全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (2): 273−276 · 273 ·



地锦草有效部位对红色毛癣菌细胞膜合成及
MEP、SUB 基因表达的影响
李治建 1, 2, 赵明月 1, 古力娜·达吾提 3*, 斯拉甫·艾白 1, 2*
(1. 新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所, 新疆 乌鲁木齐 830049; 2. 新疆维吾尔医方剂学实验室,
新疆 乌鲁木齐 830049; 3. 新疆维吾尔自治区维吾尔医医院, 新疆 乌鲁木齐 830049)
关键词: 地锦草有效部位; 红色毛癣菌; 基质金属蛋白酶; 枯草菌素蛋白酶; CYP51酶
中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 02-0273-04
Action of Euphorbia humifusa effective fraction on membrane biosynthesis
and the gene expression of proteases MEP and SUB of Trichophyton rubrum
LI Zhi-jian1, 2, ZHAO Ming-yue1, DAWUTI Gulnar3*, AIBAI Silafu1, 2*
(1. Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine, Urumqi 830049, China; 2. Key Laboratory of Traditional Uighur Medicine
Prescription, Urumqi 830049, China; 3. Uighur Medicine Hospital of Xinjiang Autonomous Region, Urumqi 830049, China)

Abstract: This study is to investigate the effect of Euphorbia humifusa effective fraction (EHEF) on the
CYP51 enzyme activity, the lanosterol content and the MEP, SUB gene expression of Trichophyton rubrum.
Trichophyton rubrum was treated by EHEF for 7 days at 26 ℃. The activity of CYP51 enzyme of Trichophyton
rubrum in the cell membrane was determined by using ELISA kit, and the lanosterol content was investigated by
using high performance liquid chromatography (HPLC), and the MEP, SUB gene expression of Trichophyton
rubrum was detected with the reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Results
showed that EHEF can decrease the membrane CYP51 enzyme activity, and it also can accumulate the fungal
lanosterol in a dose-dependent manner, and it also can decrease the gene expression of MEP and SUB. The
antifungal mechanism of EHEF may be related to the inhibition on CYP51 enzyme activity, and to the effects on
fungal cell membrane ergosterol biosynthesis. It may also play an antifungal effect by inhibiting the MEP, SUB
gene expression of fungal proteases.
Key words: Euphoria humifusa effective fraction; Trichophyton rubrum; metalloproteinase; subtilisin;
CYP51 enzyme

地锦草为大戟科植物地锦 (Euphorbia humifusa
Willd) 或斑地锦 (Euphorbia maculata L) 的干燥全

收稿日期: 2013-07-23; 修回日期: 2013-11-15.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (81060370, 81160557); 新疆
维吾尔自治区自然科学基金资助项目 (2011211B52); 新疆
维吾尔自治区公益性科研院所基本科研业务费专项资金项
目 (KY2013104).
*通讯作者 Tel: 86-991-2563093, Fax: 86-991-2557730,
E-mail: gulnar426@163.com;
Tel: 86-991-2563702, Fax: 86-991-2557730,
E-mail: aibai@263.net
草, 是中医、维吾尔医常用药材, 临床主要用于治疗
手癣、体癣、足癣、花斑癣、银屑病[1]。以往研究表
明, 地锦草提取物及其有效部位 (含 40% 黄酮和 16%
鞣酸) 对浅部致病真菌有较强的抑制作用, 且对红色
毛癣菌 (Trichophyton rubrum) 最敏感[2, 3]。红色毛癣
菌是导致浅部真菌病的主要病原菌, 其引起的皮肤癣
菌病约占临床上浅部真菌病的 69.5%, 是目前国际上
重点研究和防治的皮肤癣菌[4]。麦角甾醇是真菌细胞
膜的重要结构组成成分, 14α-去甲基化酶 (CYP51)
· 274 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (2): 273−276

是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路中的一个重要
酶, 它能使羊毛甾醇转变成麦角甾醇, 抑制该酶可使
真菌细胞中羊毛甾醇蓄积, 造成细胞膜合成受阻, 从
而导致真菌细胞死亡[5]。红色毛癣菌在入侵宿主组织
的过程中, 通过释放多种蛋白水解酶分解入侵组织,
来满足自身新陈代谢需要, 并且这些蛋白水解酶在
组织入侵及控制宿主的防御机制上也起着十分重要
的作用 , 其中基质金属蛋白酶 (metalloproteinases,
MEP) 和枯草菌素蛋白酶 (subtilisins, SUB) 对角蛋
白、胶原、弹力蛋白等多种蛋白具有水解活性, 在红
色毛癣菌感染过程中可能与其获得营养和扩大侵袭
范围有关[6, 7]。因此, 本研究从真菌细胞膜 CYP51酶
活性、甾醇合成以及 MEP 和 SUB 基因表达等环节,
采用 HPLC、RT-PCR和 ELISA方法, 研究地锦草提
取部位抗红色毛癣菌的作用机制。

材料与方法
药品与试剂 地锦草药材购自新疆本草堂中药
饮片有限公司 (批号: 20111003, 产地: 江苏), 由自
治区维吾尔医医院药剂科艾尼瓦尔主任药师鉴定为
大戟科植物地锦 (Euphorbia humifusa Willd), 标本保
存于新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所标本室。地
锦草有效部位 (EHEF) 提取方法: 称取地锦草 300 g,
采用 10倍量 70% 乙醇回流提取 3次, 每次 1 h, 合并
提取液, 干燥得浸膏 60.1 g; 加水 1 L使浸膏尽量溶
解 (超声助溶 0.5 h)、滤过、减压浓缩、离心 (3 500
r·min−1, 5 min)、过滤, 上清液采用 AB-8大孔吸附树
脂, 上柱后关柱浸泡 24 h, 水−乙醇梯度洗脱, 收集
40%乙醇洗脱部位, 合并流份、减压浓缩, 冷冻干燥
得地锦草有效部位浸膏 4.94 g, 于 −70 ℃冰箱保存备
用; 质量标准: 总黄酮和鞣酸合计含量不低于 50%, 参
照《中华人民共和国药典》紫外−可见分光光度法, 测
定总黄酮含量为 400.7 mg·g−1, 采用 HPLC测定鞣酸
含量为 159.6 mg·g−1, 合计含量为 56%。阳性对照药:
特比萘芬 (terbinafine, TBF), 诺华公司, 批号 100482,
纯度 99.9%; Trizol, Invitrogen, Lot: 14105; cDNA第一
链合成试剂盒, Invitrogen, Lot: 8211103; 2×Taq PCR
Master MIX 1 mL (with loading dye), 天根生化科技,
Lot: #K9913; CYP51 酶 ELISA 试剂盒, 上海经科化
学科技有限公司, 产品编号: 266571; 羊毛甾醇标准
品 (ChromaDex公司); PCR反应引物由生工生物工程
(上海) 有限公司合成; 甲醇为色谱纯 (Sigma公司), 其
余试剂均为分析纯。
实验菌株 红色毛癣菌 (Trichophyton rubrum,
XYZ T.r 40015), 由新疆医科大学真菌与真菌病研究
中心菌种保藏库 (XYZ) 提供。
主要仪器 FM 型生化培养箱, 上海福玛实验设
备有限公司; BHC-1300ⅡA型生物安全柜, 苏州安泰
空气技术有限公司; Gene QuantⅡDNA/RNA紫外分
光光度仪, Pharmacia Biotech公司; Tannon 3500R凝
胶成像系统, 上海天能公司; Gene AMP PCR System
9700 DNA扩增仪, 美国 PE公司。LC-20AB液相色
谱仪 (日本岛津公司), CBM-20A 二极管阵列检测器
CTO-20A柱温箱和 LCsolusion色谱工作站。
药物干预方法[8, 9] 参照美国临床实验室标准化
委员会 (NCCLS) 推荐的“产孢丝状真菌的液基稀释
法抗真菌药物敏感性试验方案”(M38-A), 将药物和
红色毛癣菌于含有诱导角蛋白酶的 RPMI-1640 培养
基中 26 ℃孵育 7天, 收集培养液, 经漂洗、离心得菌
丝体。
RT-PCR 检测 药物作用红色毛癣菌后, 采用
Trizol说明书方法抽提总RNA, 紫外分光光度法测定
总RNA的吸收度值, 凝胶电泳对总RNA进行定性分
析, 验证所提取的总 RNA 纯度高、无降解, 可作为
逆转录反应的模板。RT反应体系及条件 PCR反应体
系 20 µL: 包括 dd H2O 8 µL、2×Master Mix 10 µL、
上下游引物 1 µL及 cDNA 1 µL; 基因 SUB的 PCR扩
增条件: 94 ℃预变性 5 min、94 ℃变性 30 s、58 ℃退
火 30 s、72 ℃延伸 1 min, 40个循环, 72 ℃延伸 7 min;
内参 β-actin的 PCR扩增条件: 94 ℃预变性 5 min、
94 ℃变性 30 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min, 35
个循环, 72 ℃延伸 7 min; 基因 MEP1-5的退火温度
分别为 56、54、55、55及 56 ℃, 分别为 35个循环。
1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物, 拍照记录, 并用
分析软件对扩增产物进行光密度分析, 读出各样本
光密度值, 再与 β-actin值相比, 计算相对表达量。目
的基因引物由上海生工生物工程技术服务有限公司
合成, 具体序列见表 1。
CYP51测定 按照 ELISA试剂盒说明书进行。
羊毛甾醇的含量测定方法[10] 色谱条件为色谱
柱: Waters symmetry shieldTMRP C18 (4.6 mm × 150 mm,
5 μm), 柱温: 35 ℃; 流动相: 甲醇−水 (90∶10); 检
测波长: 210 nm; 流速: 1.0 mL·min−1; 进样量: 20 μL。
样品的制备: 药物干预菌株 (26 ℃孵育 7天), 挑取各
孔菌落洗涤、离心后精密称取湿菌 3.5 g, 加含新鲜配
制的 10% KOH的甲醇溶液 20 mL, 混匀, 80 ℃水浴
皂化 100 min; 加石油醚 (沸程 30～60 ℃) 20 mL回
李治建等: 地锦草有效部位对红色毛癣菌细胞膜合成及 MEP、SUB基因表达的影响 · 275 ·

Table 1 Oligonucleotide primers of RT-PCR
Gene Primer squence Product/bp
MEP1 5-GAACCATCATCCACGAATACA-3 192
5-TGTTCACCCATCCTCCCTTA-3
MEP2 5-GCCACAGAGCGCTAAGGCTA-3 104
5-GGATGTAAACGAGCTTGGCC-3
MEP3 5-CAACGATTTCGCCATTGTCA-3 101
5-TGTACATTCTCATGCGGCCA-3
MEP4 5-CACCTTCCCTGGCTCAAAAC-3 105
5-CGGTAGGGTTCTCCTGAGCA-3
MEP5 5-CTGGAACCTCAAAACCTCGC-3 101
5-CATCGAAGTTGGCTTGTGCA-3
SUB1 5-CCGCAGAAGATGATAGCCG-3 282
5-CGCCGTTGTTGATGAGGAC-3
β-actin 5-TCCTAACCCTGCGATACCC-3 444
5-TGTCACGGACGATTTCACG-3


流提取 3次, 提取液置于分液漏斗中, 加水 20 mL洗
涤, 醚层于 60 ℃水浴挥干, 得未皂化脂; 取未皂化脂,
用甲醇溶解定容至 5 mL, 0.45 μm 有机微孔滤膜过
滤。测定样品中羊毛甾醇的峰面积, 计算菌丝中羊毛
甾醇的含量。
统计学分析 使用 SPSS10.0软件 Student’s t-test
检验, 比较各组MEP、SUB基因表达量及 CYP51酶、
羊毛甾醇含量差异, 数据以 x ± s表示。

结果
1 红色毛癣菌的 RNA抽提
采用 Trizol 法抽提各组红色毛癣菌中 RNA, 结
果 (图 1) 显示, RNA条带清晰, 总 RNA抽提质量良
好。
2 EHEF对红色毛癣菌基因表达的影响
EHEF 各组与空白对照组比较, 红色毛癣菌菌丝
中 MEP1-5与 SUB1基因的相对表达量显著减少, 并
且有一定的剂量依赖性, 其中对 SUB1作用最强; 128
μg·mL−1剂量组对 SUB1的抑制率为 81%, 对 MEP1-5
的抑制率分别为 47%、67%、32%、48%及 22%; TBF
可显著降低红色毛癣菌的MEP2-5与 SUB1基因的相

Figure 1 Electrophoretogram of the MEP, SUB and Actin.
1, 2: EHEF 128 μg·mL−1; 3, 4: EHEF 64 μg·mL−1; 5, 6: EHEF
32 μg·mL−1; 7, 8: TBF 0.002 5 μg·mL−1; 9, 10: Control

对表达量。结果见表 2和图 1。
3 EHEF对红色毛癣菌细胞膜CYP51酶活性的影响
EHEF 各组与空白对照组比较, 随着浓度升高,
CYP51 酶的含量逐渐减少, 128 μg·mL−1剂量组与对
照组比较显著降低, 说明 EHEF 可通过抑制红色毛
癣菌细胞膜 CYP51 酶活性, 影响真菌细胞膜生物合
成。见表 3。

Table 3 Effect of EHEF on CYP51 activity of Trichophyton
rubrum. n = 3, x ± s. **P < 0.01 vs control group
Group Dose/μg·mL−1 CYP51 activity/U·mL−1
Control − 22.54 ± 0.34
EHEF 32 19.45 ± 0.60
64 16.68 ± 1.36
128 10.20 ± 1.41**

4 EHEF对红色毛癣菌细胞膜羊毛甾醇含量的影响
与空白对照组比较, EHEF (32 μg·mL−1) 能使真
菌中的羊毛甾醇含量明显降低, 机制可能与 EHEF抑
制红色毛癣菌细胞膜角鲨烯环化酶活性有关[11]。随着
EHEF浓度升高, 羊毛甾醇含量反而升高, 说明 EHEF
可通过抑制红色毛癣菌细胞膜 CYP51 酶活性, 使羊
毛甾醇转化麦角甾醇的途径受阻, 从而发生蓄积。结
果见表 4。样品中羊毛甾醇的保留时间为 12.1 min, 与
羊毛甾醇标准品一致。

Table 2 Effect of EHEF on expression of SUB1 and MEP1-5 of Trichophyton rubrum. n = 3, x ± s. **P < 0.01 vs control group;
▲▲P < 0.01 vs EHEF 32 μg·mL−1 group
Group Dose/μg·mL−1 SUB1 MEP1 MEP2 MEP3 MEP4 MEP5
Control − 0.260 ± 0.020 0.700 ± 0.040 0.450 ± 0.030 0.220 ± 0.020 0.210 ± 0.040 0.370 ± 0.010
TBF 0.002 5 0.060 ± 0.005** 0.640 ± 0.030 0.200 ± 0.005** 0.160 ± 0.005** 0.110 ± 0.010** 0.310 ± 0.030**
EHEF 32 0.150 ± 0.005** 0.650 ± 0.040 0.300 ± 0.040** 0.200 ± 0.005 0.200 ± 0.010 0.340 ± 0.010
64 0.080 ± 0.005** 0.410 ± 0.020** 0.210 ± 0.040** 0.170 ± 0.005** 0.120 ± 0.010** 0.300 ± 0.010**
128 0.050 ± 0.010**▲▲ 0.370 ± 0.050**▲▲ 0.150 ± 0.010**▲▲ 0.150 ± 0.010**▲▲ 0.110 ± 0.005**▲▲ 0.290 ± 0.070**▲▲

· 276 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (2): 273−276

Table 4 Effect of EHEF on lanosterol content of Trichophyton
rubrum. n = 3, x ± s. **P < 0.01 vs control group; ▲▲P < 0.01
vs EHEF 32 μg·mL−1 group; ##P < 0.01 vs EHEF 64 μg·mL−1
group
Group Dose/μg·mL−1 Lanosterol content/μg·g−1
Control − 6.01 ± 0.02
TBF 0.002 5 5.01 ± 0.33**
EHEF 32 1.07 ± 0.01**
64 2.71 ± 0.21**▲▲
128 5.98 ± 0.36▲▲##

讨论
红色毛癣菌是毛癣菌属中最常见的亲人性皮肤
癣菌, 外分泌蛋白酶被认为是红色毛癣菌最为重要的
毒力因子。具有角蛋白水解活性的角蛋白酶被认为是
包括红色毛癣菌在内的浅部致病性真菌毒力因子中
最为重要的一种[12]。角蛋白酶体外表达水平的高低与
其临床症状发生的快慢及预后都有密切的关系[13]。
不同病例的红色毛癣菌 SUB 的表达水平与临床症状
的严重程度密切相关; 红色毛癣菌致病力的大小可
能与 SUB的不同表达有关[14]。本研究发现, EHEF能
使真菌中蛋白酶 MEP、SUB 基因表达量下降, 表明
其可通过阻止红色毛癣菌感染过程并影响其获得营
养, 从而起到抗真菌作用。
以往研究发现[3], EHEF 可破坏红色毛癣菌超微
结构, 并降低其细胞膜中麦角甾醇含量。本研究结果
显示, EHEF 可使红色毛癣菌中 CYP51 酶的含量降
低、羊毛甾醇蓄积, 从而影响麦角甾醇的合成。麦角
甾醇的生物合成途径是一个多酶参与的复杂代谢过
程[15]。其中羊毛甾醇为细胞膜 CYP51 酶的底物, 也
是真菌细胞膜麦角甾醇合成中的重要中间甾醇, 一
旦羊毛甾醇代谢异常, 必将引起真菌细胞膜功能异
常, 甚至发生细胞破裂或死亡[16]。EHEF影响羊毛甾
醇的生物合成会导致真菌细胞膜麦角甾醇的合成异
常, 必将破坏真菌的细胞膜结构, 起到抗真菌作用。
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