全 文 :果 树 学 报 2侧 ) 5, 2 2 ( 3 ) : 2 3 4 一 2 3 7
J o u rn a l o f F ru i t S
e i e n e e
番荔枝根腐病病原菌的鉴定
及其生防真菌的筛选
詹儒林 , 雷新涛 , 何衍彪 , 赵艳龙
(中国热带农业科学院南亚热带作物研究 所 . 广` 东湛江 5 2409 1)
摘 要 : 番荔枝根腐病是番荔枝的严重病害 。 在广东湛江番荔枝果园中 , 从病根中分离到了 5 种 不同的真菌菌株 ,
其中有致病力的 3 种 :寄生疫霉 (践对op h t ho ra p~ “ ic a)
、 棕搁疫霉 (只 p of m i阳 ra ) 、 镰刀 菌 (彻 arI “ m sP . ) , 镰 刀菌的致病
力最强 , 寄生疫霉次之 , 棕悯疫霉的致病力较弱 。 致病力测定表明 了以 上 3 种真菌菌株均有 可能为湛江番荔枝根腐
病的病原菌 。 分别 以各病原菌为靶标 , 用对峙培养法 , 从果园健康番荔枝 的根际土壤和果实 、 叶片筛选到 了 3 个对上
述病原物都有较强拮抗活性的生防菌株 , 经初步鉴定均为木霉菌 (” 咬 {ho 凌~ 印
.
) 防效测定表明 , 这些拮抗菌株均
有很好的防效 , 是极具开发潜能的生防菌株 。
关妞词 : 番荔枝 ; 根腐病 ; 鉴定 ; 生物防治 ; 木霉菌
中圈分类号 : 56 6 7 .9 6 文献标识码 : A 文章编号 : l 《X旧一9 80 (2 0 5 )0 3一2 34一以
I d e n it n c a t i o n Of or o t r o t d i s e a s e s a n d
s u g a r a P P l e
S C r e e m n g
o f b i o c o n tor l fu n g i i n
Z H A N R u 一 l i n , 比 1X i n 一 t a o , H E Y a n 一b i a o , Z H AO Y a n 一 l o n g
( oS 以 h A: ia ,’r叩泌以 O叩 R e s ,二 h 加 t i t以。 . hC io s , 沌。仪龙 m了of T, 叩 ic以 A梦 l〔 u l t u心反论二。 5 . hZ an] “ 价 g , ` uan 洲。叩万24 09 , hC ian )
A卜蛇 r a c t : Ro t or t w a s a se v e er d is e a s e o f s u g ar a p p le (A肋 an s叮
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番荔枝 (A n on an sP p . )又名释迎果 , 林擒 。 是世 各地的报道不一 。 戚佩坤等 l2] 从番荔枝幼苗病根中
界 5 大名果之一 ,属番荔枝科 l ’ l( A n n o n a e e a e ) 。 番荔 分离 到 ylC idn or e ldn is l l a l e n u is z h a n g C
.
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枝已报道病害有 50 多种 。 其中 ,根腐病是番荔枝的 为根腐病的致病菌 。 而莫晓凤等13 从进境的番荔枝
重要病害 , 是制约番荔枝产业发展的主要因素之 幼苗中分离到 了番荔枝根腐病病原菌潮湿镰刀 菌
一 。 受侵染植株根部 的皮层及木质部变黑腐烂 , 有 户公占ar iu m du u m B ut ler 。 高爱平等 l4] 报道 , 番荔枝幼苗
些病根表面长有菌索 ; 地上部分叶片逐渐变黄 , 最 根腐病 由 sP e “ d o lno ans : ol ~
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“ m 引起 , 受其侵
后整株枯死 (图 l一 3 ) 。 在广东湛江市郊的南亚热带 染后根颈腐烂 , 根木质部组 织变黑 , 树体衰弱致
作物研究所 (南亚所 , 下同 )的番荔枝 园 , 每年均有 死 , 在海南粘重板结的砖红壤 中 , 由此病 原菌引起
30% 左 右因 根腐病而 枯 死 , 2仪瞬 年 发病 率高达 的根腐病发病率可达 3 0% 。 H ay w a dr ls 也报道 了 .P
3 .6 8%
。 此病一般在种植后 3 年后开始出现 ,若有台 、 o aln 二 e二m 引起番荔枝幼苗根腐病 。 iF t ez l 等 l6] 从番
风影响时感病更重 。 荔枝成龄树 中分离到 了即 h iu m sP . 和 八yt op h t ho ar
对番荔枝根腐病病原菌的鉴定已早有报道 , 但 sP . ,此 2 种病菌均可引起番荔枝根腐及树体衰退
收稿日期 : 2以抖一 or 一 10 接受 日期 : 20 5刁2一 2 0
墓金项 目 : 中国热带农业科学院院校基金 。
作者简介 : 詹孺林 , 男 , 助理研究员 . 硕士 。 0 7 5 9一 2 9 5 9 3一 , z h a n ur 一in 5 5 5 @ 一6 3 c o m
致谢 : 本研究得到 了美国纽约州大学生物系 H O H H 教授 及中国热带农业科学院南 亚热带作物研究所 的李伟才 、 周毅刚和玛 文星等 l司志
的帮助 , 特此致 谢 !
DOI : 10. 13925 /j . cnki . gsxb. 2005. 03. 010
3 期 詹儒林等: 番荔枝根腐病病原菌的鉴定及 其生防真菌的筛选
在根腐病的防治方面 , 有效的防治措施报道较
少 。 随着无公害农业或绿色食品生产的发展 ,利用
圈 3 番落枝病根菌索
F l.g 3 C o r山雌 on ht e 山se 别蛇 or t
拮抗微生物进行生物防治是一种很好的策略。 将培
养好的拮抗微生物施人土壤中 , 并在土壤中繁殖 ,
可降低土坡中病原菌的密度 ,并对病原菌有抑制作
用 ,减轻病害的程度 。 如 Fan g 等阴用强壮青霉 (eP in -
e i l i
u m户 n ic 以 o s u m )防治柑橘疫霉根腐病 。 S s w a n t 等
同用哈茨木霉 (升交ho de ~ h二葱哪 u m) 、 绿木霉 (.T 。 i`r -女 )和绿色粘帚霉 (lC 记以耐旅“ m o ier 。 )防治由寄生疫
霉仍 p~ it ic a) 和芋疫霉识 co loc as iae )引起的柑橘根腐病 , 可以减少吸收根的腐烂 , 增加树体的生长
量 。
综上所述 , 番荔枝根腐病病原菌 的鉴定已有不
少报道 , 而发病率较高的南亚所果园的病原菌尚不
清楚 。 因此 ,本研究对南亚所的番荔枝根腐病病原
菌进行了初步鉴定 , 然后筛选对其病原菌有拮抗活
性 的生防真菌 , 为番荔枝根腐病的无公害防治打下基
础 。
1 材料和方法
L l 病原菌分离材料
番荔枝病根采集自广东湛江市郊的南亚所番荔
枝种植园 ,均为成龄结果树的病根 。
L Z 培养甚的制备
V一 8 选择性培养基 I 和 n 的配制 , 分别用于对
疫霉菌和腐霉菌的分离 : V一 8 汁 3 40 m L , 加 C a C 0 3
5 9 稍加热溶解 ,离心 ( 4 以洲) r/ m in , 2 0 m in ) ,取 上清
液 , 加蒸馏水定容至 3 仪 )K m L ,分装到 15 个 2 50 m L
的三角瓶 , 每个瓶装 20 m L , 每瓶加 人琼脂 4 9 , 高
压灭菌 。 选择成分 I : B e n o m y l 8 0 卜扩 n . L , R iaf m p i e i n
lX() 林岁 m L , N y s t a ti n 50 林岁m L , H ym e x az o l 80 卜扩
m L
,
A m p i e i l l i n l 0() 卜扩m L ;选择成分 1 : B e n o m y l 80
卜岁m L , R ifa m P ie i n lX() 卜岁m L , N y s t a t i n 50 林岁 m L ,
A m p i e i l l i n 10 卜岁m L 。 加入选择成分 I 时 为 “ v 一 8
选择性培养基 I ” , 加人选择成分 n 时为 ` ’ V一 8 选择
性培养基 n ” 。
P A 培养基 : 马铃薯琼脂培养基 , 不加人葡萄糖 ,
用于其他真菌的分离 。
DP A 培养基 :常规的 DP A 培养基 ,用于保存菌种 。
1 .3 根腐病菌的分离
切取表现典型 根腐病的病根病健 交界处的组
织 , 切成 5 m m x s m m 小块 。 然后把这些小块分成 3
部分 ,第 1部分直接置于 V 一8 选择性培养基 I 上培
养 ; 第 2 部分直接置于 V 一 8 选择性 培养基 n 上培
养 ;第 3 部分则先用 75 %酒精消毒 1 m in ,再用 0 . 1%
的 H g C I: 消毒 1 m in , 后用灭菌水洗 5 次 , 置于 P A 培
养基上培养。 对每个分离物分别进行纯化培养 ,并保
存于试管斜面上备用 。
L 4 致病性的测定
取普通番荔枝 (A . sq
~
a) 种子播种 ,盆栽小
苗 ,土壤事先灭菌 , 每盆取 or 株高度粗度一致的小
苗做致病性测定 。 取疫霉菌菌丝块置于灭菌水中 ,
28℃下培养 1一Z d , 待长出抱子囊后放人 4℃冰箱中
s m in
,让其释放游动抱子 , 制作游动抱子悬浮液 , 淋
于小苗根部 。 腐霉菌以菌丝接种 ,其它真菌均用分生
抱子悬浮液 (约 1护个 / m )L 接种 。 接种后保湿 4 8 h ,
观察发病情况 ,后期进行再分离 。每处理一盆 10 株 ,
重复 3 次 ,对照用无菌水 。 18 d 后调查发病率 。
1.5 番荔枝根腐病菌的鉴定
对有致病力的菌株分别进行鉴定 。 疫霉菌鉴定 :
2 36 22卷
从 V一 8培养基平板 _ L观察菌落形态 , 挑取菌丝于显
微镜下 , 观察菌丝的分枝 和膨 大情 况 , 测定菌丝直
径 ;将 V 一8 平板上长好的分离菌切取小方块移于无
菌水中培养 l 一Z d , 挑取菌落于显微镜下观察抱子
囊形态 、抱囊梗分枝形式 , 测量 80 一 10 个袍子囊大
小 、抱子囊柄的长度 ,观察乳突特征等 。 根据 以上对
分离菌各项形态特征的描述 ,参照魏景超 l9J 的 《真菌
鉴定手册 》 , H o H H 等 l ,伪的《hT e g e n u s 搽州叩 h , ho ar i n
T a i
~ 》等资料进行鉴定
。 其它真菌类的鉴定参照魏
景超阴的《真菌鉴定手册》分别进行鉴定 。
L 6 生防真菌的筛选
在南亚所番荔枝果园中 ,采集健康植株土表以
下 5一 or c m 的根系周围土壤 、 叶片和果实 。 取土 or g ,
加灭菌水 50 m L 于灭菌的三角瓶 中充分振荡混匀 ,
1 《X X) r/ m in 常温离心 or m in , 取上清液 1 m L ,加人
灭菌水 g m L 稀释 。 在稀释液中再取 l m L , 同样加人
灭菌水 g m L 稀释 , 如此重复 4巧 次 。 最后取 5 0 林L
均匀涂于 P D A 平板上 , 置 2 6℃下培养 。 待平板中出
现有单菌落时 ,挑取菌落移入试管斜面中培养 。 另
取干净的番荔枝健康叶片 、 果皮各 10 9 , 置于研钵 中
研磨 , 充分研碎后 与 50 m L 灭菌水混合在三角瓶 中
充分振荡混匀 ,用上述一样 的方法进行培养和保存
菌株 。 然后对各保存菌株进行活化并与各病原菌进
行对峙培养 , 测定抑菌半径 。
L 7 生防菌的鉴定
对有较强拮抗 活性的生防菌株进行鉴定 , 方法
参照 1 . 5 所述 。
1 .8 生防菌的防效测定
取普通番荔枝种子经表 面消毒后在经灭过菌
的土壤中进行盆播 ,小苗长出后 , 分别以各拮抗菌
振荡培养 7 d 的菌液浇人番荔枝小苗的根茎部位 ,
另外 , 以 2 5%瑞毒霉 (M et al ax y l) 可湿性粉剂 6 0 倍
液作为参照 , 对照为无菌水 , 2 5一2 8℃培养 or d 。 然后
以番荔枝根腐病各病原菌的抱子悬浮液或游动袍
子悬浮液在番荔枝的根部进行擦伤接种 , 每处理 3
次重复 , 每重复 or 株小苗 , 10 d 后计算发病率 。
形 、 卵圆形或圆形 , 大小 3 5荀8 林m x 3 0一5 林m ,乳突明
显 。
2
.
1
.
2 棕桐疫霉 .(P p以m i阳a)r 在 V一 8 培养基上菌
落圆形 、 灰白色 , 气生菌丝无隔 、较不丰富 ;菌丝体水
培后形成较多的淡褐色厚垣抱子 ; 抱囊梗一般呈简
单合轴分枝 ;抱子囊形状不规则 , 呈椭 圆形 、 卵圆形
或不对称的弯月形 , 大小 3 8一 7 0 林m x 2 1一4 7 林m , 乳
突明显 。
2
.
1
.
3 腐 霉 (彻h iu m sP . ) 在 PD A 培 养基上菌落
分散 、 近圆形 ,菌丝无隔 ,气生菌丝丰富 、 绒毛状 ;抱
子囊球形或椭圆形 ,顶生或间生 ,直接或简接萌发 。
2
.
1
.
4 镰 刀菌(而 ar iu m sP .) 在 P DA 培养基上菌落
近圆形 ;菌丝纤细 、有隔 , 气生菌丝丰富 ;有小型和大
型分生抱 子 , 小型分生抱子卵形 、 椭 圆形或圆筒形 ,
大型分生抱子纺锤形或镰形 , 两端尖 。
2
.
1
.
5 立枯 丝核 菌 ( R h女oc t o n她 、 o lan i ) 在 P D A 培
养基上菌落不规则 、 灰褐色 ;菌丝有隔 、褐色 ,近直角
分枝 ,并多数在分枝近处形成隔膜 ;菌核褐色 ,平均
如米粒大小 ,形状无规则 ,微菌核常在培养基表面相
互连成壳状 ; 不产生无性抱子 。
.2 2 致病性测定
接种结果表明 , 寄生疫霉 、 镰刀菌的致病力较
强 ,棕搁疫霉的致病力较弱 。 腐霉菌 、 立枯丝核菌的
致病力均很低 ,并且后期没有分离到原菌株 (表 l ) 。
由此可知 , 寄生疫霉 、镰刀菌和棕桐疫霉均有可能为
番荔枝根腐病的病原菌 。
衰 1 番荔枝腐病菌的致病性测定
介 b le 1 T h e r es ul t o f ep t hog e川 e iyt est d gn o n s u g a r a p P le
菌株 发病率 忠株 发病率I so la t e s I n fe c t i o n ar t e (% ) la t e s In fe c t io n art e (% )
寄生疫霉 5 .7 镶 刀菌 5 8刀
只 P
asr
i` ic a 声公叭“ m s .P
棕桐疫霉 31 . 0 立枯丝核菌 .6 8
只 p以m i , o ar Rh众优 t o n i a 3 0 1阴 i
腐霉 3 . 5 对照 住 0
彻 ih mU “ p · C K
2 结果和分析
.2 1 病原菌的分离
从番荔枝根中分离到 5 种不同的真菌 ,分述如下 。
2
.
1
.
1 寄生疫霉 (P h yt o p h th o r a p a r a s it i e a ) 在 V 一 8
培养基上菌落圆形 、 灰 白色 , 气生菌丝无 隔 、 不丰
富 ;菌丝体水培后形成褐 色厚垣抱 子 ;抱囊梗直径
与菌丝类似 ;大部分抱子囊带有抱囊梗 ;抱子囊倒犁
.2 3 拮抗菌的分离 、 筛选及鉴定
对平板上的单菌落逐一进行对峙培养 , 最后获
得 7 个抑菌带较宽的分离物 。通过复筛 ,其中有 3 个
菌株对根腐病病原菌均有较强的抑制作用 , 初步鉴
定为木霉菌 (升交ho de ~ sP
.
)
,分别记为 1T 9 、钩0 和
叨 2 。 其主要形态特征 : 在培养 7 d 的 P D A 培养基上
菌落圆形 , 边缘形成浅绿色毡状的气生菌丝 , 菌落反
面黄绿色 ;分生抱子开始为白色 , 后来转变为绿色 ;
分生袍子梗有粗直的主轴 ,初级分枝间距规则 , 有二
级分枝 ,二级分枝可再次连续分枝 ; 产抱细胞瓶形 ,
3 期 詹儒林等 : 番荔枝根腐病病原菌的鉴定及其生防真菌的筛选
通常在分生抱子梗的顶端呈二歧式轮状 排列 , 较少
单生 ;分生抱子单细胞 ,无色 、浅灰色或绿色 。
.2 4 生防菌对根腐病病原菌的拮抗测定
各拮抗菌对各病原菌的拮抗测定见表 2 , 抑菌
带宽度在 9一 26 m m , 除 T 19 对 声砒 iar “ m sP . 和钩 0 对
而 iar u m sP . 、只 p~ it ic a 的抑制效果较差 外 , 其它
均在 15 m m 以上 , 由此可见 , 筛选到的 3 个拮抗菌
株均有良好的生防潜能 。
衰 2 拮抗菌对植物病原菌的拮抗活性
aT b le Z 肠址 b lot 口 ac d讨yt o f b i oc o n扮 0 1加 n gl
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病原菌
Iso la t e s
拮抗带宽度
W id t h fO i n h i b i切 yr 幼 n e s ( m m )
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,.`寄生疫 . 只 p ~ 。 ic a棕桐疫 . 只 p 以m加。 ar
腐. 腼面um 叩 .
.2 5 拮抗菌的防效测定
表 3 表明 , 每种拮抗菌对各病原菌均有显著的
防效 , 并且大部分优于瑞毒霉 。 表明了每种拮抗菌
对 3 种病原菌均有一定 的抑制作用 , 而且 , 这 3 种
病原菌分属于卵菌和半知菌 , 表明筛选到的拮抗菌
的抑菌谱可能较广 。
衰 3 拮抗菌对番落枝根脚病的防效
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拮抗菌或杀菌剂
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矛砒 ar iu m sP . 是引起南亚所番荔枝根腐病的主要病
原菌 , 同时也说明了本研究的样本采集地的番荔枝
根腐病是几种病原菌复合侵染的结果 , 但初次侵染
菌的确定有待于进一步 的研 究 。 另外 , 分离到的
声飞“ ar iu m sP .具体种名也有待于进一步鉴定 。
.3 2 番荔枝根腐病 的防治
根腐病是番荔枝严重的病害 , 尤其是普通番荔
枝或以普通番荔枝为砧木的植株感病较重 (内部资
料 )o 此病害一旦发生 ,一般经过 3一 年后整个果园
植株陆续死亡 。 本研究采用对峙培养法 , 从番荔枝的
根际土壤 、 叶片和果实中分离到了 3 个有较强拮抗活
性的生防菌株 ,为开辟番荔枝根腐病的生物防治提供
重要的原材料 ,为番荔枝的无公害生产打下基础 。
番荔枝在我国台湾 、 广东 、 福建 、 海南和云南等
地均有种植 , 番荔枝根腐病在各地均有不同程度的
发生 ,有的给番荔枝的生产带来严重的影响 , 因此对
番荔枝根腐病的防治研究在番荔枝生产 中起着重要
的作用 。 本研究对南亚所的番荔枝根腐病作了初步
鉴定 ,并对其生物防治进行 了初步的探索 ,具有一定
的现实意义 , 而至于其他番荔枝种植区的根腐病病
原鉴定及生物防治均有待于进一步研究 。
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飞甘,`臼气àō了
注 : . 数值后的小写字母表示作 .0 05 水平的显著性 , 含有 相同字
母表示没有显著性差异 , 含有 不同字母表示有显著性差异 。
N o t e : * M e an
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3 讨 论
1 1 番荔枝根腐病病原的鉴定
本研究证实了 只 p~ it ic a
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