全 文 ：山地农业生物学报 35(4) :0083～0087，2016
Journal of Mountain Agriculture and Biology
Box－Behnken 设计优化贵州野生地枇杷
总黄酮提取工艺
陈 琳1，2，3，俸婷婷1，2，3* ，游 婵1，李 超1
(1．贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025;
2．贵州省药食同源植物资源开发研究开发中心，贵州 贵阳 550025;
3．贵州省药食两用资源应用开发工程实验室，贵州 贵阳 550025)
摘 要:在各单因素实验基础上，以总黄酮提取率为指标，通过 Box－Behnken 响应面设计考察乙醇浓度、料液比、
提取时间、提取次数对地枇杷总黄酮提取工艺的影响，优化贵州野生地枇杷总黄酮提取工艺。结果表明:地枇杷
总黄酮的乙醇回流最佳提取工艺条件的酒精浓度为 70%，液固比 1 ∶ 15，提取时间为 30 min，提取次数为 3次，地
枇杷总黄酮提取率为 5. 09%。按最优提取条件进行 3次验证实验，最终地枇杷总黄酮平均提取率 5. 13%。本文
利用乙醇回流提取地枇杷总黄酮工艺操作简便，稳定可行。
关键词:地枇杷;乙醇回流提取;Box－Behnken设计
中图分类号:Ｒ283. 6 文献标识码:A
文章编号:1008－0457(2016)04－0083－05 国际 DOI编码:10．15958 / j．cnki．sdnyswxb．2016. 04. 015
Optimization of Extracting Total Flavonoids in Wild Ficus tikoua by Box－Behnken Design
CHEN Lin1，2，3，FENG Ting－ting1，2，3* ，YOU Chan1，LI Chao1
(1． School of Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2．Me-
dicinal and Edible Plant Ｒesources Ｒesearch and Development Center of Guizhou，Guiyang，Guizhou
550025，China;3． Medicinal and Edible Plant Ｒesources Application and Development Engineer Labora-
tory of Guizhou，Guiyang ，Guizhou 550025，China)
Abstract:In this research we tested the effects of ethanol concentration，solid－liquid ratio，time and period of extraction
on extraction rateof total flavonoids from F．tikoua by Box－Behnken design to optimize extracting technology based on sin-
gle factor test． The results showed that，the optimum ethanol reflux extraction conditions of total flavonoids in F．tikouawas
as follow:extracting 3 times with the alcohol concentration of 70%，liquid－solid ratio of 15，30 min each time．The yield
of total flavonoids was 5．09%． The optimum extraction conditions wasverifiedforthree times，and the average yield of total
flavonoids was 5．13%． Extracting total flavonoids from wild F．tikoua by ethanol reflux process is a simple，stable and fea-
sible method．
Key words:Ficustikoua;Ethanolreflux extraction;Box－Behnken design
收稿日期:2016－05－03;修回日期:2016－05－19
基金项目:贵州省科学技术基金项目(黔科合 J字［2012］2173号) ;贵州省科技合作计划项目(黔科合 LH 字［2015］7666 号) ;贵州省药食同
源资源研究开发科技创新人才团队(黔科合人才团队(2015)4010 号) ;贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心(黔科合 G 字
(2015)4001) ;贵州省药食两用资源应用开发工程实验室(黔发改投资［2015］542号) ;贵州省中药民族药制药工程专业学位研究生工作站
(黔教研合 JYSZ字［2014］002)。
* 通讯作者:俸婷婷(1983－) ，博士，副教授，主要研究方向:药理学;E－mail:ftt0809@ 163．com。
地枇杷 (Ficus tikoua Bur)也称地果、地瓜、
地石榴，为桑科榕属匍匐木质藤本，茎上生细长
不定根，节膨大，花期 5 ～ 6 个月，果期 7 个月，
榕果成熟可食［1］。地枇杷味苦、性寒，清热利湿、
活血通络、解毒消肿，主治肺热咳嗽、痢疾、小
儿消化不良、风湿疼痛、带下、跌打损伤［2］。榕
属植物主要含有萜类、黄酮、香豆素、生物碱等
化学成分，国内外对该属植物的药理学研究表明，
该属植物具有降血糖、松弛平滑肌、抗肿瘤、抗
菌等作用，该属植物具有潜在的药食两用资源开
发价值［3］。贵州的地枇杷野生资源丰富，分布区
域广泛，并且长期作为苗族的习惯用药材。本实
验通过比较不同提取条件对地枇杷总黄酮乙醇回
流提取率的影响，在单因素实验基础上，采用 Box
－Behnken设计优化地瓜藤总地枇杷黄酮的提取工
艺，确定最佳提取工艺条件，为贵州野生地枇杷
资源的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
地枇杷植物采集于贵州省贵阳市花溪区，经
贵州大学熊源新教授鉴定为地枇杷 Ficus tikoua
Bur. 的全草。
芦丁对照品 (中国食品药品检定研究院，批
号 100080－200707) ，所用试剂均为国产分析纯。
1. 2 仪器与设备
ＲE－2000A 型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪
器厂) ;SHZ－95B 型循环水式多用真空泵 (郑州
长城科工贸有限公司) ;T6 新世纪型紫外可见分
光光度计 (北京普析通用仪器设备责任有限公
司) ;SG8200HPT型超声波清理器 (上海冠特超
声仪器有限公司) ;FA 2004 型电子天平 (上海良
平仪器仪表有限公司) ;DGG－9246 电热鼓风干燥
箱 (上海齐心仪器有限公司) ;HH－s2s 数显恒温
水浴锅 (金坛市大地自动仪器厂) ;DZF－6020 型
真空干燥箱 (上海博讯实业有限公司)。
1. 3 方法
1. 3. 1 总黄酮的含量测定 精密称取芦丁对照品
10 mg，置 50 mL量瓶中，加无水乙醇适量，超声
处理使溶解完全，加无水乙醇至刻度，摇匀，得
对照品溶液。准确吸取对照品溶液 1. 0、2. 0、
3. 0、4. 0、5. 0、6. 0 mL，分别置于 25 mL 量瓶
中，加水至 6 mL，加 5%亚硝酸钠溶液 l mL，摇
匀，放置 6 min，加 10%硝酸铝溶液 l mL，摇匀，
放置 6 min，加 4. 3% 氢氧化钠溶液 10 mL，加水
至刻度，摇匀，放置 l5 min，以相应试剂为空白，
于 500 nm处测定吸光度 (A) ，A为纵坐标，浓度
为横坐标，绘制标准曲线［4］，得到回归方程为:y
= 0. 0125x － 0. 0027 (Ｒ2 = 0. 9999)。
1. 3. 2 总黄酮提取率的测定 将不同提取方法所
得提取液浓缩后加无水乙醇溶解定容至 100 mL，
分别准确吸取定容溶液 1 mL，置于 25 mL 容量瓶
中，按 1. 3. 1 项下方法测定总黄酮含量，计算总
黄酮提取率。
1. 4 单因素实验考察
1. 4. 1 乙醇浓度 称取地枇杷粗粉 15 份，每份
3. 0 g，均分为 3 组，酒精浓度为 40、50、60、
70、80%，按料液比 1 ∶ 5 加入浸泡过夜，用水浴
控制恒温 75℃，每次提取 60 min。
1. 4. 2 料液比 称取地枇杷粗粉 15 份，每份
3. 0 g，均分为 3组，按料液比 1 ∶ 5、1 ∶ 10、1 ∶
15、1 ∶ 20、1 ∶ 25，加入 60%乙醇溶液浸泡过夜，
用水浴控制恒温 75℃，每次提取 60 min，考察料
液比对黄酮浓度的影响。
1. 4. 3 提取时间 称取地枇杷粗粉 15 份，每份
3. 0 g，均分为 3 组，按料液比 1 ∶ 15，加入 60%
乙醇溶液，浸泡过夜，75℃水浴恒温回流提取时
间分别为 30、60、90、120、150 min，考察提取
时间对黄酮得率的影响。
1. 4. 4 提取次数对黄酮得率的影响 称取地枇杷
粗粉 15份，每份 3. 0 g，均分为 3 组，按料液比
1 ∶ 15，乙醇浓度 60%寖泡过夜，用水浴控制恒温
75℃回流提取 90 min，分别为 1、2、3、4、5 次，
考察提取时间对黄酮得率的影响［5］。
1. 5 响应面设计实验说明
根据 Central Composite实验设计原理，综合单
因素实验结果，选取酒精浓度、料液比、提取时
间和提取次数 4 个因素为自变量，分别以 A、B、
C、D代表，每一个自变量的最低、中、高实验水
平分别以－1、0、1进行编码，以黄酮得率 Y为响
应值，进行响应面优化工艺［5－6］。中心点实验 5
次，因素水平编码见表 1。
48 山地农业生物学报 2016年
表 1 地枇杷总黄酮提取工艺优选 Box－Behnken
实验因素水平
Tab．1 The experimental design of extracting
technologyoptimization
因 素
水平
－1 0 1
A酒精浓度(%) 50 60 70
B料液比 1 ∶ 10 1 ∶ 15 1 ∶ 20
C提取时间(min) 30 60 90
D提取次数 1 2 3
2 结果与分析
2. 1 单因素实验考察
2. 1. 1 乙醇浓度 结果总黄酮提取率为 2. 69、
3. 15、3. 21、2. 59、2. 55%，表明 60%的乙醇使地枇
杷总黄酮的提取率达到最大值，增加乙醇浓度后总
黄酮提取率反而降低，可能其他非黄酮物质的提取
率增加导致总黄酮的提取率反而降低，因此酒精浓
度选择在 60%为宜。
2. 1. 2 料液比 结果总黄酮提取率为 2. 86、3. 21、
3. 50、3. 49、3. 42%，表明 1 ∶ 15 的料液比使地枇杷
总黄酮的提取率达到最大值，料液比增加后提取率
反而降低，可能是非黄酮类物质的溶解增加使得总
黄酮提取率反而降低，因此料液比选择在 1 ∶ 15 为
宜。
2. 1. 3 提取时间 结果总黄酮平均提取率为
3. 37、3. 49、3. 73、3. 74、3. 71%，表明 90 min 的提取
时间使地瓜地枇杷藤总黄酮的提取率达到最大值，
90 min以后提取率维持在一定水平，综合考虑时间
长短和能源损耗的因素影响选择 90 min 的提取时
间为宜。
2. 1. 4 提取次数对黄酮得率的影响 结果总黄酮
提取率为 3. 49、4. 09、4. 67、4. 99、5. 03%，表明 4 次
的提取次数使地枇杷总黄酮的提取率达到最大值，
增加提取次数后提取率维持在一定水平，综合考虑
时间长短和能源损耗的因素影响选择提取次数 3
次为宜。
2. 2 响应面设计实验
响应面设计优选地枇杷总黄酮，以总黄酮提取
率为考察指标，实验安排及结果见表 2。
表 2 地枇杷总黄酮提取工艺优选 Box－Behnken实验安排
Tab．2 The experimental arrangement of extracting
technology optimization
试验号
酒精浓度
(%)
料液比
(g /mL)
提取时间
(min)
提取
次数
黄酮率
(%)
1 0 0 －1 1 4. 85
2 1 －1 0 0 4. 26
3 0 1 1 0 4. 76
4 0 0 1 1 4. 95
5 1 0 0 －1 4. 01
6 1 0 0 1 4. 58
7 0 －1 1 0 3. 96
8 0 －1 0 －1 3. 77
9 1 1 0 0 4. 42
10 0 0 －1 －1 4. 08
11 0 0 1 －1 4. 85
12 0 0 0 0 4. 67
13 0 1 0 －1 4. 13
14 1 0 1 0 4. 55
15 0 0 0 0 4. 67
16 －1 0 1 0 4. 80
17 －1 0 0 －1 4. 05
18 1 0 －1 0 4. 90
19 0 1 0 1 4. 90
20 0 －1 0 1 4. 72
21 －1 －1 0 0 4. 12
22 －1 0 0 1 4. 73
23 －1 0 －1 0 4. 17
24 0 0 0 0 4. 67
25 0 1 －1 0 4. 61
26 0 0 0 0 4. 67
27 0 －1 －1 0 4. 61
28 0 0 0 0 4. 67
29 －1 1 0 0 4. 22
58第 4期 陈 琳，等:Box－Behnken 设计优化贵州野生地枇杷总黄酮提取工艺
表 3 回归模型方差分析
Tab．3 ANOVA of regression model
方差来源 S S df M S F P ＞ F
模型 2. 72 14 0. 19 5. 95 0. 0013
A 0. 03 1 0. 035 1. 07 0. 3191
B 0. 21 1 0. 21 6. 42 0. 0112
C 0. 03 1 0. 033 1. 02 0. 2121
D 1. 23 1 1. 23 37. 62 ＜0. 0001
AB 0. 71 × 10－3 1 0. 001 0. 022 0. 4908
AC 0. 24 1 0. 24 7. 35 0. 0574
AD 2. 84 × 10－3 1 0. 003 0. 087 0. 7614
BC 0. 16 1 0. 16 4. 90 0. 0440
BD 0. 01 1 0. 009 0. 27 0. 0472
CD 0. 11 1 0. 11 3. 40 0. 0986
A2 0. 23 1 0. 24 7. 19 0. 0197
B2 0. 35 1 0. 35 10. 76 0. 0041
C2 0. 06 1 0. 058 1. 78 0. 7557
D2 0. 05 1 0. 050 1. 52 0. 0429
残差 0. 46 14 0. 033
失拟项 0. 46 10 0. 046 94. 9 0. 0003
纯误差 1. 92×10－3 4 4. 80×10－3
总离差 3. 18 28
A
B
C
D
E
F
图 1 酒精浓度、料液比、提取时间、提取次数
相互作用对总黄酮提取率影响的响应面
Fig．1 Effects of ethanol concentration，solid－liquid ratio，
extracting times and period on extraction
rate of total flavonoids
68 山地农业生物学报 2016年
应用 Design－Exper 9. 0软件对表 2数据进行分
析，方差分析结果见表 3。结果表明，模型的“P ＞
F”值小于 0. 01，表明二次方程拟合极显著。酒精
浓度 A、提取时间 C的“P＞ F”值大于 0. 05，表明其
对总黄酮提取率影响不显著，料液比 B 的“P＞ F”
值在 0. 01至 0. 05间，表明其对总黄酮提取率影响
显著，提取次数的“P＞ F”值小于 0. 01，表明其对总
黄酮提取率影响极显著。二次项 B2的“P＞ F”值小
于 0. 01，表明其对总黄酮提取率影响极显著，A2、
D2影响显著，C2影响不显著。交互项 AC、BC、BD
达到显著水平，其他不显著。
回归 方 程 为 Y = 4. 67000 + 0. 05250A +
0. 13333B + 0. 05417C + 0. 32000d － 0. 19208A2 －
0. 23333B2+ 0. 09292C2 － 0. 09083D2 + 0. 01500AB －
0. 24500AC－0. 02750AD+0. 20000BC－0. 04500BD－
0. 16750CD，整体模型显著水平，P = 0. 01，表明该二
次方程模型达显著水平，拟合良好。
由图可知，提取次数和提取时间对地枇杷黄酮
得率的影响较大。利用 Design－Expert 软件求解方
程，计算出地枇杷总黄酮的最佳提取工艺条件的酒
精浓度为 70%，料液比 1 ∶ 15，提取时间为 30 min，
提取次数为 3 次，地枇杷总黄酮提取率为 5. 09%。
按调整的提取条件进行 3 次验证试验，最终地枇杷
总黄酮平均提取率 5. 13%，ＲSD 0. 79%与预测值较
为接近，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，
与实际提取试验结果拟合良好，对实际提取工作具
有一定指导意义。
3 结论与讨论
中药有效成分的提取过程往往会受到诸多因
素的影响，响应曲面优化法在中药有效成分的提取
应用中越来越受到重视［5，7］。本研究发现地枇杷总
黄酮乙醇回流提取工艺的主要影响因素为提取次
数和提取时间。通过数据统计分析得到地枇杷总
黄酮乙醇回流提取工艺最佳条件为酒精浓度 70%，
料液比 1 ∶ 15，此条件下提取 30 min，重复提取 3
次，按此预测的最优提取条件进行 3 次验证实验，
最终得到地枇杷总黄酮提取率为 5. 13%，表明响应
面设计得到的理论值与实际实验结果拟合良好，其
预测结果科学有效，对实际提取工作的重要指导意
义。贵州省野生地枇杷资源丰富，是提供提取黄酮
类化合物的优良资源。采用乙醇回流提取法提取
贵州地枇杷总黄酮具有提取率较高、操作方便、设
备简单且易于实现工业化等优点，也为贵州野生地
枇杷资源的有效开发利用提供科学途径与方法。
参考文献:
［1］ 中国植物志编辑委员会 . 中国植物志［M］. 北京:科学出版社，2006:156－157.
［2］ 关永霞，杨小生，佟丽华，等 . 苗药地瓜藤化学成分的研究［J］. 中草药，2007，38(3) :342－344.
［3］ 陈胜发，刘彦超，龙凤来 . 杨榕属植物化学成分研究进展［J］. 杨凌职业技术学院学报，2010，9(3) :13－17.
［4］ 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典 . 一部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:258.
［5］ 周向军，高义霞，张 霞 . 响应面法优化黄花菜总黄酮提取工艺［J］. 中国实验方剂学杂志，2011，17(16) :29－31.
［6］ 侯莉伟，杨凤梅，杨 明，等 . Box－Behnken设计优化荷叶总黄酮的温浸提取工艺［J］. 中国实验方剂学杂志，2013，19
(18) :51－54.
［7］ 彭晓霞，路莎莎 . 响应面优化法在中药研究中的应用和发展［J］. 中国实验方剂学杂志，2011，17(19) :296－299.
78第 4期 陈 琳，等:Box－Behnken 设计优化贵州野生地枇杷总黄酮提取工艺