全 文 ：·论 著·
滇丹参对血管狭窄和金属基质蛋白酶的影响
李建美,罗庆祎,李 易,杨 蓓,卢竞前
(云南省第二人民医院 心脏中心内科,云南 昆明 650021)
摘要:目的 探讨滇丹参对高血脂兔腹主动脉球囊损伤后血管狭窄的影响,及其与基质金属蛋白酶、血管内膜中层平滑肌
细胞增生的关系。方法 25只日本大耳兔随机分为正常对照组、球囊损伤组与滇丹参组。正常对照组不予任何方式处理。另
两组行腹主动脉球囊损伤术,其中滇丹参组给予静脉注射滇丹参注射液 (238mg·kg-1·d-1) 2周,观察各组血管组织中基质金属
蛋白酶表达情况的变化以及血管损伤处血管狭窄、血管内膜中层平滑肌细胞增生的情况。结果 应用滇丹参2周后滇丹参组血
管组织中基质金属蛋白酶表达减少,血管损伤处血管内膜、外膜增生减轻,新生内膜面积减少,管腔面积增加。结论 滇丹参
可以抑制血管组织中基质金属蛋白酶的表达,抑制血管内膜中膜平滑肌细胞增殖,抑制球囊损伤后兔腹主动脉血管的狭窄。
关键词: 滇丹参;基质金属蛋白酶;血管平滑肌细胞
中图分类号:R541.4 文献标识码:A 文章编号:1006-4141(2007)02-0095-04
冠心病目前已成为危害人类健康和生命的危
重疾病之一。经皮腔内冠状动脉成形术及支架植
入术已成为治疗冠心病的重要手段,但术后再狭
窄的发生使这一技术的应用受到一定的限制。目
前认为,再狭窄是新生内膜的形成和血管重构的
总和[1]。血管平滑肌细胞增殖及从中膜向内膜的迁
移是再狭窄发展过程中的关键环节,而血管平滑
肌细胞产生的基质金属蛋白酶 (matrixmetalopro-
teinases,MMPs) 对细胞外基质的降解促进了平滑
肌细胞的迁移[2]。滇丹参是我省特有的一种民间药
材,属唇科鼠尾草属,有抗炎、稳定细胞膜、抗
氧化、调脂、抗平滑肌细胞增殖和抗心肌缺血的
作用。上述综合作用能抑制再狭窄的发生,故推
测滇丹参可能具有抑制 MMPs活性的作用。本研
究通过探讨滇丹参对血管再狭窄的影响,观察其
减轻血管损伤后狭窄的程度,探索其机制,为今
后临床防治再狭窄提供理论依据。
材料和方法
一、材料 健康日本大耳兔 25只,体重
(2.5±0.5)kg,由昆明医学院动物科提供。按国际惯
例进行随机抽样分组:正常对照组5只,球囊损伤组
10只,滇丹参组10只。3组性别、体重无差异。
二、方法 1、动物血管球囊损伤后狭窄模型
的建立:大耳兔按当时体重以氯氨酮注射液
25mg/kg和氯丙嗪注射液 12.5mg/kg进行肌肉注
射麻醉,固定于实验手术台上,消毒右侧腹股沟
区,去除体毛,再次常规消毒,切开皮肤及皮下组
织,用止血钳钝性分离出股动脉,在股动脉上剪开
2mm小口,插入 5F动脉鞘管,经鞘管给肝素
3000U,庆大霉素 80万 U,而后经鞘管插入 3.5～
4.0mm×23mm带导丝的球囊导管进入腹主动脉深
度约18cm,在6～8个大气压下球囊回拉到髂动脉
与股动脉分叉处,撤压,间歇1min后,重复操作,
共3次,拔出球囊导管,结扎股动脉,逐层缝合,
消毒。术后继续以高脂饲料喂养2周。滇丹参组给
予静脉注射滇丹参注射液 (238mg·kg-1·d-1)。2周
后经耳缘静脉注入 50ml空气处死兔。迅速取出腹
主动脉,放入4%多聚甲醛中固定。
2、组织形态学观察及计算机图像分析:取球
respectively.Thedatawerestatisticalyanalyzedbypairedsamples.Results TheCD3+,CD3+CD4+,CD3+CD4+/
CD3+CD8+,andNKcelsincreasedremarkably6weeksand10weekspost-operativelycomparedwith2weeks
post-operatively(P<0.05) intreatmentgroup.Conclusions HuaiErmayproducesomeanti-tumorefectby
improvingcelularimmunefunction.
Keywords:Celularimmunefunction;Gastriccancer;HuaiEr
收稿日期:2006-12-04
基金项目:云南省教育厅科学研究基金项目04y008C
作者简介:李建美 (1959~) 女,毕业于北京医科大学,硕士,主任医师,从事心血管病学专业研究。
云南医药2007年第28卷第2期 ·95·
囊损伤部位的腹主动脉,每段长4～6mm,置于4
%多聚甲醛溶液中固定24h,不同浓度酒精逐级脱
水,石蜡包埋,连续切片 5张 (片厚 5μm),行
H-E染色,中性树胶封片,在光学显微镜下观察
血管壁厚度、管腔大小及内膜增生情况。利用
Hias-1000计算机图像分析系统测出管腔面积及新
生内膜面积。
3、血管组织中基质金属蛋白酶的检测:
MMP-2及 MMP-9免疫组化试剂盒,购于武汉博
士德生物工程有限公司。切片常规脱蜡至水,3%
H2O2灭活内源酶,蒸馏水与 PBS洗涤,置 pH6.0
枸橼酸盐缓冲液中高压 10min修复抗原。首先加
入封闭 30min,分别加 MMP-2一抗稀释度 1∶
100;MMP-9一抗稀释度1∶100后4℃过夜。PBS
洗涤 10min后加入生物素标记的第 2抗体 (1∶
200稀释),室温 20min,PBS洗涤 10min,加
SABC室温 20min,PBS洗涤 10min,加 DAB显
色,镜下观察,及时终止反应。最后苏木素复染,
常规脱水,封片镜检。各组免疫组化切片应用
Hias-1000图像分析系统对血管内膜中膜阳性反应
产物进行半定量检测分析。MMP-2,MMP-9阳性
表达为细胞呈棕黄色,每张切片随机选取 3个视
野,在 200倍放大下,测量血管内膜中膜免疫组
化染色灰度值,然后取其平均值。
4、统计学处理:使用 SPSS11.5统计软件包。
计量资料数据用均数±标准差表示,组内比较使
用配对t检验,组间比较使用单因素方差分析。以
P<0.05为结果有统计学意义统计学方法。
结 果
一、3组血管形态学变化 正常对照组内膜平
滑,无增厚,内弹力板完整,无平滑肌存在。球囊
损伤组血管内膜增生最严重,内膜修复不完整,内
弹力板不连续,腔内面不光滑,可见大量平滑肌细
胞由中膜向内膜迁移并增生,细胞排列紊乱,并有
大量泡沫细胞及纤维结缔组织形成,管腔明显狭
窄。滇丹参组平滑肌细胞增生不明显,内皮较完整
光滑,内膜增生较轻,管腔狭窄不明显。
如表 1所示,球囊损伤组、滇丹参组血管管
腔面积减小 (与正常对照组相比,P<0.05),血管
新生内膜面积增加 (与正常对照组相比,P<
0.05)。但滇丹参组管腔面积较球囊损伤组明显增
加 (P<0.001),新生内膜面积均较球囊损伤组明
显减小 (P<0.001)。
表1 3组血管新生内膜面积 (单位:×102um2)
二、3组MMPs免疫组化阳性结果 球囊损伤
组血管内膜中膜可见大量平滑肌细胞增生,
MMP2,MMp9阳性平均灰度较正常对照组明显增
加 (P<0.001)。滇丹参组血管内膜中膜 MMP2,
MMp9阳性平均灰度也较正常对照组增加 (P<
0.05),但与球囊损伤组相比明显降低 (P<
0.001),见表2。
表2 3组MMP2及MMp9的免疫组化阳性结果
讨 论
血管成形术后再狭窄是局部血管损伤后的一
种修复反应,以管腔狭窄为特征。再狭窄的血管
重塑机制是一个复杂的过程,大致由血管弹性回
缩、血栓形成、生物活性因子的释放、血管平滑
肌细胞增殖迁移、新生内膜形成、内皮修复、细
胞外基质的过度生成及血管重塑等环节构成[3]。血
管重塑是细胞增殖、死亡、迁移以及细胞外基质
合成和降解所致的血管壁结构动态变化过程,而
该过程与生长因子、血管活性物质和血流动力学
刺激等因素有关,贯穿于血管成形术后的全过程,
其机制尚不明确。可能与内皮细胞功能的改变,
血流动力学刺激,平滑肌细胞增殖、迁移、凋亡,
细胞外基质合成与降解,外膜的纤维化等有关[4]。
本研究所采用的高胆固醇兔腹主动脉球囊损
伤模型,其优点是在大体观和血流动力学上与人
类冠脉再狭窄更相近,不足之处在于所含泡沫细
胞的数目较多,纤维组织增生不如人冠状动脉再
狭窄明显[5]。虽不能完全模仿人体冠脉狭窄 PTCA
术后再狭窄过程,但着眼于其中最重要的血管平
滑肌细胞增殖、新生内膜形成等环节并给予处理,
希望从中得到启示。本研究发现应用滇丹参注射
液 (238mg·kg-1·d-1) 治疗 2周后滇丹参组血管组
织中基质金属蛋白酶表达明显减少,损伤处动脉
内膜增生减轻,血管管腔面积明显增加。这表明
滇丹参可以抑制球囊损伤后兔腹主动脉血管的狭
组别 管腔面积 新生内膜面积
正常对照组 36.09±0.21 0
球囊损伤组 10.51±0.16 30.84±0.37
滇丹参组 11.03±0.27 2.93±0.36
指标 正常对照组 球囊损伤组 滇丹参组
MMP2 14.86±4.90 90.33±14.90 58.73±20.72
MMp9 23.84±10.03 151.91±24.14 94.46±24.66
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EfectsofS.yunnanensisC.H.wrightonvascularstenosisandmetaloproteaseproduction. LIJian-
mei,LUOQing-yi,LIYi,etal.(DepartmentofCardiologyCenter,TheSecondPeopleHospitalofYunnan
Province,Kunmimg650021China)
Objective ToelucidatetheefectsofS.yunnanensisC.H.wright,aChineseherb,onvascularstenosisafter
balooninjuredabdominalarteryonthehyperlipidemicatheroscleroticmodelofrabbits,andtofinditsrelationship
withmetaloproteaseandvascularsmoothmusclecelproliferationinneointimaandmedia.Methods 25Japan
big-earrabbitswererandomlydividedinto3groups.Normalcontrolgroup(n=5) wasfedwithordinarydietand
withoutanyintervention.Theothertwogroupswerefedwithhyperlipidemicdiet,andtheirabdominalarterieswere
injuredbydilatedbaloon.Meanwhile,S.yunnanensisC.H.wrightgroupwasintravenouslyinjectedwithS.yunna-
窄, 抑制血管内膜中膜平滑肌细胞增殖, 抑制血
管组织中基质金属蛋白酶的表达,并对血管重塑
产生正性调节作用。
再狭窄过程中,血管平滑肌细胞增殖及从中膜
向内膜的迁移是再狭窄发展过程中的关键环节[6],
增生的血管平滑肌细胞合成过多的细胞外基质,
细胞外基质积聚可使管壁增厚、血管弹性下降、
管腔狭窄至血管重构的发生,而血管平滑肌细胞
产生的 MMPs可以降解细胞外基质,促进血管平
滑肌细胞迁移和增殖,促进内膜增厚和改变血管
重构而促进再狭窄的发生[7]。MMPs是一组能特异
地降解 ECM成分的内源性锌依赖性蛋白水解酶,
在动脉粥样硬化和再狭窄发生发展过程中,MMPs
的表达及活性增强。有研究证实,PTCA术后患者
血浆MMPs含量增加[8]。
现已知有约20余种MMPs,已知道在AS和再
狭窄主要与 MMP2和 MMP9相关[9]。有研究表明,
细胞外基底膜的重塑是平滑肌细胞迁移和增殖的一
个关键调节因素,MMP-2对平滑肌细胞穿过内弹
力板、基底膜等屏障的迁移增生,是一种必需的物
质,在对内膜损伤的反应和粥样硬化病变形成过程中
起关键作用,并影响病程的发展和并发症 (如再狭
窄、管壁破裂和血栓形成等) 的产生[10]。MMP-9与
动脉粥样硬化的发病机制和血管损伤后的过度增生
有关。Mason等[11]研究表明,通过胶原浸润检测和
体外Boyden小室的检测发现,MMP-9过度表达能
促进平滑肌细胞的迁移,使平滑肌细胞进入动脉
壁,并通过增加血管周径来改善血管重构。因此,
抑制MMPs的药物可阻止血管平滑肌细胞的增生迁
移,减少细胞外基质的产生,预防动脉粥样硬化和
再狭窄的发生。本研究发现,使用滇丹参干预后,
基质金属蛋白酶表达明显减弱,并表现为减轻血管
狭窄,这是否为滇丹参通过抑制基质金属蛋白酶表
达,抑制血管平滑肌细胞增殖,从而达到减轻血管
狭窄的结果还有待进一步研究。
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·论 著·
40例非梗阻性无精子症患者Y染色体无转子因子微缺失的检测
白双勇,叶峻杰,欧阳武,李江川,李翠花
(云南省人口和计划生育技术科研所 云南 昆明 650021)
摘要:目的 探讨Y染色体上微缺失与男性非梗阻性无精症之间的关系。方法 采用多重 PCR技术,对40例非梗阻性
无精症患者AZF3个区域的6个序列标签位点 (STS) 进行了微缺失检测。结果 40例非梗阻性无精症患者中发现了 2例微
缺失 (5%)。结论 AZF微缺失导致男性非梗阻性无精症的重要原因之一。
关键词: 无精子因子;微缺失;非梗阻性无精子症
中图分类号:R698+.2;Q344 文献标识码:A 文章编号:1006-4141(2007)02-0098-03
育龄夫妇中约有 15%不能生育,其中一个重
要的原因是男方生精障碍,表现为严重少精子或
无精子,约占不育男性的 10%。除输精管梗阻、
感染等原因外,遗传性状改变也是一个重要的因
素。由遗传因素引起的不育占整个影响因素中的
30%,包括染色体异常 (47,XXY;46,XX等)
及与生精有关基因异常[1]。无精子因子 (azoosper-
miafactor,AZF) 的发现和人类Y染色体基因结构
和功能的研究找到某些男子不育症的根本原因。
1993年发现 AZF被确认为精子发生所必需,AZF
基因位于染色体 (Yq11) 上,并在睾丸内特异性
表达。AZF的研究使得一部分原发性无精症患者
的病因得以明确。并且发现 AZF微缺失占特发性
无精子症及严重少精子症的 10%～15%[2]。本研究
以40例无精症患者为研究对象,根据欧洲生殖协
会推荐标准设计,采用多重 PCR技术,快速检测
Y染色体 AZF基因家族 AZFa,AZFb,AZFc3个
区域中 6个序列标签位点 (sequencetaggedsites,
STS) 微缺失,现报告如下。
材料与方法
一、对象 不育患者均来自我所生殖中心不
育门诊,按 WHO第四版精液常规分析标准检查,
连续 3次精液分析,离心沉淀均未发现精子且精
液量>2ml;pH:7.2～8.0;果糖试验:阳性。排
除梗阻性因素。体检:双侧睾丸均在>16ml。所检
测40例无精症患者为非梗阻性无精症。
二、方法: (一) PCR扩增:确定 Y染色体
AZF区域内的 6个 STS,分别是 AZFa区的 sY86,
sY84;AZFb区域内的 sY127,sY134;AZFc区域
内的sY254,sY255。设立SRY质控片断并同时设
立正常男性对照和空白对照。每个标本检测需做
两个多重PCR反应,A组PCR反应的预混液已加
入绿色小管中,B组反应的预混液已加入紫红色小
管中,PCR反应体系组成如下:A组:PCR预混
液 A10μl,引物混合液 A9μl,模板 DNA100ng
(2μl);B组:PCR预混液 B10μl,引物混合液
B9μl,模板 DNA100ng(2μl) 加完上述试剂后,
10000转/min,离心 10s,按下列条件扩增:
95℃,3min;95℃,30s;59℃,30s;72℃,30s;
共35个循环,最后72℃延伸10min。
(二) 电泳检测:取 8μl扩增产物加入
1.5ul6X上样缓冲液混匀后加样,经3.0%的琼脂凝
胶电泳 40min后,凝胶成像仪观察,进行 DNA电
收稿日期:2006-10-19 修订日期:2006-11-10
作者简介:白双勇 (1972~) 男,1996毕业于昆明医学院,主治医师,从事男科工作10年。
nensisC.H.wrightparenteralsolution238mg·kg-1·d-1for2weeks.Thelumenareas,neointimaareas,MMP-2,
andMMP-9wereanalyzed.Results MMP-2andMMP-9positivecelsintheintimaandmediaofS.yunnanensis
C.H.wrightgroupwereinhibited,thelumenareasincreased,atthesametimetheneointimaareasdecreased.
Conclusion S.yunnanensisC.H.wrightcaninhibitvascularstenosiscausedbyhighcholesteroldietplusbaloonin-
juredmethod,inhibittheexpressionofMMPs,andalsoinhibittheproliferationofvascularsmoothmusclecels.
Keywords:S.yunnanensisC.H.wright;MMPs;Vascularsmoothmuscle
云南医药2007年第28卷第2期·98·