免费文献传递   相关文献

复方唇香草颗粒对动脉粥样硬化斑块内PPARγ和MMP-9影响的研究



全 文 :新疆中医药
Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine
2014年 第32卷 第5期
2014 Vol.32 No.5
基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金,编号:2012211A073。
作者简介:伍倩(1986-),女,硕士研究生,研究方向:心血管病中医药研究。电话:13565923058
*通讯作者:辛效毅(1963-),男,博士,教授,主任医师,博导,研究方向:心血管病中医药研究。电话:18099186590
复方唇香草颗粒对动脉粥样硬化斑块内PPARγ和MMP-9影响的研究
伍 倩1, 辛效毅2*, 张新蕾1, 陈 悦1, 袁 爽1
(1. 新疆医科大学,新疆 乌鲁木齐 83001l; 2. 新疆医科大学第一附属医院中医科,新疆 乌鲁木齐
830011)
摘要:目的 探讨复方唇香草颗粒对动脉粥样硬化(AS)斑块中PPARγ和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平影响及机理的
研究。方法 将70只6~8周龄Apo-E基因敲除小鼠,予高脂饮食喂养12w后,随机处死10只,取主动脉根部,HE染色普通光
镜下观察并确定AS形成后,其余小鼠随机分为:模型组(生理盐水)、中药对照组(血脂康)、西药对照组(辛伐他汀)及复方
唇香草颗粒高、中、低剂量每组10只给药,12w后处死,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测基质金属蛋白酶-9;用免疫组化染
色法测定PPARγ蛋白表达。结果 与模型组比较,复方唇香草颗粒高、中、低剂量组、中药对照组、西药对照组的PPAR阳
性区域面积百分比增大、血清MMP-9含量下降(P<0.01);与中药低剂量组、中药对照组比较,中药高、中剂量组、西医对照
组的PPARγ阳性区域面积百分比增大,血清MMP-9含量下降,有统计学意义(P<0.05)。结论 复方唇香草颗粒可通过增
大AS斑块中PPARγ的区域面积百分比,降低MMP-9含量,对动脉硬化炎症反应有一定的改善和调节作用。
关键词:唇香草;AS;PPARγ;MMP-9
随着人民的生活水平的提高,AS的发病率也呈
上升趋势,严重威胁人们的生活质量。1999年 roos[1]
提出的炎性损伤学说,认为 AS斑块破裂是造成急
性心脑血管事件的主要危险因子,稳定斑块、防止
破裂,是预防心脑血管事件的重要方法[2]。随着研究
的深入,人们发现基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与冠
状动脉内径狭窄程度有密切相关系,并且与 AS斑
块破裂有关[3]。而且过氧化物酶体增殖物激活受体
(PPARγ)基因多态性不仅直接关系到冠心病发病
及严重程度,并且与冠心病的危险因素有着直接关
联[4]。复方唇香草颗粒是新疆医科大学第一附属医
院中医科几代中医人经长期临床实践将新疆维吾
尔药与传统中药组配而成,具有鲜明地域特色,临
床疗效显著。本实验拟通过复方唇香草颗粒对
PPARγ和 MMP-9的影响,研究其改善炎性反应、稳
定 AS斑块的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物 6~8 周龄 ApoE 基因敲除小鼠(品系
C57BL/6J,北京大学实验动物中心自美国 Jackson
实验室引进并培育)70只,均为雄性,体质量 18~
20g。饲以含脂肪 15%、胆固醇 2%的高脂饲料,饲养
条件为 2级,室温 22~24℃之间,相对湿度 50%。
1.2 药物、试剂与仪器 复方唇香草颗粒(唇香草、
脱力草、苦参、红景天、汉防己、葛根)由新疆医科大
学制剂室制备,根据临床人拟用量与小鼠剂量转换
因子转换的使用剂量为:高剂量组 0.317g/20g;中剂
量组 0.158/20g;低剂量组 0.079g/20g,用蒸馏水配制
成 0.84g/mL 浓度混悬液。血脂康片(规格:0.30g/
粒,国药准字 Z10950029,北大维信生物科技有限公
司),使用剂量 0.2mL/20g。辛伐他汀片(规格:20mg/
粒;国药准字 H10970385,由默沙东制药有限公司
提供)。方法同中药组用蒸馏水配制成 1mL/mg浓度
悬浮液。 OLYMPUS BH2 光学显微镜 (日本
OLYMPUS公司),LKB-V切片机(瑞典 LKB公司),
SN-695型 r测量仪(上海核子所日环光电仪器厂),
1-15K、3K15低温冷冻离心机(美国 Sigma公司),
ABI-7300 型 Real-time 检测仪(美国 ABI 公司),
CL-7200全自动生化分析仪(日本岛津公司),胆固
醇(中国医药集团上海化学试剂公司提供,批号:
20110303);MMP-9定量测定试剂盒(北京新生命生
物制药有限公司);免疫组化试剂盒(北京新生命生
物制药有限公司);猪油,市售。
1.3 方法
1.3.1 模型的建立 将 6~8周龄 ApoE基因敲除小
鼠 70只,饲以含脂肪 15%、胆固醇 2%的高脂饲料
(60Coγ灭菌照射处理) 喂养,12 周后随机处死 10
71
2014年 第32卷 第5期
2014 Vol.32 No.5
新疆中医药
Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine
只,取主动脉,用 HE染色法普通光镜下观察,确定
As形成。
1.3.2 分组及标本处理 其余小鼠随机分为 6组:
模型组(生理盐水)、中药对照组(血脂康)、西药对
照组(辛伐他汀)、复方唇香草颗粒高、中、低剂量每
组各 10只。根据成人每日用药临床推荐的常用量,
按体质量系数比折算成小鼠用量,药物溶于蒸馏
水,灌胃给药,每日 1 次,喂养 12w 后处死全部小
鼠。
1)取小鼠眼底动脉血,置于洁净玻璃管内,
30min内放入 3000r/min离心机内离心 10min,取上
清液,置于-80℃冰箱待测。
2)分离摘取主动脉,由腹正中线纵向剪开后立
即置入 4%多聚甲醛(含 0.1%的 DEPC)固定液固定
48h,待其有一定硬度后,取出动脉,包埋、切片后标
本进行 HE染色,用光学显微镜观察斑块形成。
1.4 标本测定
1.4.1 将小鼠心底部横断面每隔 50μm连续取 6张
切片,切片厚 5μm,用免疫组化染色,采用两步法测
定斑块内 PPAR-γ 蛋白表达 (抗体稀释度为 1:
200),每组均以 PBS代替一抗作为阴性对照,每张
切片在 100倍镜下各选取 5个不同的视野,对阳性
区域累积面积进行定量测定, 以此求取斑块内阳性
区域面积占斑块面积的百分比。
1.4.2 血清 MMP-9含量测定 采用酶联免疫吸附
法(操作按说明书)。
1.5 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件进行分
析。计量资料采用 x±s表示,实验数据经正态性、方
差齐性检验;符合条件后,实验组组间比较用单因
素方差分析(One-way ANOVA)及 LSD 检验;当实
验数据不符合正态性、方差齐性时,采用秩和检验,
检验水准 α=0.05。
2 结果
各组对小鼠斑块内 PPAPγ 和 MMP-9 表达的
影响见表 1。
3 讨论
动脉硬化斑块破裂、脱落是造成心血管事件中
主要危险因素,在斑块演变成易损斑块过程中炎性
反应始终贯穿其中。大量研究表明 PPAPγ,MMP-9
对炎性反应有着重要的影响。
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核激
素受体家族中的配体激活受体,它能对控制脂质和
葡萄糖代谢的基因进行转录调控。有研究表明
PPARγ可通过抑制炎症反应、降低胆固醇、保护血
管内皮、抑制血管平滑肌细胞增殖、改善纤维帽表
面应力等多种途径来干预 AS易损斑块,从而防止
AS的形成。近年有研究发现 PPARγ基因多态性与
超重、肥胖、高血压、2型糖尿病、血脂异常有一定的
相关性,而这些因素又是预测心血管病的一个独立
危险因素。
有研究表明,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)与动
脉粥样硬化关系密切,它既参与了血管的再生又参
与的炎症反应等病理过程[5]。MMP-9属于明胶酶,
能降解各种细胞外基质。Brown等[6]观察冠状动脉旋
切术斑块中 MMP-9的表达后发现不稳定心绞痛患
者的斑块中 MMP-9 的表达较无病变的动脉呈阳
性。张涛等[7]研究发现 MMP-9升高可能直接导致了
斑块破裂。
中医认为 AS的基本病机为心脉痹阻,以心虚
为本,与肝、脾、肾三脏密切联系;以痰浊、血瘀、气
滞为标,是脏腑功能失调、气血津液失衡的共同病
理表现。复方唇香草颗粒是新疆医科大学第一附属
医院中医科根据新疆心血管发病特点研制而出,方
中维吾尔药唇香草又名苏则,维医用于治疗心脏
病、胃病等,具有芳香开泄、舒展清阳、强心利湿、理
气化痰等功效,有抗氧化活性、抗动脉硬化形成作
用;新疆地产药红景天具有调节免疫、抗缺氧的作
用,可抑制 AS的形成;汉防己有抗炎、抑制血小板
聚集、促进纤维蛋白溶解的作用;葛根有改善微循
环、抑制血小板聚集,两药可有效防止 AS斑块的形
成。苦参中的苦参碱有降血脂、抗炎作用,可使内皮
细胞对 LDL的敏感性降低,从而保护内皮细胞。诸
药合用,共奏芳香开泄、益气活血、利湿祛痰之功,
可减轻 AS程度,降低心血管病发病率。
本实验表明,复方唇香草颗粒与辛伐他汀组的
PPARγ阳性表达区域面积百分比均较空白组明显
高,而两组间比较无统计学意义。实验组、西药对照
组小鼠血清 MMP-9浓度较血脂康对照组均有不同
表 1 各组对小鼠 PPAPγ和 MMP-9的影响(x±s)
MMP-9
127.28±11.65
115.36±12.43#
96.21±11.52#*▲
110.48±11.85#
99.57±13.22#*▲
98.68±13.89#*▲
组 别
模型组
血脂康组
辛伐他汀组
复方唇香草颗粒低剂量组
复方唇香草颗粒中剂量组
复方唇香草颗粒高剂量组
n
10
10
10
10
10
10
PPAPγ(%)
9.03±0.96
7.32±1.14#
5.18±1.11#*▲
7.25±1.13#
5.26±0.99#*▲
5.28±1.01#*▲
注:与模型组相比,#P<0.01;与血脂康组相比,*P<0.05;与复方唇香
草颗粒低剂量组相比,▲P<0.05。
72
新疆中医药
Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine
2014年 第32卷 第5期
2014 Vol.32 No.5
程度的降低,具有显著的统计学意义;实验组、西药
对照组组间差异无统计学意义。结果显示复方唇香
草颗粒和辛伐他汀均可抑制血清 MMP-9浓度,增
高 PPARγ阳性表达区域面积的百分比。提示复方
纯香草颗粒抗动脉粥样硬化的作用机制可能与辛
伐他汀相近,其作用机制和抑制炎症反应有关。
参考文献:
[1] Ross.Athemsclerosis -an inflammatory disease [J]. N Engl,
1999,340(8):115-126.
[2] 王记鹏,辛效毅,董文娟.降浊升清汤对 Apo-E基因敲除小鼠主
动脉粥样硬化病理组织形态学、斑块面积和炎症反应的影响[J].
吉林中医药,2012,32(5):496-498.
[3] 梁晓萍,戴 勇,石 丹,等.血清基质金属蛋白酶-9与冠心病
相关性的临床研究[J].中国心血管杂志,2002,7(2):94-95.
[4] 郑 萍.PPARγ基因多态性与冠心病及其危险因素相关性研究
概况[J].中国分子心脏病学杂志,2012,12(2):121-124.
[5] 谢逸群,杨期东.MMP-2、MMP-9与缺血性脑损伤研究进展[J].
国外医学:神经病学神经外科学分册,2000,27:172-174.
[6] BROWN D L,HIBBS M S.KEARNRY M,et a1. I-dentification of
92 -kDa gelatinase in human coronary atherosclerotic lesions.
Association of human athero.sclerotic plaques [J]. J Clin Invest,
1994,94:2493-2503.
[7] 张 涛,李自成,巫少荣.基质金属蛋白酶-9和 C反应蛋白与冠
心病的相关性研究[J].临床心血管病杂志,2008,24(2):88-90.
(收稿日期:2014-09-12)
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
作者简介:顾茂辉(1965-),男,新疆博乐人,实验员,主要从事中药制剂检验研究。电话:0909-2282625。
HPLC法测定复方木香片中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量
顾茂辉1, 姜 雯2
(1.博州食品药品检验所, 新疆 博乐 833400; 2.新疆医科大学第六附属医院药剂科, 新疆 乌鲁木
齐 830002)
摘要:目的 建立测定复方木香片中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量的方法。方法 采用高效液相色谱法,
SHIMADZUVP-ODS(250×4.6mm,5μm,)色谱柱,甲醇-水(68:35)为流动相,检测波长225nm,流速为1.0mL·min-1,柱温为
35℃。结果 木香烃内酯和去氢木香内酯在0.018,2mg·mL-1~0.109,2mg·mL-1(r=0.999,1,n=6)和0.019,4mg·mL-1~0.116,4
mg·mL-1(r=0.999,3,n=6)间呈良好的线性关系,平均回收率分别为98.42%、98.05%,RSD为1.81%、1.92%(n=9),稳定性RSD
为1.34%(n=6),重复性RSD为0.87%(n=6)。结论 建立的定量方法操作简单、精密度高、重现性好,可用于控制复方木香片
中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量测定。
关键词:复方木香片;木香烃内酯;去氢木香内酯;高效液相色谱法
复方木香片是木香、乳香、香附、干姜、阿纳其
根、肉豆蔻、胡椒、玫瑰花八味药组成,具有除湿、收
敛、固精,用于遗精、遗尿、肠炎、腹泻、白带等,临床
疗效显著。木香为菊科木香属植物木香(Aucklandia
lappa Decne.)的干燥根,具有健脾消食、行气止痛的
功效,以及解痉、降压和抗菌作用,中医常用其治疗
胃部胀满、消化不良、呕吐、腹痛和腹泻等症[1]。其主
要活性成分是木香烃内酯和去氢木香内酯,属于倍
半萜内酯类挥发油成分,为有效地控制其质量,现
对君药木香中木香烃内酯和去氢木香内酯含量测
定方法进行了研究 [2-4],建立了高效液相色谱法
(HPLC)测定复方木香片中木香烃内酯和去氢木香
内酯的含量,且阴性对照无干扰,可作为复方木香
片中的含量测定方法,为其质量标准的制定提供参
考。
1 仪器与试药
1.1 仪器 SPD-10AVP型高效液相色谱仪(日本
岛津制造所),包括 LC-10ATVP二元高压泵,SPD-
10AVP 紫外检测器,CTO-10ASVP 柱温箱,SCL-
10AVP系统控制器;LibrorAEG-200电子天平(日本
岛津制造所);Millipore simplicity-185 超纯水器(美
国密理博公司);LS-3120超声波发生器(美国科学
系统公司)。
1.2 试药 复方木香片 (批号:20121216 -1、
201216-2和 201216-3)及其空白样品由新疆素云
诊所提供;木香烃内酯和去氢木香内酯(批号分别
73