全 文 ：第 42 卷 第 3 期
2014 年 8 月
贵 州 林 业 科 技
Guizhou Forestry Science and Technology
Vol. 42，No. 3
Aug.，2014
白花兜兰种子无菌萌发及试管成苗技术研究
田 凡 姜运力 罗在柒 王莲辉*
(贵州省林业科学研究院 贵州 贵阳 550005)
摘 要:本研究以白花兜兰种子为外植体，探讨不同添加物培养基对种子胚萌发的诱导、外源激素对继代
增殖、生根培养的影响，并进行移栽试验。结果表明:有机添加物椰乳对原球茎的诱导有较好的促进作用;1 /
2MS + 6 － BA1. 0 + NAAA0. 05 对芽的诱导和增殖起明显的促进作用;1 /2MS + IBA0. 2 mg·L －1对白花兜兰的壮苗
生根起关键性作用因素;碎树皮为栽培基质的移栽成活率达 96%。
关键词:白花兜兰;无菌萌发;快繁
中图分类号:S723. 1 文献标识码:B
Asymbiotic Germination and in vitro Seedling Cultivation of Paphiopedilum emersonii
TIAN Fan JIANG Yun － li LUO － Zai － qi WANG Lian － hui
(Guizhou Academy of Forestry，Guiyang，Guizhou 550005)
Abstract:Using the seeds of Paphiopedilum emersonii as the explants，the effects of different organic additives
on induction of protocorm，and that of plant growth regulators on the growth of subcultures were studied. The result
showed that:1)organic amendment of coconut milk significantly enhanced the induction of protocorm;2)the best
culture medium for induction and proliferation of buds was 1 /2MS + 6 － BA1. 0 + NAAA0. 05;3)the culture medi-
um of 1 /2MS + IBA0. 2 mg·L －1 played the key role in the process of rooting and seedling growth;4)transplants
grown on the bark medium had a survival rate of up to 96%.
Key words:Paphiopedilum emersonii;asymbiotic germination;rapid propagation
白花兜兰 (Paphiopedilum emersonii)属兰科
(Orchidaceae)兜兰属 (Paphiopedilum)多年生草
本植物，是我国特有种，仅分布于贵州南部及广
西，现存植株极其稀少［1］。由于其独特的花朵造
型、持久的观赏花期而具有极高的生物学研究和观
赏价值。近几年，关于白花兜兰的研究报道极为罕
见，仅见过罗毅波等［2］、覃文渊等［3］、覃龙江等［4］
几位学者在白花兜兰的种群资源调查方面做过研
究［2 ～ 4］。由于白花兜兰的观赏价值极高，以致遭到
过度采集，目前已经到了濒临灭绝的边缘，属 “野
生动植物濒危物种国际贸易公约” (CITES)附录
Ⅰ的保护对象，十分珍贵［5］。因此，白花兜兰野生
收稿日期:2014 － 01 － 20 修回日期:2014 － 03 － 04
作者简介:田凡 (1985 ～)女，研实员，主要从事兰科植物保育研究。
* 通讯作者:王莲辉 (1969 ～)女，研究员，主要从事兰科植物保育及快繁技术研究 (E － mail:gzwanglianhui@ 163. com;Tel:0851 －
3921038)
资助:贵州省林业厅年度计划项目 (2008 － 01)。
贵州省科技厅“十一·五”农业攻关项目 (黔科合 NY字 ［2010］ 3029 号)。
3 期 田 凡等:白花兜兰种子无菌萌发及试管成苗技术研究
资源的保护和人工繁育问题亟待引起社会各界的重
视。
兜兰同大多数兰花一样，种子没有胚乳，在自
然环境中需与真菌共生才能萌发，且萌发率极低，
成苗率低;兰花的传统繁殖方式为分株繁殖，繁殖
系数低，速度慢，难以满足保护和开发的要求［6］。
兰花的组织培养始于 20 世纪 60 年代，Morel 采用
大花蕙兰的茎尖为外植体，诱导形成类原球茎并分
化植株，为实现兰花的工厂化生产奠定了基础［7］。
因此组织培养成为兜兰属植物高效繁殖的重要手
段。关于兜兰属植物的无菌苗快繁已有过报
道［8 ～ 12］，但是以白花兜兰种子进行无菌萌发和快繁
的研究报道尚未见。
本试验对白花兜兰的无菌播种与试管快速成苗
进行研究，初步建立一套完整的白花兜兰组织培养
快速繁殖体系，在填补白花兜兰无菌苗和快繁研究
空白的同时，也为今后白花兜兰试管苗的规模化和
产业化提供理论依据和技术支持，最终实现白花兜
兰种质资源的保育及可持续开发利用。
1 试验材料与方法
1. 1 试验材料
供试植物:白花兜兰植株及种子来源于贵州省
荔波县茂兰自然保护区。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 消毒方法
先将白花兜兰种子荚在自来水下冲洗 5 小时，
酒精浸泡 10 分钟，再用 10%次氯酸钠处理 15 分
钟，之后用 0. 1%升汞浸泡 5 分钟，无菌水冲洗 3
～ 5 次，在无菌条件下剥开果皮，将种子撒落于所
配制的各种固体琼脂培养基上。
1. 2. 2 培养基
以 MS、1 /2MS、花宝等为基本培养基。在培养
基中按每升加葡萄糖 30g (生根为 20g)和琼脂 6g
作为固定剂，加热完全融化后调节 pH 值在 5. 2 ～
5. 4 之间，分装入培养瓶中，每瓶 40ml，用瓶盖封
口，每一处理接种 15 ～ 20 瓶，放在蒸气高压锅
(120℃，20min)内灭菌，室温冷却后待用。
1. 2. 2. 1 种子萌发培养基:将种子分别接种到以
下 6 种培养基上:(1)VW;(2)1 /2MS; (3)1 /
2MS + 100mL·L －1马铃薯汁; (4)1 /2MS + 100mL
·L －1香蕉汁; (5)1 /2MS + 100 mL·L －1椰乳;
(6)1 /2MS + 100 mL·L －1苹果汁。
1. 2. 2. 2 增殖分化培养基:前期试验分别对 6 －
BA、NAA进行激素组合及配比试验，共完成了 12
个培养基的试验，筛选了原球茎增殖分化有效培养
基配方为: (1)1 /2MS + 6 － BA0. 5mg·L －1 +
NAA0. 01 + 100mL·L －1椰乳; (2)1 /2MS + 6 －
BA0. 5 + NAA0. 25 + 100ml·L －1椰乳; (3)1 /2MS
+ 6 － BA 1. 0 + NAA0. 05 + 100 mL·L －1椰乳; (4)
1 /2MS + 6 － BA2. 0 + NAA0. 05 + 100 mL·L －1椰乳;
以上培养基均加 2g· L －1活性炭、2. 0% 蔗糖和
0. 6%琼脂。将初代培养的原球茎和小芽分别转接
至培养基 (1) ～ (4)上继代增殖培养。
1. 2. 2. 3 生根培养基:设置 3 种不同激素的培养
基即: (1)1 /2MS + IBA 0. 2; (2)1 /2MS + NAA
0. 2; (3)1 /2MS + IAA 0. 4。将分化出具有 2 ～ 3 片
叶、高 1. 5 cm 左右的小苗从培养瓶中取出转入生
根壮苗培养基 (1) ～ (3)上。
1. 2. 3 培养条件
种子萌发条件:培养室温度维持在 23 ～ 25℃之
间。接种后先暗培养 3 周，观察种子吸胀膨大，有
白色原球体长出，每个处理随机调查 50 粒种子。
随后进行光照培养，每日光照 12h，光照强度 1500
～ 2000 Lx，光培养 6 周。观察原球茎转绿，有叶原
基出现，以白色的原球茎膨大到转绿色小芽的多少
来统计萌发率。
1. 2. 4 炼苗与移栽
将瓶苗从培养室 (恒温室)移至与外界相通的
室内放置 1d后，去瓶盖炼苗 3 ～ 7d (培养基有轻微
污染)后，洗净瓶苗根部的培养基，用 1000 倍甲
基托布津或多菌灵浸泡组培苗根部，放置于通风阴
凉处晾干水分至根系发白变软，即可用于移栽。选
择碎树皮、泥炭土、田园土三种栽培基质为瓶苗栽
培基质。进行正常的水肥管理。
2 结果与分析
2. 1 有机添加物对白花兜兰种子萌发的影响
在兰科植物的无菌播种过程中，添加适量的不
同有机添加物，通常会促进植物的生长与发育。天
然有机物质常用于组织培养，它们对培养的某些植
物的器官、组织或细胞有一定的促进生长的效应。
从表 1 可知，种子接入以上培养基均有原球茎萌
发，其中培养基 (1)上的种子极少萌发，培养基
53
贵 州 林 业 科 技 42 卷
(2)有少数萌发，培养基 (3)中种子的萌发率达
30% ～40%;培养基 (4)和 (6)的萌发率均达
50% ～ 60%。随着培养时间的延长，培养基 (4)
有少部分原球茎变黄，最后褐化死亡;培养基 (6)
有大部分原球茎褐化死亡;培养基 (5)中种子的
萌发率和萌发速度比培养基 (3)、(4)和 (6)都
好，种子萌发率达 80%以上，萌发时间可提前 15d
左右。可见添加椰乳的培养基适宜原球茎的诱导作
用，说明椰子乳中含有大量的植物激素，对细胞和
组织的增殖分化有明显的促进作用，对幼苗生长发
育也有一定的促进作用［9，13］，它们对种子的萌发也
有较好的促进作用［10，14］。
表 1 不同有机添加物对原球茎诱导影响
序号 培养基 原球茎 (粒) 绿色小芽 (瓶) 诱导率 (%)
1 VW 50 4 8
2 1 /2MS 50 9 18
3 1 /2MS + 100 mL·L －1马铃薯汁 50 18 36
4 1 /2MS + 100mL·L －1香蕉汁 50 26 52
5 1 /2MS + 100 mL. L －1椰乳 50 43 86
6 1 /2MS + 100 mL·L －1苹果汁 50 28 56
2. 2 植物生长调节剂对芽分化的作用
从表 2 可以看出，培养基 (1)原球茎少部分
分化成植株，增殖速度慢，达 31%，而且形成的植
株有部分玻璃化现象;培养基 (2)原球茎大多分
化出植株，为 53%，植株有部分褐化死亡现象;培
养基 (3)原球茎大多数分化为植株，为 83%，植
株生长健壮，培养基的增殖效果好，80d 左右能继
代增殖 1 次。所用激素及配比为 6 － BA:NAA 为
20:1，其芽的繁殖系数可达 4 ～ 9;培养基 (4)
原球茎的增殖较快，但是当 6 － BA 为 2. 0 (mg·
L －1)时，分化率下降，说明高浓度的细胞分裂素
对其增殖有抑制作用;在 6 － BA 浓度不变的情况
下，高浓度的 NAA也不利于其增殖［10］，由此可见，
不同配比的细胞分裂素 6 － BA 和生长素 NAA 的组
合是芽分化增殖的主要因素，以 6 － BA 和 NAA 配
比为 20:1 的效果最佳。
表 2 添加不同浓度的 BA和 NAA对芽增殖的影响
序号 培养基 6 － BA (mg·L －1) NAA (mg·L －1) 接种数 (个) 增殖数 (个) 增殖率 (%)
1 1 /2MS + 10%椰乳 0. 5 0. 01 200 62 31
2 1 /2MS + 10%椰乳 0. 5 0. 25 200 106 53
3 1 /2MS + 10%椰乳 1 0. 05 200 166 83
4 1 /2MS + 10%椰乳 2 0. 05 200 130 65
2. 3 植物生长调节物质对壮苗生根培养的影响
当芽长至一定长度时，将芽分割成单个外植体
转入生根壮苗培养基培养［15］。MS 培养基适合种子
的萌发，但生根差，要用 1 /2MS 培养基［16，17］。本
试验将分化出具有 2 ～ 3 片叶、高 1. 5 cm 左右的小
苗从培养瓶中取出分别转入不同激素的培养基上，
小苗都能正常的生长，生根率达 90% 以上。从表 3
可知，虽然培养基 (2)的生根率最高，达到
96%，但是培养基 (2)中的植株根系较弱，偏黄;
培养基 (3)中根系较细，苗生长较弱;培养基
(1)效果最好，植株生长健壮，根系正常，8 周后
长成 3 ～ 4 条肉质根。所以，试验结果以 IBA 所用
浓度为 0. 2 mg·L －1作为生根壮苗培养基为宜。
表 3 不同激素对诱导生根的影响
序号 培养基 不同激素 (mg·L －1) 接种数 (株) 生根数 (株) 生根率 (%)
1 1 /2MS IBA 0. 2 100 94 94
2 1 /2MS NAA 0. 2 100 96 96
3 1 /2MS IAA 0. 4 100 93 93
63
3 期 田 凡等:白花兜兰种子无菌萌发及试管成苗技术研究
2. 4 不同栽培基质对白花兜兰成活率的影响
白花兜兰试管苗自养能力差，移栽养护难度
大，在培养壮苗的基础上应注意温、光、营养、介
质等因素与兰花生物学特性相协调，使移栽白花兜
兰由异养向自养过渡［16］。栽培应保持适宜的温湿
度，置于阴凉通风处栽培，期间不浇水，有利于新
根生长和防止病害发生。从表 4 可知，3 种基质成
活率的对比来看，植株在田园土的适应过程较慢，
碎树皮栽培基质的移栽成活率最高，达 95%以上，
表明其最适合白花兜兰试管苗的生长，即碎树皮的
移栽效果最好。
表 4 不同栽培基质对白花兜兰成活率的影响
序号 栽培基质 栽植株数 (株) 成活株数 (株) 成活率 (%)
1 碎树皮 200 192 96
2 泥炭土 200 146 73
3 田园土 200 130 65
3 结论
综合各试验阶段，初步建立了一套完整的白花
兜兰组织培养快速繁殖体系。以成熟种子为外植
体，分别研究了不同基本培养基、激素配比和天然
添加物对白花兜兰的种子萌发、原球茎增殖、分化
和生根壮苗的影响，从中比较和筛选出适合各个培
养阶段的培养基配方，试验结果得出 1 /2MS培养基
较 VW培养基更有利于白花兜兰种子萌发;在有机
添加物椰乳、马铃薯、香蕉汁、苹果汁的试验中加
入椰乳有利于白花兜兰种子萌发，即种子萌发培养
基为:1 /2MS + 椰乳 100ml· L －1 + 2. 0% 蔗糖 +
0. 6%琼脂。另外，还应考虑种子的成熟度、成活
率等因素以及无菌播种的过程管理。
原球茎增殖和分化是一个复杂的生理过程，培
养基中添加的植物生长调节剂的种类、浓度和配比
对原球茎增殖与分化起主导作用。在原球茎继代增
殖阶段，NAA和 6 － BA 组合对原球茎继代增殖的
作用显著，通过 NAA 及时 6 － BA 浓度配比试验，
以 6 － BA与 NAA 浓度比为 20:1 的效果最佳，即
原球茎继代增殖培养为:1 /2MS + 6 － BA1. 0 +
NAAA0. 05 +椰乳 100ml·L －1 + 2. 0%蔗糖 + 0. 6%
琼脂。在壮苗及生根培养基试验中，以 1 /2MS为主
的基本培养基，浓度的 IBA 0. 2 生根效果最好，植
株生长健壮，根系正常。说明低浓度的 IBA0. 2 有
利于根的生长，高浓度 IBA 0. 4 对根的萌发有抑制
作用，即生根最佳培养基为:1 /2MS + IBA 0. 2 +活
性炭 2g·L －1 + 2. 0%蔗糖 + 0. 6%琼脂。栽培基质
对白花兜兰成活率的影响试验中，碎树皮的移栽成
活率达 95%以上。
白花兜兰试管苗快繁体系的建立，为规模化生
产白花兜兰试管苗提供了理论依据和技术支持，为
控制种苗的质量标准、进行白花兜兰的规范化奠定
了基础。
参考文献
［1］傅立国 . 中国植物红皮书 ［M］ . 北京:科学出版
社，1991.
［2］ Cribb P，Luo YB，Siu G. 2001 Observations on
Paphiopedilum emersonii in south － east Guizhou. Orchid Ｒev.
(2001)，109 (1242):351 ～ 355 .
［3］覃文渊，覃国乐，覃文更，韦迹等 . 白花兜兰的
群落结构特征分析 ［J］ . 北方园艺，2012 (11):78 ～ 80.
［4］覃龙江，刘绍飞，莫家伟，蒙惠理等 . 茂兰保护
区野生白花兜兰种群资源 ［J］ . 农技服务，2012，29 (4);
452.
［5］王贞，丛磊，刘燕 . 兜兰属植物研究现状 ［J］ .
林业科学，2006，42 (7):113 ～ 119.
［6］曾宋君，陈之林，吴坤林 . 兜兰无菌播种和组织
培养研究进展 ［J］ . 园艺学报，2007，34 (3):793 ～ 796.
［7］ Morel G. Producing virus － free. Am. Orchid Bull，29:
495 ～ 497.
［8］丁长春，虞泓，刘方媛，魏兴强 . 杏黄兜兰胚培
养与快速繁殖 ［J］ . 植物生理通讯，2006，41 (1):55.
［9］曾宋君，陈之林，段俊 . 带叶兜兰的无菌播种和
离体快速繁殖 ［J］ . 植物生理通讯，2006，42 (2):247.
［10］曾宋君，陈之林，吴坤林，段俊 . 彩云兜兰的离
体快速繁殖 ［J］ . 植物生理通讯，2009，45 (10):1011.
［11］王莲辉，姜运力，余金勇，罗在柒，陈景艳 . 同
色兜兰的组织培养与快速繁殖 ［J］ . 植物生理学通讯，
(2008)44 (6):1171 ～ 1172.
［12］王莲辉，姜运力，余金勇，罗在柒 . 陈景艳 . 长
73
贵 州 林 业 科 技 42 卷
瓣兜兰的组织培养与快速繁殖 ［J］ . 植物生理学通讯，
(2009)45 (9):887 ～ 888.
［13］王冬云，汪建亚，蔡桁等 . 蝴蝶兰组培不定芽增
殖条件的优化 ［J］ . 华中农业大学学报，2007，26 (6):
856 ～ 858.
［14］陈之林，曾宋君，温铁龙等 . 竹叶兰的无菌播种
和试管成苗［J］ . 植物生理通讯，2006，42 (1):66.
［15］张晨晨，余家平，蒋琳等 . 大花蕙兰高频再生体
系的研究 ［J］ . 植物生理通讯，2007，43 (6):1011 ～
1104.
［16］潘学峰，翁宝实，王小精 . 安诺兰无菌播种组培
快繁技术研究 ［J］ . 亚热带植物科学，2007，36 (4):27
～ 29.
［17］田志强 . 植物激素对大花蕙兰组培快繁的影响
［J］ . 北方园艺，2008，22 (5):
櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
櫋
殹
殹
殹
殹
205 ～ 206.
征 稿 启 示
《贵州林业科技》是由贵州省林业科学研究院主管、贵州省林业科学研究院、贵州省林学会
主办的科技技术类期刊，是中国学术期刊综合评价数据库来源期刊、《中国期刊网》、《中国学术
期刊 (光盘版)》、《中国核心期刊 (遴选)数据库》、万方数字化期刊群、《中文科技期刊数据
库》等中文数据库的全文收录期刊。本刊创刊于 1973 年，季刊，国内统一刊号:CN52 － 1091 /
S，国际大 16 开本精美印刷，全国公开发行，是全国从事林业及相关工作科研、教学、经营、管
理工作者的重要参考刊物和论文发表平台。
1、征稿内容及要求
征稿内容:森林培育、森林生态、林木遗传育种、森林保护、森林经理、野生动植物保护与
利用、园林植物与观赏园艺、经济林、水土保持与荒漠化治理、林业可持续发展、森林工程、木
材科学与技术、林产化学加工工程、林业经济及林业宏观决策研究方面的学术论文、研究报告、
综合评述、学术问题讨论、研究简报、林业技术等。
要求:每篇论文字数原则上不超过 7000 字，按顺序应有标题、作者 (包括标准全称，单位
所在市 (县)和邮政编码)、单位、中英文摘要及关键词、正文、参考文献等项目，基金项目请
在首页脚注中注明资助项目名称及编号。
2、投稿
来稿请发电子邮件到 gygzlykj@ 163． com 或 gzlykjbjb@ 163． com，投稿时请注明工作单位
(高校写到学院或系)、通信地址、邮编、电话、email等联系方式。收稿时间以收到电子邮件的
时间为准。
3、稿件处理
稿件的初审期为 4 个月，未采用时，只通过电子邮件返回审稿意见;需退稿的请投稿时注
明。
作者拥有稿件的著作权，应对其内容的真实性、科学性负责;请勿一稿两投。编辑部拥有稿
件的汇编权及出版权，有权对稿件的文字、图表进行非思想性的修改及删节。
4、收费与稿酬
论文发表时需按要求交纳版面费，期刊出版后即付稿酬 (含网络版、光盘版稿酬)及样刊。
5、声明
本刊为中国学术期刊 (光盘版)电子杂志社、北京万方数据股份有限公司、万方数据电子
出版社、维普资讯网、91 阅读网入选期刊，并由其对外提供信息服务，相关著作权使用费和稿
费由本刊一并支付，如有异议，请在来稿时注明，本刊将作适当处理。
83