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〔2009-05-06收稿　 2009-09-22修回〕
(编辑　李相军 /张　慧)
楮实提取物体外抗氧化活性的研究
吴兰芳 1　张振东 1　景永帅 1　杨　娟　
(贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室 ,贵州　贵阳　550025)
　　〔摘　要〕　目的　探讨楮实提取物的体外抗氧化活性。方法　先用 80%乙醇 ,然后用蒸馏水对楮实进行提取。其中醇提取物依次用石油醚 、
氯仿 、乙酸乙酯 、正丁醇萃取 ,水提部分经醇沉 、干燥后得到楮实粗多糖。运用羟基(· OH)自由基体系 、二苯代苦味基肼(DPPH· )自由基体系和对
Fe3+的还原能力实验 ,比较楮实各提取物的抗氧化活性。结果　楮实提取物对· OH自由基和 DPPH·自由基均有较好的清除作用 ,其中总醇提取
物对· OH自由基的清除能力最强 ,其IC50值为 0.28mg/ml;乙酸乙酯提取物对DPPH·自由基的清除效果最好 ,其 IC50值达到 0.08mg/ml;各提取物
对 Fe3+均有较强的还原能力 ,乙酸乙酯提取物还原效果最为明显。结论　楮实提取物具有一定的抗氧化活性 ,在抗衰老方面有广泛的应用前景。
〔关键词〕　楮实;抗氧化活性;清除自由基;还原力
〔中图分类号〕　R285.5　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　1005-9202(2010)02-0184-03
TheantioxidantactivitiesofextractsfromBroussonetiapapyriferainvitro
WULan-Fang, ZHANGZhen-Dong, JINGYong-Shuai, etal.
ColegeofLifeofGuizhouUniversity, Guiyang550025, Guizhou, China
【Abstract】　Objective　TostudytheantioxidantactivitiesofextractsfromBroussonetiapapyriferainvitro.Methods　B.papyrifera
wastreatedwith80% ethanolandthentheresiduewasextractedwithwater.Theethanolextractwereextractedrespectivelybypetroleume-
ther, chloroform, ethylacetate, n-butanol.Atthesametime, crudepolysaccharidewasobtainedbyethanolprecipitationfromwaterextract.
Theantioxidantactivitiesoftheaboveextractsinvitrowerecomparedbythehydroxylfreeradical(· OH), DPPHfreeradical(DPPH· )
anddeoxidizationFe3+reactionsystem.Results　TheextractsfromB.papyriferahadgoodscavengingefectonthehydroxylfreeradicaland
DPPHfreeradical.Ethanolextracthadthebestscavengingeffectonhydroxylfreeradicalsystem, whichcorrespondingIC50 valuewas
0.28 mg/ml.EthylacetateextactshadthebestscavengingeffectonDPPHfreeradical, whichcorrespondingIC50 valuereachedto0.08
mg/ml.AlloftheextractshadstrongdeoxidizationabilityofFe3+.Amongofthem, ethylacetateextractshadsignificantdeoxidizationabili-
ty.Conclusions　Broussonetiapapyriferahasstrongerantioxidantactivitiesandwilbewidelyapplicatedonanti-aging.
【Keywords】　Broussonetiapapyrifera;Antioxidantactivity;Radicalscavenging;Deoxidization
基金项目:国家自然科学基金(30760297);国家重点基础研究发展计划
(2009CB526512)
1　贵州大学生命科学学院
通讯作者:杨　娟(1971-),女 ,副研究员 , 博士 , 硕士生导师 ,主要从事
天然活性成分研究。
第一作者:吴兰芳(1985-),女 ,硕士 , 主要从事药食资源开发与利用研
究。
　　楮实子具有活血理气 、补肾清肝 、明目 、利尿的功效 , 多用
于腰膝酸软 、虚劳骨蒸 、头晕目眩 、目生翳膜 、水肿胀满等
症 〔1, 2〕。一些含楮实子的经典方药经多年临床验证具有确切的
抗衰老 、促智作用 〔3〕。机体内氧化自由基增加是导致衰老的主
要原因 , 清除自由基可起到延年益寿的作用 〔4〕。近年来研究发
现楮实子油及楮实子黄酮成分有显著的抗氧化和清除及抑制
氧自由基作用 〔5〕;楮实子红色素能显著清除超氧阴离子及羟基
(· OH)自由基 , 抑制 H2O2诱导小鼠红细胞溶血和肝匀浆自氧
化 , 对肝线粒体也有保护作用 〔6〕。但目前还未见到对楮实聚花
果进行抗氧化活性评价的报道。本实验运用水杨酸法 、二苯代
苦味基肼自由基(DPPH· )法 、Fe3+还原能力的方法对楮实不
同极性溶剂提取物体外抗氧化能力进行评价 , 为楮实更广泛地
应用于医药和开发新型保健品提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂　药材于 2009年 7月采自贵州省贵阳市药
用植物园 , 经贵阳中医学院孙庆文老师鉴定为构树〔Broussone-
tiapapyrifera(L.)Vent.〕的成熟果实。 DPPH· (百灵威公司);
抗坏血酸(Vc)、无水乙醇 、H2O2 、水杨酸 、硫酸亚铁 、铁氰化钾 、
三氯化铁 、磷酸氢二钠 、磷酸二氢钠 、三氟乙酸均为国产分析纯
试剂 , 乙醇为食用级。
1.2　仪器与设备　HP-8453型紫外可见分光光度计(惠普公
·184· 中国老年学杂志 2010年 1月第 30卷
司);JA2003精密电子天平(上海恒平科学仪器有限公司);DK-
98-11电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.3　提取与制备　楮实干燥粉碎 , 80%乙醇回流提取 5次 ,每
次回流 2 h,乙醇提取液减压浓缩至无醇味 ,得楮实总醇提物。
取适量醇提物用水混悬后依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯和正
丁醇萃取 , 各萃取液及萃取后的水层部分减压浓缩至固体 , 真
空干燥后得石油醚提取物 、氯仿提取物 、乙酸乙酯提取物 、正丁
醇提取物及水层部分 ,作为待测样品置于干燥器中保存。
　　将乙醇浸提后的药材残渣在室温下挥去乙醇 , 加入蒸馏
水 , 沸水浴提取 5次 ,每次 2 h。合并水提液减压浓缩至一定体
积 , 加入乙醇沉淀多糖 , 乙醇最终浓度≥80%,沉淀真空干燥后
即为楮实水提粗多糖 ,作为待测样品置干燥器中保存备用。
1.4　抗氧化活性测定
1.4.1　清除· OH自由基 〔7〕　采用 Fenton反应 , 利用 H2O2与
Fe2+混合产生· OH自由基 ,在该体系中加入水杨酸捕捉 · OH
自由基并产生有色物质 , 该物质在 510 nm处有最大吸收。取
各萃取物 50 mg, 用无水乙醇溶解并定容至 25 ml;取粗多糖
50 mg用蒸馏水溶解 ,定容至 25ml, 配制得 2mg/ml的各样品质
量浓度 , 再以该质量浓度配制成所需浓度。 依次加入样品
4 ml, 9 mmol/LFeSO4 0.5 ml, 9 mmol/L水杨 酸 0.5 ml,
8.8mmol/LH2O2 0.5 ml。该体系于 37℃水浴中加热 30 min,
于 510nm处测定样品吸光度(Ai)。用 4 ml蒸馏水代替体系中
的样品 , 测定得空白吸光度(A
0
)。向体系中加入蒸馏水 0.5 ml
代替 8.8mmol/LH2O2 ,测定样品本底吸光度(Aj)。 每个质量
浓度样品做 3个平行 , 取其平均值 , 以 Vc作阳性对照 ,按下式
计算清除率:K(%)=〔A0 -(Ai-Aj)〕/A0 ×100。
1.4.2　清除 DPPH·自由基 〔8〕　DPPH· 自由基是一种稳定
的自由基 , 在有机溶剂中呈紫色 , 在 517 nm波长有较大吸收 ,
当加入抗氧化剂一部分自由基被清除 ,使得在该波长下吸收减
弱 , 可借此来评价物质的抗氧化活性。取各萃取物 50 mg, 用无
水乙醇溶解并定容至 25 ml;取粗多糖 50 mg,用蒸馏水溶解并
定容至 25ml, 配制得 2 mg/ml的各样品质量浓度 , 再以该质量
浓度配制成所需浓度;以无水乙醇配制 0.16 mmol/LDPPH·
溶液 , 避光保存。取 3ml待测样品溶液加入 3 mlDPPH·溶液
于 25℃水浴中加热 15 min, 在 517 nm测得试样吸光度(Ai)。
取 3 ml蒸馏水代替样品测得空白吸光度(A0)。向 3ml样品中
加入 3 ml蒸馏水测得样品本底吸光度(Aj), 每个质量浓度样
品做 3个平行 , 取平均值。以 Vc作阳性对照 , 按下式计算清除
率:K(%)=〔A0 -(Ai-Aj)〕/A0 ×100。
1.4.3　Fe3+还原能力测定 〔9〕　取 2.5 ml不同质量浓度的样
品乙醇溶液 , 加入 0.2 mol/L磷酸缓冲液 2.5 ml及 1%铁氰化
钾 2.5 ml, 50℃水浴反应 20 min后急速冷却 , 加入 10%三氟乙
酸溶液 2.5 ml混匀 , 4 000 r/min离心 10 min, 取上清液5 ml, 加
入 4 ml蒸馏水及 0.1% FeCl3 1ml, 10min后于 700 nm处测定
吸光值。以 Vc作为阳性对照。
2　结　果
2.1　对· OH自由基的清除作用　由图 1可以看出 ,大部分提
取物对· OH自由基都表现出一定程度的清除能力 , 并在实验
浓度范围内呈明显的量效关系 ,但各部分提取物的清除能力都
弱于 Vc。清除能力大小依次为总醇提取物 >氯仿提取物 >正
丁醇提取物 >粗多糖 >水层 >乙酸乙酯提取物。 考虑到样品
本底吸收的影响 , 本实验样品最高浓度为 1 mg/ml,未测定更高
浓度样品的清除作用 。石油醚提取部分效果不明显 , 故未对其
进行比较分析。
　　楮实提取物对 · OH自由基清除活性的半清除率浓度
(IC50 , mg/ml)值顺序为:Vc(0.06)<总醇提取物(0.28)<氯
仿提取物(0.31)<正丁醇提取物(0.41)<粗多糖(0.74)<水
层部分(1.01)<乙酸乙酯提取物(12.44)。半清除率浓度与清
除能力大小成负相关 , 即半清除率浓度越小则清除能力越强 ,
除乙酸乙酯提取物外 ,醇提物的各提取部分的半清除率浓度随
着提取溶剂极性增大而增大。
2.2　对 DPPH·自由基的清除作用　DPPH·自由基属于比较
稳定的有机物自由基 ,广泛应用于测定纯抗氧化剂或植物提取
物的体外抗氧化活性 。以抗氧化剂 Vc作为参照 , 本研究利用
该法对比了提取物的 DPPH· 自由基清除效果。从图 2可看
出 , 各个部分对 DPPH·自由基都表现出较强的清除能力 , 并在
实验浓度范围内呈明显量效关系 ,但各部分的清除能力都低于
Vc, 乙酸乙酯对 DPPH·自由基的清除能力最好。由于样品本
身吸收的影响较大而未对更高质量浓度进行实验。清除能力
大小依次为 Vc>乙酸乙酯提取物 >氯仿提取物 >水层部分 >
正丁醇提取物 >石油醚提取物 >总醇提取物 >粗多糖。
　　对 DPPH·自由基清除作用的半清除率浓度(IC50 , mg/ml)
大小依次为 Vc(0.01)<乙酸乙酯提取物(0.08)<氯仿提取物
(0.09)<水层部分(0.20)<正丁醇提取物(0.32)<石油醚提
取物(0.34)<总醇提取物(0.54)<粗多糖(0.77)。乙酸乙酯
提取物的效果较好 , 但与 Vc仍存在较大差距。
图 1　清除· OH自由基的作用
2.3　对 Fe3+还原能力的测定　还原能力的测定 , 可检验化合
物是否为良好的电子供应体 ,它所提供的电子可以使 Fe3+还原
为 Fe2+, 从而使体系溶液颜色改变 , 即反映出体系中氧化还原
状态的改变。吸光值越大 , 还原力越强 ,抗氧化效果愈佳。由
图 3可看出 , 各提取物的还原能力与其质量浓度都成正的量效
关系 , 在浓度为 0.6 mg/ml时 , 各部分的还原能力大小依次为
Vc>乙酸乙酯提取物 >水层部分 >氯仿提取物 >总醇提取
物 >粗多糖 >正丁醇提取物 >石油醚提取物。
·185·吴兰芳等　楮实提取物体外抗氧化活性的研究　第 2期
图 2　清除 DPPH·自由基的作用
图 3　Fe3+还原能力曲线
3　讨　论
　　楮实多指桑科植物构树〔Broussonetiapapyrifera(L.)Vent.〕
的球形聚花果 , 肉质 , 熟时为橙红色 , 味酸甜 , 可食用。而通常
所说的中药楮实子应为楮实聚花果内的小瘦果 〔10〕。构树的树
叶 、果实 、根 、乳汁均有很高的药用价值 , 近几年部分省份开始
对构树进行产业化开发 〔11〕 ,如湖北省发展 800万亩 ,贵州省种
植 100万亩构树林 ,广西种植 200亩。若按每亩构树年产鲜果
800kg〔12〕计算 , 仅贵州省年产楮实可达 80万吨 , 资源非常丰
富 , 具有很好的开发利用前景。随着增龄 , 机体抗氧化系统的
抗氧化能力下降 , 自由基代谢产物增加。 自由基在细胞内可发
生多位点损伤 , 这些损伤的积累会促使机体老化和引发诸如老
年痴呆 、帕金森病 、癌症 、高脂血症 、糖尿病等相关疾病 〔13 , 14〕。
因而降低自由基代谢产物的生成 ,是延缓衰老的重要途径。本
实验通过 3种评价方法对楮实的体外抗氧化活性进行考察 ,结
果表明楮实具有清除自由基 、增加 Fe3+还原的能力 , 具有很好
的体外抗氧化活性。 这与楮实具有抗或延缓老年性痴呆的作
用是一致的 〔15〕。楮实在预防机体衰老和抗衰老的应用方面应
得到充分的重视。
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(编辑　曲　莉)
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·186· 中国老年学杂志 2010年 1月第 30卷