢 该研究系第一作者在 日本留学期间部分研究工作内容，谨此感谢 日本学术振兴会和日本文部省的资助。
1
7
8
参 考 文 献
Raynal—Roques A．Diversification in the genus Striga．Proceedings，5th International Symposium on Parasitic W eeds．Nairohi：CIM MYT，
1991．251～261
Parker C．．Riches C R．Paracitic Weeds of the W orld Biology and Contro1．CAB International W allingford．1993．332
Laing E．Striga hermonthica：its adaptations and distribution in Ghana．Striga Biology and Co ntro1．Ottawa：ICSU Press．1984．63～7O
Mussdman L．I．(eds．)．Parasitic Weed in Agriculture．Volume I．Striga．Boca Raton：CRC．Pres，1987．317
Saunders A．R．Studies in phanerogamic parasitism，with particular reference to Striga lutea Lour Science Buletin，1933，128：56
Siame B．A．，W eerasuriya Y．，W ood K．，et a1．Isolation of strigol，fl germination stimulant for Striga asiatica from host plabts．Journal of
Ag ricultural and Food Chemistry，1993，41：1486～1491
Vail S．L．，Eplee R．E．，Norris R．S．Synthesis and testing of strigol and strigol an alogues．W itchweed Research and Co ntrol in the United
States．M onograph 5．Champaign IL：W eed Sc ience Society of America．1990．43～46
Joel D．M ，Steffens J．C．，Mathews D．E．Gel’ruination of weedy root parasites．Seed Development and Germination New York：Marcel
Dekker．1995．567～ 597
9 Ma Y．Q．，Babiker A．G．T．，Al I．A．，et a1．Benth germ ination stimulant(s)from Menispermum dauricum (DC．)root culture Journal
of Ag ricultural and Food Chemistry，1996，44(10)：3355～3359
10 Parker C．，Hitchcock A．M ．，Ramaiah K．V．The germ ination of Striga species by crop ro t exudates．techniques for selecting resistant
crop cultivars．In Proceeding s Asian—Pacific W eed Sc ien6e Society 6th Co nference．Jakarta：Asian-Pacific W eed Sc ience Society，1977．67
11 Cook C．E．，W hichard L．P．，W all M ．E．。et a1．Germ ination stimulants II．The structure of strigol—fl po tent seed germination stimulant
for witchweed(Striga tutea Lout．)．1ournal of American Chemical Society，1972，94：6198～6199
{jtl 灌
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