全 文 ：　复旦学报(医学版)Fudan Univ J Med Sci 2010 May ,37(3)
　国家自然科学基金项目(30873405)
　■Cor responding author　E-mai l:yqy u@shmu.edu.cn
木鳖子提取液抗氧化活性的分析
张 　丹1 　潘 　乐1 　江 　峥1 　胡寅康2 　陈执中1 　郁韵秋1 ■
(1复旦大学药学院药物分析教研室　上海　201203;2上海百棵药业有限公司　上海　201203)
【摘要】　目的　用高效液相色谱法(high perfo rmance liquid chromatog raphy , HPLC 法)测定木鳖子提取液的抗氧化
活性。方法　苯甲酸与 Co2+催化过氧化氢产生的羟基自由基反应 ,生成多种羟基化物 , HPLC 法测定加入木鳖子
提取液前后苯甲酸改变量 ,从而间接测定木鳖子提取液对羟基自由基的抗氧化活性。色谱柱:ODS-100 C18(5 μm ,
150 mm×4.6 mm);流动相:甲醇-乙酸铵水溶液(0.02 mo l/ L , 5∶95);检测波长:230 nm;柱温:25 ℃;流速:1.0
mL/min。结果　苯甲酸的线性范围为 0.08～ 1.6μg(r=0.999 7), RSD<0.96%(n=6)。结论　木鳖子提取液有
一定的抗氧化活性。
【关键词】　高效液相色谱法;　木鳖子;　抗氧化活性;　羟基自由基;　苯甲酸
【中图分类号】　TQ 460.7+2　　【文献标志码】　B
Analysis of antioxidant property of the extract of
Momordia cochinchinensis by HPLC
ZHANG Dan1 , PAN Le1 , JIANG Zheng1 , H U Yin-kang2 , CHEN Zhi-zhong1 , YU Yun-qiu1 ■
(1Department of Pharmaceutical Analysis , School o f Pharmacy Fudan University , Shanghai 201203 , China;
2.S hanghai B aike Pharmaceuticals L td., S hanghai 201203 , China)
【Abstract】　Objective　To analyse the antioxidant activity of the extract of Momordia cochinchinensis by
high pressure liquid chromatography (HPLC)method.　Methods 　Co2+ and H2 O2 were catalyzed by
benizoic to generate the hydroxyl radical reaction which also produced several hydroxylated products.The
variable quantity of benizoic acid before and after adding the ext ract of Momordia cochinchinensis in solution
was monitered by using HPLC method , and the antioxidant activity of the ext ract was determined indirectly.
The HPLC analysis was performed on a C18 analytical column maintained at 25 ℃.The mobile phase
consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate-methanol(95∶5 ,V/V)delivered at a f low rate of 1.0 mL/min.
The UV detection wavelength was set at 230 nm.　Results　The linear range of benizoic acid was 0.08-
1.6 μg(r=0.999 7)with RSD less than 0.96%(n=6).　Conclusions　The extract of the Momordia
cochinchinensis has antioxidant activity.
【Key words】　high pressure liquid chromatography;　Momordia cochinchinensis;　antioxidant activity;　
hydroxyl radical;　benizoic acid
　　木鳖子 ,别名漏苓子 、藤桐子 、土木鳖 ,产于我国
广西 、四川 、湖北等地 ,为葫芦科植物木鳖 Momordia
cochinchinensis (Lour.)Spr 的干燥成熟种子[ 1] 。具
有散结消肿 、攻毒疗疮等药理作用[ 2] 。
自由基生物学研究认为 ,许多疾病与自由基导致
的生物大分子如蛋白质 、脂质以及 DNA 氧化损伤有
关 ,尤其是活性氧如超氧阴离子自由基 、羟基自由基 、
脂质自由基与心脑血管疾病 、糖尿病 、癌症等密切相
关[ 3] 。鉴于上述原因 ,对羟基自由基(·OH)的研究
近年来在医学等领域受到了高度的重视 ,国内外的有
关学者对·OH的作用和影响 、自由基的产生与反应
机制以及自由基的测定方法等进行了多方面的研究。
从中草药中寻找具有清除 ·OH 的活性成分 ,具有很
高的应用价值[ 4-6] 。在研究中草药对 ·OH 的清除
率时 ,一般采用紫外分光光度法或荧光光度法测
定[ 5] 。本实验采用苯甲酸和 Co2+催化过氧化氢产生
319
复旦学报(医学版)　2010 年 5 月 , 37(3)　
的·OH反应[ 7] ,利用高效液相色谱法(high pressure
liquid chromatography ,HPLC法)测定加入木鳖子提
取液前后反应物苯甲酸改变量 ,分析木鳖子提取物抗
羟基自由基的活性。
过氧化氢稀溶液在 Co2+催化下可以生成羟基
自由基:Co2++H 2O 2 Co3+ +OH- +·OH ,生
成的·OH 与苯甲酸发生反应 ,生成邻 、间 、对羟基
苯甲酸以及其他产物。
　　本文采用 HPLC 法 ,观察并测定加入木鳖子提
取液前后反应体系中苯甲酸量的变化情况 ,间接测
定木鳖子提取物的抗羟基自由基氧化的活性 。
材料 和 方法
仪器和试剂　Agilent 1100型高效液相色谱仪(包
括G1322A在线脱气 ,G1312A高压双泵 ,G1313A ALS
自动进样器 ,G1316A 柱温箱 ,G1315B紫外检测器和色
谱工作站),分析天平 [ AB204-E 型 , Mettler Toledo
Inst rument(Shanghai)Ltd] ,pH计[ChinaDelta 320型 ,
Mettler Toledo Inst rument (Shanghai)Ltd] ,涡旋混合
器(XW-80A型 ,上海医科大学仪器厂),纯净水发生器
(Millipore Direct-Q ,密理博公司),低温高速离心机
(TJ-25 Centrifuge)。甲醇(色谱纯 ,美国 Tedia 公司),
间羟基苯甲酸(色谱纯 ,Alfa公司),乙酸铵和磷酸二氢
钾(分析纯 ,中国医药集团上海化学试剂公司),无水乙
醇(分析纯 ,上海振兴化工一厂),苯甲酸(分析纯),邻羟
基苯甲酸(分析纯),对羟基苯甲酸(化学纯>99.0%,国
药集团化学试剂有限公司)。木鳖子提取液的制备:
500 g 木鳖子仁中粉+500 mL 石油醚加热回流 ,过滤。
滤渣用 500 mL 乙醇浸泡 24 h ,减压蒸馏至终体积
为20 mL。
溶液的配制　准确称取 0.68 g 磷酸二氢钾 ,加
入 40 mL 0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液中 ,配成100 mL
pH 7.4的磷酸缓冲液。分别准确称取0.05 g苯甲酸
和邻 、间 、对羟基苯甲酸各 0.025 g ,用 pH 7.4的磷酸
缓冲液溶解于 25 mL 容量瓶中 ,定容成 2 g/ L的苯甲
酸和邻 、间 、对羟基苯甲酸各 1 g/L 的标准溶液 ,避光
保存备用。
木鳖子抗氧化活性的测定　在 5 mL 容量瓶中依
次加入 2 g/L 苯甲酸溶液 0.4 mL 、1 g/L Co2+溶液
0.04 mL和过氧化氢(30%)0.04 mL 以及适量木鳖子
提取液 ,用 pH 7.4的磷酸缓冲液稀释并定容至 5 mL ,
于沸水浴中放置 30 min ,冷至室温 ,0.22μm滤膜过滤 ,
用 HPLC法测定苯甲酸浓度。色谱条件:ODS-100 C18
(5μm ,150 mm×4.6 mm)色谱柱 ,加装 Phenomenex 预
柱(C18 ,4 mm×3.0 mm);柱温:25 ℃;流动相:甲醇-乙
酸铵水溶液(5∶95 ,V/V),0.02 mol/ L;流速:1.0 mL/
min;检测波长:230 nm。相同条件下不加木鳖子提取
液进行对照实验 ,以苯甲酸峰面积作为考察指标 ,结果
见图 1。
图 1　木鳖子提取物抗氧化活性色谱图
Fig 1　Chromotogram of antioxidant property of the extract of Momordia cochinchinensis
A:Standard;B:Benzoic acid and it s hyd roxylated products;C:S am ple
1:P-hydroxy b enzoic acid;2:M-hydroxy benzoic acid;3:Benzoic acid;4:O-hyd roxy benzoic acid.
320
　张丹 ,等.木鳖子提取液抗氧化活性的分析
结　　　果
木鳖子提取液的抗氧化活性　在反应体系中分
别加入不同浓度的木鳖子提取液 ,按“木鳖子抗氧化
活性的测定” 项下进行实验 ,结果见表 1。在 0 ～
100 μL 的范围内苯甲酸峰面积随加入木鳖子提取
液的增加而增加 ,即 ·OH 氧化苯甲酸的反应程度
降低 。说明在此范围内木鳖子提取液的量与清除羟
基自由基作用呈正相关性 。
加入木鳖子提取液后 ·OH 氧化苯甲酸的反应
显著降低(图 1)。随着木鳖子提取液加入量的增
加 ,苯甲酸浓度逐渐增加(被·OH 氧化程度降低),
羟基化产物随之降低 ,其中对羟基苯甲酸降低到未
能检出 ,间羟基苯甲酸部分未检出(表 1)。提示木
鳖子提取液中含有清除羟基自由基的化学成分。
表 1　反应体系中数据分析
Tab 1　Analysis of data in the system
VM(mL) CB(m ol/ L) C P(mol/ L) CM(mol/ L) CO(m ol/ L)
0 0.011 3 — 0.002 4 0.020 2
0.01 0.103 8 — 0.004 4 0.026 4
0.02 0.135 0 — 0.005 6 0.024 4
0.03 0.154 9 — 0.005 6 0.022 5
0.05 0.167 9 — — 0.018 3
0.06 0.181 2 — — 0.014 5
0.08 0.188 6 — — 0.014 2
1 0.190 2 — — 0.012 1
　　VM:Added volume of the ext ract of Momord ia cochinchinensi s;
C B:T he concent ration of b enzoic acid;CP:Th e con cen t rat ion of P-
hydroxbenzoic acid;CM:The concent ration of M-hy droxy benzoic
acid;CO:The concent rat ion of O-hydroxy ben zoic acid.
讨　　　论
实验最佳条件的选择　为确定反应体系中各试
剂合适的用量 ,分别对过氧化氢体积 、Co2+浓度和
苯甲酸的浓度等相关因素进行了检测 。首先 ,在反
应体系中分别加入不同体积(0.01 、0.02 、0.04 、
0.06 、0.08 、0.12 mL)的过氧化氢(30%),测定苯甲
酸峰面积 。结果显示 ,在 0.01 ～ 0.04 mL 范围内 ,
苯甲酸峰面积随着过氧化氢量的递增呈线性递减 ,
当用量超过 0.06 mL 时 ,苯甲酸峰面积递减趋势减
缓 ,这可能是当过氧化氢浓度过大时存在自分解反
应。进一步对 Co2+浓度的影响进行试验 ,在反应体
系中分别加入 0.02 、0.04 、0.06 、0.08 、0.12 、0.2 mL
的 Co2+溶液(1 g/L),测定苯甲酸峰面积 。当加入
0.04 mL Co2+溶液时 ,苯甲酸峰面积为最小 。可能
是因为在 pH 7.4的条件下 Co 2+浓度过大会导致沉
淀的产生 ,体系不稳定 。最后对苯甲酸浓度的影响
进行了试验 ,在反应体系中分别加入 0.2 、0.4 、0.8 、
1 、1.6 mL 的苯甲酸溶液(2 g/ L),测定苯甲酸峰面
积 。实验结果表明 ,当加入苯甲酸量为 0.2 mL 时 ,
没有检测到苯甲酸和邻 、间 、对位羟基苯甲酸。当加
入苯甲酸溶液大于 1 mL 时 ,则峰面积变化不显著。
考虑到 HPLC 仪器的灵敏度 ,以及能够最好地反映
木鳖子提取液加入前后苯甲酸峰面积变化的浓度 ,
最后确定在 5 mL 的反应体系中各试剂的量为:
2 g/L苯甲酸溶液 0.4 mL , 1 g/L Co2+溶液 0.04
mL 和过氧化氢(30%)。
方法验证　分别对苯甲酸 、邻羟基苯甲酸 、对羟
基苯甲酸和间羟基苯甲酸的标准曲线 、精密度和稳定
性进行考察。标准曲线测定如下:在25 mL 的容量瓶
中加入上述的标准溶液适量 ,用 pH 7.4的磷酸缓冲
液稀释并定容 ,配成混合标准溶液 ,经 0.22 μm 滤膜
过滤后 ,进样10μL ,得色谱图 ,以峰面积(y)为纵坐标
与浓度(x)为横坐标做标准曲线 ,得回归方程 。苯甲
酸:y=26 664x+387.17 , r=0.999 7 ,线性范围:0.08
～ 1.6 μg;邻羟基苯甲酸:y =13 000x-42.844 , r=
0.999 1 ,线性范围:0.04 ～ 0.8 μg;对羟基苯甲酸:
y =12 517x+196.3 , r=0.999 9 ,线性范围:0.04 ～
0.8μg;间羟基苯甲酸:y =11 579x +163.22 , r=
0.999 6 ,线性范围:0.04 ～ 0.8μg 。精密度测定如下:
除不加木鳖子提取液 ,其他步骤按“木鳖子抗氧化活
性的测定” 项下进行实验 ,平行测定 6次 ,以苯甲酸
峰面积计算精密度结果 , RSD为 0.96%。稳定性测
定如下:取上述反应体系溶液 ,重复进样 6次 ,每次间
隔 10 min ,以苯甲酸峰面积计算 RSD为0.76%,表明
在测定过程中 ,对苯甲酸 、邻羟基苯甲酸 、对羟基苯甲
酸和间羟基苯甲酸各成分至少可稳定 1 h 。
本实验将 HPLC 用于测定木鳖子提取液抗氧
化活性 ,相对于传统的荧光光度法与分光光度法 ,大
大改善了测定的选择性 ,提高了分析结果的准确度。
本实验同时也证实了木鳖子具有清除自由基的
作用。
参　考　文　献
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(下转第 325 页)
321
　沈强 ,等.电镜下几种凋亡细胞的形态特征
性凋亡细胞。
根据上述观察所见 ,我们认为凋亡细胞在形态
上有一些基本共同的形态特征 ,包括细胞体积小 、胞
质浓缩 、核染色质凝聚而核膜 、质膜和细胞器保存完
好。但核染色质凝聚可有不同形式:有的核染色质
边移 ,凝聚于核膜下 ,有时呈典型的新月形;有的核
染色质凝聚成一大块或数块 ,散布于核内;有的核染
色质致密凝聚成一大块 ,占据整个核区。核染色质
凝聚的不同形式 ,可能是由于细胞处在凋亡的不同
发展阶段(图 2和图 6 ,图 1和图 3),它们是同一种
组织出现的核染色质凝聚形式不同的凋亡细胞;也
可能与细胞种类的不同或诱发凋亡的外界因素不同
有关 ,如本实验在烷化剂诱发的凋亡光感受细胞 ,只
观察到核染色质高度凝聚布满整个核区 ,而未见核
染色质凝聚的其他形式。凋亡细胞的形态是一个复
杂现象 ,有待进一步观察 。
观察培养细胞中的凋亡细胞时 ,因凋亡细胞经
常脱离漂浮于上层液中 ,在制备电镜样品时要将上
层培养液与底层刮下的细胞一同离心成细胞团块 。
致谢　复旦大学附属中山医院泌尿外科郑景存博士 、中
山医院肝癌科李文昌医生和眼耳鼻咽喉科王克岩医生为本
实验观察提供部分样品。
参　考　文　献
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