全 文 ：海南省番石榴根结线虫病病原的种类鉴定
及其寄主范围的测试
刘昊 1 , 龙海 1 , 鄢小宁2 , 徐建华 1*
(1.南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室 , 江苏 南京 210095;
2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 , 海南 儋州 571737)
摘要:对源自海南省 3地侵染番石榴的 9个根结线虫群体进行了形态观察和同工酶分析 , 对 4个代表性群体在 10种常见
经济作物 15个品种上的繁殖力进行了测试。同工酶鉴定结果表明 , 病原线虫为象耳豆根结线虫 (Meloidogyne en terolo-
bii)。生物测试发现或证实:携带 M i基因的抗性番茄以及菜豆 、 豇豆 、 茄子 、 黄瓜 、 西瓜 、 辣椒 、 烟草为供试象耳豆根
结线虫群体的高度适宜寄主 , 大豆为低度适宜寄主 , 棉花为非寄主。寄主范围的测试结果提示 , 象耳豆根结线虫可潜在
地对农业生产造成巨大的经济损失。
关键词:番石榴;象耳豆根结线虫;同工酶谱;寄主范围
中图分类号:S432.4+5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000 2030 (2005) 04 0055 05
Species identification and host range testing of a root-knot nematode
infecting guava in Ha inan Province
LIU H ao
1 , LONG Hai1 , YAN X iao-n ing2 , XU Jian-hua1*
(1.Key Laboratory ofM onito ring andM anagem ent of P lan t D isease s and Insec ts, M inistry of Ag ricu ltu re,
Nan jing Ag ricu ltura lUniversity, Nan jing 210095, Ch ina;2. Institu te o f Env ironmenta l Science s and P lant P ro tection,
Ch inese Academy o f T rop ica lAg ricu ltura l Sc ience s, Danzhou 571737, Ch ina)
Abstrac t:To de term ine the species identity and eva luate the po ten tia l econom ic importance of a roo t-knot nem atode infec ting guava
(P sidium guajava) in H a inan P rovince, we observed the fem ale pe rineal pa tterns and iso zym e pheno types o f 9M eloidogyne popula-
tions co llected from infec ted guava from three locations, and te sted the reproduc tion po tentia l o f 4 representative popula tions on 15
cu ltivars o f 10 econom ic crops. Iso zym e pheno typing determ ined that the pa thogen wasM eloidogyne enterolobii. Bio te sting revea led
o r confirm ed tha t tom a to carry ing the resistance geneM i, k idney bean, cowpea, eggplan t, cucumber, wa term elon, pepper and
tobacco we re good hosts of theM.en terolobii popu la tions te sted. Soybean was a poo r ho st, and co tton w as a non-hos.t The re su lt
suggests tha tM. enterolobii has the po ten tial to cause g rea t econom ic losse s in ag ricu lture.
K ey words:P sid ium guajava;M eloidogyne enterolobii; isozym e phenotypes;host range
根结线虫 (Meloidogyne spp. )为植物根系的专性内寄生物 , 其侵染性二龄幼虫侵入寄主根系 , 迁
移至维管束后固定取食并发育成成虫 。线虫的持续取食干扰了寄主根系的正常生理过程 , 致使寄主植物
显现特异性的根结病害症状 [ 1] 。受害作物的产量损失可达 70%以上 [ 2] 。根结线虫多为广寄主病原物 ,
但种间乃至种内存在一定的寄主专化性。目前控制农作物根结线虫病的途径主要有实施植物检疫 、 建立
无病种苗生产基地 、 选种抗性品种 、 采用轮作和合理使用化学杀线虫剂。而对于非化学性防治措施的有
效实施 , 目标线虫群体种类的准确鉴定及其寄主范围的界定是前提条件。
近年来 , 海南省各地种植的番石榴树 (P sid ium guajava)普遍发生根结线虫病 , 给当地的生产造成
了较大的经济损失[ 3, 4] 。有研究者依据形态特征将病原鉴定为南方根结线虫 (M. incognita)[ 3, 4] , 但由
于根结线虫的形态特征有时不稳定 , 有必要对病原线虫的种类进行确认。基于以上背景 , 本研究对采自
　　收稿日期:2004 12 20
　　基金项目:国家自然科学基金项目 (30471141);国家 863研究计划项目 (2001AA249021)
　　作者简介:刘昊 (1978 ), 硕士研究生。*通讯作者 C orresponding au thor:徐建华 (1964 ), 教授, 从事植物线虫学研究 , E-m ail:
jianhuaxu@ n jau. edu. cn。
　南京农业大学学报　2005, 28 (4):55 ～ 59
Journa l of Nanjing Agricu ltural University
海南省 3地侵染番石榴的 9个根结线虫群体进行了形态观察和同工酶分析 , 同时针对常见经济作物进行
了病原线虫寄主范围的测试 , 目的是明确海南省番石榴根结线虫病病原的种类 , 评估病原线虫的潜在经
济危害性 , 为病原线虫的有效治理提供依据。
1　材料与方法
1.1　线虫群体
线虫样本采自海南省儋州 、琼海和澄迈 3地显现根结症状的番石榴植株 (表 1)。将田间采集的根
结线虫样本接种于感病番茄品种江蔬 3号上 , 经单卵块法纯化后于温室中 (20 ～ 28 ℃)繁殖备用。
表 1　供试根结线虫群体
Tab le 1　M eloidogyne popu lations used in th is study
线虫群体
Popu lation
采集地
Location
同工酶表型
Isozym e phenotypes
Mdh E st
线虫群体
Popu lation
采集地
Locat ion
同工酶表型
Isozym e phenotypes
M dh E st
MEHN1 儋州 Danzhou N1a VS1 S1 MEHN6 琼海 Q ionghai N1a VS1 S1
MEHN2 儋州 Danzhou N1a VS1 S1 MEHN7 琼海 Q ionghai N1a VS1 S1
MEHN3 儋州 Danzhou N1a VS1 S1 MEHN8 琼海 Q ionghai N1a VS1 S1
MEHN4 儋州 Danzhou N1a VS1 S1 MEHN9 澄迈 Chengm ai N1a VS1 S1
MEHN5 琼海 Q ionghai N1a VS1 S1
　　注:M dh:苹果酸脱氢酶 Ma late d ehyd rogenase;E st:酯酶 Es terase
1.2　雌虫会阴花纹形态的观察
选取各线虫群体的成熟雌虫 10条 , 置于有机玻璃片上的蒸馏水滴中 , 用解剖刀切取会阴部角质膜 ,
将其转移至 45%乳酸液中剔除杂物并进行修切 , 最后将角质膜块置于甘油中制成会阴花纹永久玻片 。
在光学显微镜 (800×)下观察各线虫群体的会阴花纹特征并拍照 。
1.3　同工酶分析
线虫的苹果酸脱氢酶 (Mdh)和酯酶 (Est)同工酶的活性分析参照 Esbenshade等 [ 5 ]的程序。采用
7%聚丙烯酰胺胶垂直电泳 , 每孔加样 4条雌虫的酶提取物。电泳后 , 将胶在苹果酸脱氢酶染液中染色
5 ～ 10 m in至出现清晰的酶条带 , 然后将同一胶在酯酶染色液中染色 20 ～ 30m in至出现清晰的酶条带为
止 。以已鉴定的爪哇根结线虫 (M. javan ica)样本作为参照系。苹果酸脱氢酶和酯酶表型的命名按照
E sbenshade等[ 6]的方法 。
1.4　寄主范围测试
选取 4个代表性病原线虫群体 , 即 MEHN1、 MEHN 2、 MEHN5和 MEHN9 , 测定其在番茄等 10种
常见经济作物的 15个品种 (表 2)上的繁殖力 。其中 , 番茄品种 Nem arex携带有抗南方 、爪哇和花生
根结线虫的基因M i, 烟草品种 NC95对多数南方根结线虫群体表现抗性。将供试作物品种播种于灭菌土
中 , 出苗后选取长势一致的植株移栽于装有灭菌土 、直径为 6 cm 的塑料杯中 , 在温室中培育 2周 。从
繁殖有供试线虫群体的感病番茄江蔬 3号的根系表面挑取线虫卵块 , 置于灭菌水中在 25 ℃的生物培养
箱中孵化 48 h, 将新鲜孵化得到的二龄幼虫配制成 50条 mL - 1的二龄幼虫水悬浮液 。按每株 100条幼
虫的接种量将各线虫群体的二龄幼虫悬浮液分别滴注于杯栽植株的根部 , 以感病番茄品种江蔬 3号为对
照 , 各处理重复 4次。接种后 , 将各植株随机排列于温室内的平台上。于 20 ～ 28℃下培育 60 d后 , 缓
慢取出植株的根系 , 在水中洗净后置于体视显微镜下观察记录各株根表形成的线虫卵块数。计算各供试
线虫群体在待测作物品种上形成的卵块数与在感病番茄江蔬 3号上形成的卵块数的比值 (即繁殖指
数 ), 并按 Duncan氏新复极差法测验各处理间的差异显著性 。以繁殖指数为标准判断各作物品种对供
试线虫群体的寄主适宜性 , 同时观察线虫群体间是否存在致病性变异 。
2　结果与分析
2.1　形态鉴定
显微观察显示 , 海南省儋州 、琼海和澄迈 3地侵染番石榴植株的 9个纯化的根结线虫群体的雌虫会
56 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 28卷
阴花纹形态在群体内均呈现一定的变异性 , 但群体间具有高度的相似性 , 可能属于同一种类。其主要特
征为:整体呈卵圆形至椭圆形 , 线纹较平滑;背弓常较高 , 呈方形或近圆形;无明显侧线;阴门区一般
无线纹 (图 1 A至图 1 D)。根据这些会阴花纹特征 , 可大致判断 9个根结线虫群体与已知种南方根
结线虫 (M. incognita)、 花生根结线虫 (M. arenaria)或象耳豆根结线虫 (M. en terolobii)近似 [ 7] 。
但由于根结线虫在会阴花纹形态特征上常存在一定的种间相似性 , 据此尚不足以判定确切的种类。
图 1　海南省侵染番石榴的根结线虫群体的代表性雌虫会阴花纹形态 (×800)
Fig.1　Typ ica l fem ale per inea l patterns ofM eloidogyne popu lation s in fecting guava in Ha inan Province
(图示的会阴花纹形态变异类型在 9个供试线虫群体中均有发生。
The perineal pattern varian ts show nw ere found in each of the 9 popu lations exam ined. )
2.2　同工酶鉴定
9个群体的 2种同工酶的表型一致 , 即 M dh单
条酶带 , 电泳相对迁移率 (Rm )约 0.30, 为 N1a
型 [ 6] ;Est两条主要酶带 , Rm 分别约 0.36和
0.43, 为 VS1 S1型 [ 6] (图 2, 表 1)。由于以往
研究已证明 Mdh-E st表型是根结线虫种类鉴定的可
靠依据 [ 6, 8] , 根据已建立的 Mdh-Est表型与种类的
对应关系[ 6] , 可判定海南省侵染番石榴的 9个根结
线虫群体均为象耳豆根结线虫 (M. enterolobii)。
2.3　寄主范围测试
如表 2所示 , 4个线虫群体间在各供试作物品
种上的繁殖力未见有显著差异 。依据繁殖指数 , 10
种作物针对象耳豆根结线虫的寄主适宜性可分为 3
个类别:抗性番茄 、 茄子 、辣椒 、烟草 、 菜豆 、豇
图 2　海南省侵染番石榴的根结线虫群体的苹果酸脱氢酶
和酯酶的表型
F ig. 2　Malate dehydrogenase (Mdh) and esterase (Est)
phenotypes of M eloidogyne popu lations infecting
guava in Ha inan Prov ince
　 (1.Reference popu lation ofM. javanica; 2.MEHN1; 3.M EHN2;
4.MEHN3; 5.MEHN4; 6.MEHN5; 7.MEHN6; 8.M EHN7;
9.MEHN8;10.MEHN9)
豆 、黄瓜和西瓜为高度适宜寄主 , 线虫繁殖指数为 0.69 ～ 1.45, 供试品种中未见抗性品种;大豆为低
度适宜寄主 , 线虫繁殖指数为 0.02 ～ 0.56, 其中品种合丰 29具有强抗性;棉花为非寄主 , 线虫在其
上不能繁殖 。值得指出的是 , 供试作物中的番茄品种 Nemarex携带有抗常见种类南方根结线虫 (M. in-
cogn ita)、 爪哇根结线虫 (M. javan ica)和花生根结线虫 (M. arenaria)的抗性基因 M i, 烟草品种
NC95具有对多数南方根结线虫群体的抗性 , 4个线虫群体均可在 Nemarex和 NC95上大量繁殖 (表 2),
表明象耳豆根结线虫具有克服M i和 NC95抗性的能力 。
3　讨论
根结线虫的种类鉴定方法目前主要有形态鉴定法和同工酶谱法。形态鉴定主要依赖于雌虫的会阴花
纹特征 , 但由于多数根结线虫在该特征上常存在一定的种内变异性和种间相似性 , 形态鉴定常常显得不
可靠。而同工酶谱法 , 尤其是酯酶和苹果酸脱氢酶的联合酶谱法则十分可靠 [ 6, 8] 。事实上 , 同工酶分析
目前已成为根结线虫种类的日常鉴定和发现新种的最重要手段。本研究对海南省 3地侵染番石榴的 9个
57 第 4期　　　　　　　　刘昊等:海南省番石榴根结线虫病病原的种类鉴定及其寄主范围的测试
表 2　4个象耳豆根结线虫群体在 10种经济作物 15个品种上的繁殖指数
Tab le 2　R eproduc tion index of4 popu lation s ofM eloidogyne en terolobii on 15 cu lt ivars of 10 econom ic crops
作物品种 Cu ltivar 象耳豆根结线虫群体 M.en terolob ii popu lations
MEHN1 MEHN2 MEHN5 M EHN9
番茄 Tom ato
　江蔬 3号 Jiangshu 3 1. 00 bcd 1.00 bc 1. 00 bc 1. 00 bcd
　N em arex 0. 75 cd 0.73 c 0. 78 d 0. 92 cde
茄子 E ggp lan t
　苏畸茄 Suqiqie 1. 22 abc 1.07 b 0. 79 d 0. 75 def
辣椒 Pepp er
　江蔬 2号 Jiangshu 2 0. 70 d 0.81 bc 0. 72 d 0. 74 def
　苏长红 Suchanghong 0. 94 bcd 0.97 bc 0. 74 d 0. 81 def
烟草 Tob acco
　NC95 0. 73 cd 0.83 bc 0. 75 d 0. 96 bcd e
　Xan th i 1. 36 a 1.02 bc 1. 00 bc 1. 13 bc
菜豆 K idney b ean
　81 6 1. 35 a 1.37 a 1. 27 a 1. 45 a
豇豆 C ow pea
　早豇 9443 Zaojiang 9443 1. 03 bc 1.06 b 1. 16 ab 1. 20 b
大豆 Soyb ean
　合丰 29H efeng 29 0. 05 ef 0.02 e 0. 02 f 0. 02 g
　合丰 35H efeng 35 0. 31 e 0.45 d 0. 29 e 0. 56 f
黄瓜 C ucumber
　露丰 Lu feng 0. 90 cd 0.90 bc 0. 84 cd 0. 87 de
西瓜 W aterm elon
　苏密 5号 Sum i 5 0. 69 d 0.91 bc 0. 74 d 0. 72 ef
棉花 C otton
　Deltapine 16 0. 00 f 0.00 e 0. 00 f 0. 00 g
　33B 0. 00 f 0.00 e 0. 00 f 0. 00 g
　　注: 1) 繁殖指数 =各线虫群体在供试作物品种上产生的卵块数与在感病对照江蔬 3号番茄上产生的卵块数之比。 2) 表中数据为 4
次重复的平均值。 3)同列中标有不同字母的平均值按 Duncan氏新复极差法测验差异显著 (P≤0. 05)。
　　Note:1) Rep roduction index=Num ber of egg m asses p roduced on tested crop cu ltivars /number of egg m asses p roduced on the su scept ib le con-
trol Jiangshu 3 of tomato by each nem atode popu lation. 2) Data in the tab le are m eans of four rep lications. 3) M eans in colum ns fol-
low ed by differen t let ters are sign ifican tly differen t accord ing to Duncan′s test (P≤ 0. 05).
根结线虫群体的观察显示 , 病原线虫的雌虫会阴花纹形态类似于南方根结线虫 、花生根结线虫或象耳豆
根结线虫 , 进一步依据其苹果酸脱氢酶和酯酶表型明确地将这 9个线虫群体鉴定为象耳豆根结线虫 。这
一结果表明同工酶分析对于象耳豆根结线虫的正确鉴定十分必要 。需要指出的是 , 海南省番石榴根结线
虫病已有依据形态特征将病原鉴定为南方根结线虫的报道 [ 3, 4] 。虽然本研究与以往研究使用的线虫样本
的采集地不同 , 但鉴于象耳豆根结线虫和南方根结线虫在雌虫会阴花纹形态上的近似性 [ 7] (图 1), 不
能排除以往研究对番石榴根结线虫病病原的种类存在误鉴定的可能。
象耳豆根结线虫最初报道于海南省儋州 , 原始寄主为象耳豆树 (En terolobium con tortisiliquum )[ 9] 。
迄今有关该线虫的研究报道极少。已记载的发生地仅限于海南省儋州和三亚 , 已记载的寄主有象耳豆 、
番茄 、 西瓜 、辣椒 、 烟草和棉花[ 9, 10] 。本研究的病原种类鉴定及病原线虫在常见经济作物上的繁殖力测
试结果 , 进一步丰富了象耳豆根结线虫的寄主范围信息 。本研究新发现番石榴 、菜豆 、 豇豆 、 黄瓜和携
带M i抗性基因的番茄为象耳豆根结线虫的高度适宜寄主 , 大豆为低度适宜寄主 。证实了普通番茄 、西
瓜 、辣椒 、 烟草为高度适宜寄主。但与棉花为象耳豆根结线虫的中度适宜寄主的报道 [ 9]不同 , 本研究
显示棉花为 4个供试线虫群体的非寄主 (表 2)。考虑到之前研究及本研究均测试了棉花品种
Deltapine 16 ,试验结果的不同可能源于不同的供试线虫群体间存在致病性变异的缘故 。因此 , 在今后的
研究中有必要测试更多的线虫群体 , 以明确象耳豆根结线虫的致病性变异类型 , 为该线虫的防治提供依
据 。
虽然本实验测试的作物种类尚十分有限 , 但大多数供试经济作物品种均为高度适宜寄主。这一事实
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提示象耳豆根结线虫可潜在地对农业生产造成巨大的经济损失。鉴于象耳豆根结线虫的广寄主性以及克
服番茄M i基因抗性的能力 (表 2), 生产上利用轮作和现有抗性作物品种控制其危害具有明显的局限
性 。因此 , 在海南省该线虫的严重发生区 , 目前可考虑适当合理地使用化学杀线虫剂来控制线虫的发生
和传播蔓延 。另一方面 , 考虑到象耳豆根结线虫的发生目前尚局限于海南省 , 相关的植物检疫机构应及
时采取有效的检疫措施阻止该线虫向海南省外其他地区的传播和扩散 。
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责任编辑:夏爱红
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