全 文 ：第 13卷 第 2期
2 0 0 5年 4月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．13 No．2
April， 2005
抗生素对高梁茎尖再生的影响及再生体系的建立*
林 风 张春宇 王洪岩
(沈阳农业大学生物科学技术学 院 沈 阳
陈 丹 石太渊
110161)(辽宁省农业科学院 沈 阳 110161)
摘 要 研究羧苄青霉素、头孢霉素、潮霉素和卡那霉素 4种抗生素对高粱茎尖再生的影响及再生体系的建立结
果表 明，MS培养基 中添加甘氨酸、乙二胺 四乙酸 的铁络合物(Fe—EDTA)和抗坏血酸等有机物有利于高粱 茎尖的分
化与生长。农杆菌介导的高粱茎尖遗传转化过程 中羧苄青霉素为最理想抗 生素，最佳 浓度为 250mg／L。并初步确
立 了高粱茎尖农杆菌介导的遗传 转化过程 中抑菌和转化体 的筛选策略。
关键词 抗 生素 高粱茎尖再生 再生体 系 遗传转化
Effect of antibiotics on the regeneration of sorghum shoot and the establishment of sorghum regeneration system ．LIN
Feng。ZHANG Chun Yu，WANG Hong—Yan，CHEN Dan(College of Biosciences and Biotechnology，Shenyang Agricul—
tural University。Shenyang 110161，China)，SHI Tai—Yuan(Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang
110161，China)，CJEA，2005，13(2)：74～76
Abstract The efect of 4 kinds of antibiotics(Cb，Cef，Hyg，Kan)on the regeneration of sorghum shoot and the estab—
lishment of sorghum regeneration system were tested．The results indicate that the MS with glycine，Fe—EDTA and vita—
min C is the best regeneration medium for sorghum sho t．Meanwhile，250mg／L of agrobacterium is the most suitable an—
tibiotic concentration for Cb in genetical transformation of sorghum sho t and the screening tactics of anti—fungus and
transformed tissue are established、
Key words Antibiotics，Regeneration of sorghum shoot，Regeneration system ，Genetical transform ation
(Received Dec．23，2003；revised Feb．12，2004)
国内外学者一直致力于农杆菌转化单子叶植物的研究 ，并 已在水稻⋯、小麦 J、大麦 和玉米 l5]等单
子叶作物中得到转基因植株。体细胞再生体系的建立是作物转基 因育种 的基础，不少高粱基因型材料因难
以建立体细胞再生体系，而影响了高粱转基 因的育种进程。由于高粱茎尖培养不受基 因型的限制，其任何
品种都能形成再生植株，可利用茎尖培养和农杆菌介导法把 目的基因转人高粱作物中，进而选育出优 良转
基因植株。目前国内有关高粱的遗传转化研究 尚少见报道。本试验研究 了抗生素对高粱茎尖再生的影响
及再生体系的建立 ，为寻求高粱育种的新途径提供理论依据。
l 试验材料与方法
供试高粱品种 (系 )包括 恢 复系 “115”和 “0—30”，保 持 系 “121B”和“124B”，杂 交种 “124A／8001”和
“7050A／001”等，均由辽宁省农业科学院高粱研究所提供。培养基设 5个处理，即处理 I为 MS培养基无机
成分 +B5培养基有机成分 +7．7mg／L甘氨酸 +74．6mg／L乙二胺四乙酸的铁络合物(F E【)rA)+0．2mg／L硫
胺素 +10mg／L抗坏血酸 +100mg／L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+0．5mg／L 6一苄基腺嘌呤(BAP)+0．25mg／L
吲哚乙酸(IAA)+0．25mg／L激动素；处理 Ⅱ为 MS培养基无机成分及有机成分 +100mg／L肌醇 +40mg／L
维生素 Bl+0．1mg／L激动素；处理 Ⅲ为 N6培养基无机成分及有机成分 +0．1mg／L激 动素 +100mg／L
PVP；处理Ⅳ为 T5培养基无机成分及有机成分 +0．1mg／L激动素 +100mg／L PVP；处理V为 LS培养基无
机成分及有机成分 +0．1mg／L激动素 +100mg／L PVP。选取籽粒均匀饱满一致的高粱种子，用 10％次氯
酸钠溶液浸泡 15min，再用无菌水洗净后置已灭菌培养皿中，每培养皿 50粒种子加无菌水(至浸没种子 1／2
处为宜)置 30℃培养 箱 内暗发芽 ，培养 2～3d后 取高粱 芽茎尖 ，逐层 剥离 ，于解 剖镜 下用手 术刀 切取
*辽宁省科委项目“农作物体细胞抗性突变体筛选和外源 DNA转导研究”部分研究内容
收稿日期 ：2003—12-23 改回日期 ：2004—02-12
第 2期 林 凤等 ：抗生素对高粱茎尖再生的影响及再生体系的建立 75
0．3mm×1．0mm原基接种于固体培养基上，14d后观察其茎尖再生率和死亡率。取恢复系“115”原基分别
接种在处理Ⅱ附加不同浓度 4种抗生素固体培养基上，观察统计茎尖再生率和死亡率。抗生素抑菌效果试
验采用农杆菌“EHA105”菌种，内含 PKUB质粒 ，该质粒包含 npt I、hph、Gus和 Bt基因。挑取单菌落农杆
菌于 5mLYEP液体培养基中培养(28*(2)48h。然后取上述培养 表1不同培养基对高粱恢复ji5-115”茎尖再生的影响
物 25t_L移人添加不同浓度抗生素的(5mL)YEP液体培养基中 Tab·1 The efect of diferent media on the
振荡培养(28℃ ，150r／min)24h，测定菌液 OD600值 。
2 结果与分析
2．1 不同培养基对高粱茎尖再生的影响 ．
由表 1可知 5种培养基高粱茎尖再生率为 24．1％-57．3％，
且各培养基均能产生再生植株 。其 中 MS培养基(I1)及其改 良
培养基(I)优于其他培养基，激动素与其他激素 BAP、IAA混
用比单用效果好 ，茎尖再生率可提高 15％以上。MS培养基 中
添加甘氨酸、Fe—EDTA和抗坏血酸等有机物有利于高粱茎尖再
生 ，表明培养基对高粱茎尖的分化与生长起着重要作用。
表 2 不同基因型对高粱茎尖再生的影响
．2 The of diferent genotyl~onthe regeneration of sorghum shot
*接种均用处理 Ⅱ培养基。
regeneration of sorghum shoot of“115”
2．2 不同基因型对高粱茎尖再生的影响
高粱茎尖具有较高分化 和再生能力且基因型间
差异 明显 ，其 中“7050A／011”茎 尖再 生 率 最 高 ，达
64．5％；而“124B”再生率最低 ，仅为 41．8％，杂交种再
生能力略高于其他不育系和恢复系(见表 2)。本试验
材料中未发现不能再生的基因型 ，高粱茎尖再生率平
均为 52．6％，表明参试高粱品种(系)均可通过茎尖培
养进行遗传转化。
2．3 不同抗生素对高粱茎尖再生的影响
在植物的遗传转化 中，羧苄青霉素(Cb)、头孢霉素
(Cef)、潮霉素(Hyg)和卡那霉素(Kan)等抗生素经常用
于筛选抗性标记基因及杀菌。由表 3可知 4种抗生素
对高粱茎尖再生的影响差异显著 ，羧苄青霉素对高粱
茎尖再生的影响最小 ，其浓度达 500mg／L时茎尖再生
率仍高达 38．4％；头孢霉素低浓度时对高粱茎尖再生
的影响较小 ，但其浓度 >50mg／L时茎尖再生率明显
下降；潮霉素和卡那霉素对 高粱茎 尖再 生 的影响最
大，其浓度<50mg／L时高粱茎尖 的再生即完全被抑制，表明羧苄青霉素和头孢霉素宜用 于供试高粱品种
(系)的抑菌 ，而潮霉素和卡那霉素宜用于高粱转基因材料的筛选。
表 3 抗生素对 高粱恢复系“115”茎尖再生的影响 *
Tab．3 The effect of antibiotics on the regeneration of sorghum shoot of“115’
抗生素 t~ ~／mg·kg The concentration of antibiotics
Antibiotics 0 50 100 250 500
外植体数／个 再生率／％ 外植体数／个 再生率／％ 外植体数／个 再生率／％ ~tilfltt／4- 再生率／％ 外植体数／个 再生率／％
No 0f explant Rate of regeneration No 0f extant Rate of regeneration No ef explalt Rate of regeneration No．。f explant Rate 0f regeneration No of exphnt Rate of regeneration
羧苄青霉素 147 49．6 167 49．1 134 48．8 145 48．5 176 38
．4
头 孢 霉 素 147 49．6 173 37．6 154 12．3 187 8．4 153 0
潮 霉 素 147 49．6 176 0 0 0 0 0 0 0
卡 那 霉 素 147 49．6 169 0 0 0 0 0 0 0
*接种为处理 Ⅱ培养基。
2．4 不同抗生素对农杆菌的抑制效果
农杆菌培养基 中不同浓度抗生素对农杆菌繁殖抑制效果不同，头孢霉素对农杆菌培养基的抑制效果最
76 中 国 生 态 农 业 学 报 第 13卷
●
E
蛏
翘
嚣
0 l 5 l0 50 100 250 500
抗生素浓度／mg·L-
图 1 抗生素对农杆菌的抑制效果
Fig．1 The inhibition effect of antibiotics
on Agrobacterium
强，而羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果略低于头孢霉素。将与
农杆菌共同培养过的恢复系“115”原基转移到含有不同浓度头
孢霉素或羧苄青霉素固体培养基上 ，观察计算培养 5 d后农杆菌
复发率。图 1表明随抗生素浓度的提高，农杆菌复发率 明显降
低。头孢霉素浓度为 100 mg／L时可完全抑制农杆菌“EHA105”
的生长 ，羧苄青霉素浓度为 250mg／L时也可完全抑制农杆菌
“EHA105”的生长，说明头孢霉素和羧苄青霉素对农杆菌的抑
菌作用显著。
3 小 结
本研究认为高粱不同基因型间茎尖分化和再生能力不 同，
但所有基因型均可发育成再生植株 ，可利用茎尖培养进行遗传
转化。高粱茎尖再生培养中激动素与其他激素 BAP、IAA混用 比单用效果好，MS改 良培养基 (I)最理想。
MS培养基中添加甘氨酸、Fe—EDTA和抗坏血酸等有机物有利于茎尖 的分化与生长。4种抗生素对高粱茎
尖再生的影响差异明显，羧苄青霉素对高粱茎尖再生的影响最小，其浓度达 500mg／L时茎尖再生率仍高达
38．4％；头孢霉素低浓度时对高粱茎尖再生率影响较小 ，但其浓度 >50mg／L时茎尖再生率明显下降。与农
杆菌共同培养过的高梁茎尖 ，用头孢霉素(浓度为 100mg／L)及羧苄青霉素(浓度为 250mg／L)可完全抑制农
杆菌“EHA105”的生长 ，故农杆菌介导的高粱茎尖遗传转化过程中羧苄青霉素为最理想抗生素，其最佳浓度
为 250mg／L，既可完全抑制农杆菌 ，又不影响高粱茎尖的再生。
参 考 文 献
1 周逢勇，王国英等．玉米 自交系 P9—10遗传转化体系的建立．科学通报 ，1998(23)：2517～2520
2 黄 璐 ，卫志明．农杆菌介导的玉米遗传转化．实验生物学报，1999，32(4)：381～387
3 刘明志 ．论农杆菌介导的单子叶植物转化．遗传 ，1996(增刊)：50～52
4 Cheng M．，Joyce Fry E．，et a1．Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium Tumefaciens．Plant Physiol，1997，115：971
5 Suncan D．R．，et a1．The production of callus capable of plant regeneration from immature embryos of numerous Zea mays genotypes．Planta，
1985．165：322～ 332
欢 迎 订 阅 2005 年 《中 国 农 业 资 源 环 境 文 摘 》
<中国农业资源环境文摘>(原名《中国农业文摘——土壤肥料》)于 1985年创 刊，收录了全国 200余种农业科技期 刊中关
于土壤学、肥料学 、植物营养学和生态环境科学方面的文献 ，是本学科专业核心期 刊评价的指标刊物 ，也是我 国本学科惟一文
献检索刊物。2003年起《中国农业文摘——土壤肥料》更名为《中国农业资源环境文摘》，原办刊宗旨与发行范围不变。报道
内容包含原《中国农业文摘—— 土壤肥料》报道范围，侧重于报道生态农业 、环境科学 、资源可持续利用以及学科之间交叉领
域的新理论 、新技术和新方法，为广大土壤科学 、资源与环境科学技术工作者服务 ，促进学术交流，推动学科发展。本刊为双
月刊 ，16开本 ，刊号：CN 11_4920／S，ISSN 1002—543X，邮发代号：18—124，每期定价 1O．o0元 ，全年 6O．o0元 ，国内外公 开发行 ，
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