全 文 ：植物生理学报 . Ao ta p入 yto 户 I : ys0` 1。乡`。 s诬。 i `。 99 1 4, 20门 ) : 6 1一 6 8
百 日草游离叶肉细胞导管分子分化过程中过氧化物酶的催
化特性
黄祥辉 刘淑明 王 隆华 李人圭 颜季琼
(华东师范大学生物学 系 ,上海 2 0 0 0 6 2)
提要 : 百 日草游离叶 肉细胞随着导管分子
的分化 , 木质素含量逐渐增加 ; P 0 1 ( 可溶 性
OP )
、
P o 皿 ( 与细 胞 壁 离子型 结 合的 P o ) 和
PO , (与细 胞壁共价结合的 P (〕 )活性增加 , 并
分别对底物愈创木酚 、 一-J 子香酚 和咖啡酸 (含
阿魏酸 ) 有较 大的 亲和 力 ; 抑制 剂对 P O 活性
抑 制的动 力学特性表明 . 间苯三酚为竞争性
抑制 剂 , 硫酸亚铁 按和 二硫苏糖醉是昨竞 争
性抑制剂 。
关银词 : 木质 素 , 过 氧化物酶 . 抑 制剂 , 导
管分 子分化 , 叶 肉细胞 , 百 日草
本世纪 50 年代以来 , 人们一直在寻找
可用来研究细胞分化的单细胞体外培养实
验系统 。 K o h一e n b a e h 和 cs h m i d t ( 1 9 7 5 )首次
报告用机械分离的百 日草细胞通过体外培
养 , 在 d3 内不经细胞分裂直接分化为 T E 。
F u k u d a 和 K o m a m i n e ( 1 9 8 o a , b )发展并建立
了百 日草叶肉细胞的单细胞分化 T E 的实
验系统 。 由于 T E 的形成特征明显 , 目前 已
广泛将其作为研究细胞分化的模型系统 。
在 T E 分化过 程中 , 常发 生一些 特殊
的生物化学变化 , 特别是 T E 的特征性组
分木质素的大量合成 。 H ha l br oc k 和 G ir se -
ba hc ( 19 7 9) 提 出 ,木质素的生物合成 , 包含
了一系列酶催化的生物化学反应 。 研究表
明 , P o 是 百 日草 T E 分化 的标 志酶 之 一
( F u k u d a 和 K o m a m i n e 1 9 8 2 ) 。 但是 , 以往对
百 日草 T E 分化过程中 P o 的催化特性还
缺乏系统报道 , 为此我们开展了这方面的
工作 。
材 料 与 方 法
百 日草 ( iz 。 。 e le卯。 L . ) 材料准 备按
F u k u d a 和 K o m a m i n e ( 19 8 0 a )方法 。 种子用
0
.
1%次氯酸钠表面灭菌 10 m in . 自来水冲
洗后在湿润的蛙石上于 27 士 I C萌发 。 先
置于黑暗中 , 种子露 白后再在 12 h 光照 、
1 2 h 黑暗的光周期下生长 , 至第 3 天加适
量无机元素 ( N : P : K 一 l : 2 : 1 , 重量 比 )
于蛙石中 。 取苗龄 14 d 的第一对真叶为试
材 。
叶肉细胞的分离和培养 真叶 (约 50 ml
培 养液用 0 . 5 9 叶片 ) 用 0 . 05 %次氯酸钠
表面灭菌 10 m in , 然后用无菌重蒸馏水冲
洗 4 次以上 ,再用无菌培养液洗 1 次 , 用少
许培养液在研钵中研磨约 1 m in 。研磨液经
5 0 ~ 7 0 拼m 孔径的尼龙网过滤 。 滤液经 2 0 0
x g 离心 5 m in ,收集沉淀 。 沉淀用培养液
洗数次 , 最后将细胞悬浮于培养液中 ,调节
细 胞密 度为 0 . 5 x l 护 个 /ml , 在摇 床 ( 30
次 / m in )中于 2 7士 I C 下暗培养 。
培 养 基 按 F u k u d a 和 K o m a m i n e
( 19 8 0a )
, 含蔗糖 2 9 / L ,甘露醇 0 . 1 m o l / L ;
生长物质 : 基础培养基为 N A A 2 m g / L , 6 -
B A 0
.
0 01 m g / L
,
T E 诱导培 养基 为 N A A
0
.
2 m g / L
,
6
一
B A 2 m g / L
。
木质素含量测定 通过离心收集细胞 , 在
1 9 9 2
一
0 7一 0 7 收到 . 飞9 9 3一 0个 1 3 修回 。
国家自然科学基金资助项 目。
缩写 : p o : 过氧化物酶 ; T E : 导管分子 ; G u : 愈创木
酚 ; c A R : 丁子香酚 ; c A : 咖啡酸 ; F A :阿魏酸 。
植 物 生 理 学 报 2 0卷
95 %乙醇中用玻璃匀浆器匀浆 , 经 1 0 0 x
g 离心 5 m in 后收集的沉淀用 95 % 乙醇洗
3 次 。 再用乙醇 : 正己烷 一 1 : 2( V : V )液
洗 3 次 ,收集沉淀使干燥 。 木质素含量测定
方法按 M o r r i s o n ( 一9 7 2 ) 略加修改 , 样 品干
燥 物 用 25 %嗅 乙 酞 冰醋 酸洗 后 , 溶 解 于
2 5% 澳乙酸冰醋酸中 ,在 7 0 C 恒温水浴加
塞保温 3 0 m i n , 然后加 0 . 9 m l 2 m o l / L 的
N a o H 终止反应 。 加 5 m l 冰醋酸和 0 . 1 m l
7
.
5 m of / L 轻胺盐酸 , 并用冰醋酸 定容至
一o m l , 10 0 0 火 g 离心 s m i n , 取上清 液在
2 8 0 n m 处测定吸收值 , 并以 70 m l 细胞悬
液的 八 2、 。表 示木质素含量 ( F uk ud a 和 K O -
m a m in e 19 8 2 )
。
过氧化物酶提取和活性测定 通过离心收
集细胞 , 以 p H 6 . 0 0 . 05 m ol / L 的磷酸缓冲
液洗数次 , 经玻璃匀浆器匀浆后 , 在 5 0 义
夕 离心 s m i n , 取上清液用 1 8 0 0 0只 夕离心
2 0 m i n
,上清液即为 p o l (可溶性 p o ) ;将
上述 5 0 x g 离 心 5 m in 后沉淀物反复以
磷酸缓冲液洗至无 P o 活性 , 所得沉淀在 l
m of / L 的 N a CI 中于 2 5 C下保温过夜 ,再用
1 8 0 0 0 x 夕 离心 2 0 m i n , 上 清液 为 p O H
( 与细胞 壁离子型结 合的 P o ) ; 沉淀物用
p H .5 6 .0 1 m of / L 的磷 酸缓 冲液洗 至无
P O 活性 ,然后以 0 . 5 写 纤维素酶和 2 . 5%
果胶酶的 p H 5 . 6 0 . 1 m of / L 的磷酸缓冲液
在 25 ` C下酶解过夜 , 用 18 O0 x g 离心 20
m in
, 上清液 为 P o l (与细胞壁共价结合
的 p o ) 。 p o 的活性按 G i比 o n 和 L i u ( 19 7 8 )
方法测定 。 测定温度 25 C , 底物浓度和反
应 系统见表 1 。 蛋 白质含量按李琳和焦新
之 ( 19 8 0 )方法测定 。
表 1 P o 活性测定的反应系统
T a b l e 1 R e a e t i o n s y s t e m f o r P O a e t i v i t y d e t e r m i n a t i o n
C o n e
.
o f s u比 t r a t e C o n e . o f H , O ,
( m m
o l / L ) ( m m o l / L )
W
a v e le n g th
(
n m )
0
.
9
0
.
9
6
.
6
.
0
.
9
0
.
9
8
.
0
8
.
0
4 7 0
4 0 0
4 3 0
4 0 0
AU,RHA夕勺GC孙F
In e u b a t i o n t i m e n l l n 。
令十二曰 果
细胞培养中 T E 数量和木质素含量变化
从图 1可见 , 在 T E 诱导培养基 中 , T E
的分化从第 3 天开始 ,第 6 天达到高峰 , 在
基础培养基中未见 T E 产生 。 木质素含量
的递增在基础培养基中是低而平稳 的 , 而
在 T E 诱导培养基中第 5 天迅速增加 , 第 6
天达到高峰 。
T E 诱导培养中 P O 催化 不同底物的动力
学特性
在培养 s d 内 , P O I 和 P O I 分别与
C U
;和℃入R 亲和力最大 , 而 P o l 在培养 0
一 4 d 和 5一 s d 分 别与 c A 和 F A 亲和 力
最大 (表 2 ) 。 因此 , G u 、 e A R 、 e ^ 和 F A 分
别是 P O I 、 P O I 、 P O 可的最适底物或天
然底物 。在以 下工作中 ,均分别以亲和力最
大的最适底物进行生化测定 , 并把这些酶
1期 百 日草游离叶肉细胞导管分子分化过程中过氧化物酶的催化特性
表 2 P o 对 4种不同底物催化反应的 K 。 值
aT bel 2 K
m o f P o
一
ac at 一y z ed r ae e t i o n 可 f o u r d i r f e r e n t s u比 tr a t e s ( m m o l / L )
P O I
( 0~ sd )
P O 皿 P O I
( 0一 s d ) ( 0~ 4d ) ( 5一 s d )
0
.
32
1 7
l 9
1
.
42
0 3 0
2 6
8 0
1
.
32
0
.
76
0
.
9 8 0
.
42 0
.
5 9
U以AAH孙G孙C
F A 1
.
3 1 0
.
6 9 0
.
6 7 0
.
2 1
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0卜zor“V)
2 3 4 5 6
T im . 0 1 e d t少一 ( d )
p
{岁笋分
图 1 百 日草游离叶肉细胞在基础培养基 (护 )和
T E 诱导培养基 ( . )中时木质素含量和有 T E 形成
的细胞百分率的变化
F坛. 1 hC a n罗 o f 11, jn e o n t e n t a n d 讲 r e e n at g e o f
ce l l s w i th T E f or m a t i o n in i s o l a tde Z切 n砚 nr se o Ph y l l
ce l l s in 加 as l m de i u m ( ( ) ) o r in th e T E一 i n d u e i n g
m de i u m (. )
2 3 4 5
,
T lll ” o f e u l t u r . ( d )
与底物的组合分别称为 p o l ( G U ) 、 p o l
( C A R )
、
p o l ( C A )
、
P o l ( F A )
。 培养过
程中 P O 对最适底物的催化活性变化
除 p o x ( o u )外 , P o l ( e A R ) 、 P o
, ( C A )
、
OP , ( F
A )的催化 活性 , 在 T E
诱导培养基中要 比在基础培养中高 , 并出
现高峰 (图 2 ) 。
抑制剂的影响
抑制剂对 P O 活性的抑制动 力学特性 为
确定各种抑制剂对 P O 活性抑制性 质 , 我
们将抑制剂浓度不变而底物浓度变化时的
p o 活性数据按 L i n e w e a v e r 一 B u r k 双倒数法
图 2 百 日草游离叶肉细胞在基础培养基 ( a )和
T E 诱导培养基 (b )中的 P o 活性变化
F坛 . 2 C h a n g e s o f P 0 a e t i v i t y i n i s o l a ted Z祝 n故 m es -
o P h y l l e e l l s i n ( a ) ba sa l m ed i
u m a n d ( b ) T E
一
i n d u e i n g
m ed jU m
作图 ,即图 3 。
图 a3 一 d 表明 , 间苯三酚对 P O 的抑制
属于竞争性抑制 , 酶催化反 应的 +mI a x 不受
竞争性抑制的影响 , 但 K , 值增大 。 如果用
K 、 (抑制常数 )表示抑制程度的大小 , 那么
当间苯三酚和底物浓度给定时 , K i 值与抑
制 程度 成反 比 。 即 P o l ( c u ) 、 P o :
( C A )
、
P O 皿 ( C A R )和 P o l ( F A )对 间苯
三酚的 K i 值依次为 1 . 8 、 0 . 4 、 0 . 3 和 0 . 1
m m of / L
,抑制程度依次加强 。
硫酸亚铁钱对 P o l ( G U ) 的抑制属
6 4
植 物 生 理 学 报 2 0卷
于非竞争性抑制 。 反应的 氏 a 、变小而 K , 不
变 ,其 兀 , 值为 0 . 5 m m o 、 / L ( 图 3 e )
D T T 对 p o 班 ( F A ) 、 P O I ( C A )和 P o
。 ( c A R ) 的抑制属非竞争性抑制 , 反应的
r m
a x 变 小而 K m 不 变 , 它 们的 K l 依 次 为
2
.
6
、
2
.
0 和 0 . 9 m m o l / L , 即抑制程度由小
至11大 (图 3 f一 h ) 。
尸 -
p o , ( C八 )
O甘自O
.00
.
9
0
.
6 灯 《 , )
0
.
3 0
.
3
,
O甘自七
:
内 U八甘
0
.
9 州】 t (下八 )
0
.
6
0
.
3
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.
3
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.`
目|口一,
里甘介止/
po l (以月)
t曰,`
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.日|
|
ǎ冬\`厄uō: o匕.E)沙二ō芍.0飞尸
甘贾,`p O I ( C八 )
塌严笃万宁~ 亨一 汤一云一二牙一 1 0 2 4 .
( C翻` . 州甘一如 , 时 “ 山 .份 一切 ) 一 , X 10 . ( n创 / L ) 一 ,
图 3 在不 同 底物浓度时 ,
L i n e w ea v er
一
uB
r k 图
抑制剂 ( . ) 和 非抑制剂 ( O )培 育的 百 日草游离 叶肉细胞 OP 活性的
珑 . 3 L i
n e w e a v et
一
uB
r k PI O t s of P ( ) ac t iV i t y s u 比t r a t e c o n c e n t r a t l o n
o f i s o l a t e d Z玩犯必 m es o hP y l l ce l l s i n e u比 ted
w i th ( . ) a n d w iht o u t ( ( 、 ) in h i ib tor s
a 一 d : P h l o r o gl u e in ol ; e : A m m o n i u m f盯 r ou s s u l f a et ; f一 h ; D 尸r T ,
1期 百 日草游离 叶肉细胞导管分子分化过程中过氧化物酶的催化特性
抑 制剂对 系统 内 P O 活性 的 影响 在 T E
诱导培养基中培养 3 . s d 后加入抑制剂 ,
间苯三酚对各部 分 P O 活性 都有抑 制作
用 ; 硫酸 亚铁按对 P O 工 ( G u ) 的抑 制 明
显 , 但对其他几部分 P o 活性抑制很小 , 且
峰位后移 1 2 h ; D T T 对 P o l 、 P o m 有抑
制作用 ,但对 P O I ( G U )无抑 制作用 ( 图
4 )
。
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T im e o f e u ! t u r . ( d )
图 5 抑制剂对百 日草游离叶肉细胞木质素含量
和有 T E 形成的细胞百分率的影响
F ig
.
5 E f f e e t s o f in h ib i t o r o n l ig n i n c o n t e n t a n d eP
r -
e e n at g e o f e e l ls w i th T E f o r m a t i o n o f i s o l a t e d Z王双 n故
m e s o Ph y l l e e l l
a
.
P h l o r o g l u c i n o l ; b
.
A m m o n i u m f e r r o u s s u l f a t e ; e
·
1) T T
.
3 4 5 6
T . 1翎 o f e u lt u r . ( d )
讨 论
图 4 抑制剂对百 日草游离叶肉细胞 P o 活性的
影响
iF g
.
4 E f f e e r s o f i n h i bi t o r s o n P O a e t l v i t y o f i s o l a t
-
de Z ul n故 m es o P h y l l e e l l s
a
.
P h l o r o ig u e i n o l ; b
.
A m m o n i u m f e r r o u s s u l f a t e ; e
.
D T T
.
抑制剂对培养细胞木质素合成和 T E 分化
的影响 图 5 表明 ,加入间苯三酚后 ,木质
素含量增加类似基础培 养基 , 未 见 T E 形
成 ;硫酸亚铁按加入后 , 木质素含量变化与
T E 诱导培养基相似 。 但峰位后移 12 h , T E
分化时间也后移 ; 加入 D T T 后 , 木质素含
量变化也类似基础培养基 , T E 分化细胞数
近于零 。
T E 诱导培养中 P O 活性与木质素合成 、 T E
分化的关系
关于 P O 的 底物专一性 高等植物 P O 的
底物专一性 比较复杂 ,在催化各种底物的
能 力上往往不同 。 在研究细胞分化中 P O
活性与木质素合成的关系时 , 以前多数以
G u 和联 苯胺为底物 , 但它 们并非木质素
合成的 自然前体 。 因此各部分 P O 活性变
化 , 不能 真正说 明 P o 活性在木质 素合成
中的作用 。 我们选用 c A R 、 c A 和 F A 作为
P o 的底物是根据它们在木质素合成中可
能 的 作 用 ( G i b s o n 和 L i u 一9 7 5 ) 。 s i e g e l
( 1 9 5 5 )在辣根 p o 对 e A R 的反应中发现有
木质素的合成 。 在仅由 P O 和 F A 组成的体
6 植 物 生 理 学 报 2 0卷
系中也获得了木质素 ( s r a f f o r d 19 6 4 ) 。 有人
认为 , 在烟草愈伤组织 的 T E 中存在 2 种
特 殊 的 、 以 F A 作 为 底 物 的 P O 同 功 酶
( P ie 、 e r s n g 等 1 9 7 6 ) ; e A 也能作 为 p o 的
底物被利用 ( s h e e n 1 9 7 4 ) : K u bo i 和 Y a m a -
d a ( 19 7 8 )
、 砚 11 ( 1 9 8 1 ) 、 余沛 涛和 薛应 龙
( 198 7) 也提 出 F A 和 c A 是 木质素合成的
前体 。 从本实验看 , 在培养的 s d 内 , P O I
和 P o l 分别与 G U 和 C A R 亲和力最大 ,
而 P o 班在培养的 O一 4 d 和 5一 s d 分别
与 c A 和 F A 亲和力最大 (表 2) 。 这说明各
部分 P o 在木质素合成中优先利用底物有
差异 ,因而出现不同的生理功能 。
P O 活性 与木质素合 成的关系 F uk du a 和
K o m a m in e ( 19 5 2 ) 在百 日草游离叶 肉细胞
系统中以 G u 为底物所做的试验结果认 为
P o l
、
P o , 合成与木质素有关 。 本实验结
果表明 , P o l ( G u ) 的活性 , 在 T E 诱 导培
养基中与基础培养基中相差无几 ; 但 P o m
( e A )
、
P o l ( F A )
、
P o l ( e A R ) 的活性 , 在
前者中要比在后者中高得多 ( 图 2 ) 。 可见 ,
在百 日草叶肉细胞分化成导管过程中的木
质素合成 , 不是 P o l ( G U ) , 而是 p o 皿
( e A )
、
P o l ( F A )和 P o l ( e A R )在 起作
用 。 c A 、 F A 和 c A R 可能是木质素合成的
直接前体 。 因此按以上结果结合前人的工
作 ( L e w i s 和 Y a m a m o t o 一9 9 0 ) 可得 出如 下
木质素合成简图 。
抑制剂对 P O 的作用
从抑制动 力学特性分析 ( 图 3) 看 . 间
苯三酚对 P O 的抑制属竞争性抑制 。 间苯
三酚对 P o l (C A R ) 活性抑制 最明显 ,这
可能是它与 c A R 的竞争最强烈 。 加入间苯
三酚 , P O I ( C A R ) 、 P o l ( C A ) 、 p o 皿 ( F A )
受明显抑制 ,木质 素合成完全停止 . T E 也
不形成 (图 4 、 5 ) 。 因此 ,进一步说 明了它们
的活性是木质素合成所必需的 。
硫酸亚铁按对以 G U 为底物的各部分
P o 有 非 竞 争 性 抑 制 作 用 , 但 对 P O I
( C A R )
、
p o 皿 ( C A ) 和 p o l ( F A )无抑制
作用 ( 图 4 ) 。 因此 , 它对木质素合成和 T E
形成无明显影响 。 但它使木质素合成的峰
位后移 l2 h( 图 5 ) ,其原因还不清楚 。
o T T 对 P o l ( e A R ) 、 P o l ( e A 或
F A ) 有强烈的非竞 争性抑制作用 ( 图 3 ) ,
对 p 0 I ( C A R 或 C A 、 F A )也有抑制作用 .
但对以 G U 为底物的各部分 P O 无影响 (图
4 )
。 这些结果暗示 , D T T 对 P o 催化天然底
物 C A R 、 C A 、 F A 有 比较专一的抑制作用 ,
并抑制木质素合成和 T E 分化 。 因此 , P o
活性 专一性抑制 剂 D T T 同时也是木质素
合成和 T E 分化的抑制剂 。 这进一步提示
P o 活性参与了木质素合成和 T E 分化 。
笨丙 氨酸
` p ; L
备
ù外
木质 家
! 期 百 日草游离叶肉细胞导管分子分化过程中过氧化物酶的催化特性 67
参 考 文 献
李 琳 ,焦新之 。 应 用蛋白染色剂考 马斯蓝 G 一 2 50 测定
蛋白质的方法 。 植物生理学通讯 19 8 0 (6 ) : 52
余沛涛 , 薛应龙 。 植物苯丙氨酸解氨酶 ( P A )L 在细胞
分化中的作用 。 植物生理学报 19 87 , 1 3 : l d
eB l l A A
.
B ioc h e m i e a l m e e h a n i s m s o f d i s e a s e r e s i s
-
t a n e e
.
nA
n 枷 子吸功 z lP 岁习衣之 19 8 1 , 3 2 : 2 1
F u k u d a H
,
K o m a m i n e A
.
a t
a b l i s h rn e n t o f a n e x pe r i
-
m e n t a l s y s t e m f o r t h e s t u d y o f t r a e h e a r y e l e m e n t
d i f f e r e n t i a t i o n f r o m s i n g l e e e l l i s o l a t ed f
r o m r h e
m e s o Ph y l l o f Z `n n 。 硬钾少卯。 . 产吸 Jo t hP ,入汉
19 8 0 a 6 5
:
5 7
F u k u d a H
,
K o m a m i n e A
.
D i r e e t e v id e n e e f o r e y tod i f
-
f e r e n t i a t i o n t o t r a e h e a r y e l e m e n t s w i t h o u t i n t e r
-
r e n i n g m i t仍15 i n a e u l t u r e o f s in g l e e e l l s i s o l a tde
f r o m t h e m e s o P h y l l o f Z 之n n 。 遥咖萝I n 、 . 了伪泣nt
l,lI 夕习云牙 19 8 0 b , 6 5 : 6 1
F u k u d a H
,
K o m a m i n e A
.
L ig n i n s y n t h e s i s a n d i t s r e
-
l a t e d e n z y rn 伪 a s m a r k e r s o f t r a e h e a r y e le m e n t
d i f f e r e n t i a t i o n i n s i n g l e e e l l s i s o l a t e d f r o m m e s -o
K o h l e n ba
e k HW
,
S e h m id t B
.
C y tod i f f
e r e n z i e r u n g i n
F o r m e i n e r d i r e k t o U m w a n d l u n g i s o l i e r t e r M e s o-
p h y l l z e l l e n z u T r a e h e id e n
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1 9 7 5
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Y a m a d a Y
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R e g u l a t i o n o f t h e e n z y m e a e t i v
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o l ig n i n s y n th es i s i n e e l l a g
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