全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology，2015，35(2) :25-30
DOI:10． 13523 / j． cb． 20150204
刺糖多孢菌中铵载体蛋白基因 amtS
的克隆及功能研究*
陶文娜 夏立秋＊＊ 丁学知 唐 滢
(湖南师范大学生命科学学院 微生物分子生物学国家重点实验室培育基地 长沙 410081)
摘要 目的:铵离子是细胞内合成各种核酸、氨基酸和辅助因子等含氮化合物的重要原料之一。
微生物细胞膜上的铵载体蛋白介导了铵离子的转运。通过异源表达刺糖多孢菌中铵载体蛋白基
因，研究其对链霉菌产孢能力和次级代谢产物产量的影响。方法:从刺糖多孢菌 S04-41 菌株中克
隆铵载体蛋白基因 amtS，通过接合转移导入天蓝色链霉菌 M145 和变铅青链霉菌 TK24 中，分析
比较 amtS基因的异源表达对其产孢能力和次级代谢产物产量的影响。结果:天蓝色链霉菌重组
菌株 M145 /pMF-amtS和变铅青链霉菌重组菌株 TK24 /pMF-amtS 中放线紫红素的产量分别提高
了 2． 85 倍和 30． 02 倍。结论:刺糖多孢菌中的铵载体蛋白能够提高链霉菌中次生代谢产物的产
量，为进一步研究该基因的功能与对刺糖多孢菌中多杀菌素合成的作用奠定了重要基础。
关键词 铵转运酶蛋白 链霉菌 异源表达 接合转移
中图分类号 Q819
收稿日期:2014-12-03 修回日期:2014-12-22
* 国家“973”计划专项 (2012CB722301)、国家“863”计划
(2011AA10A203)、湖南省自然科学基金(2015JJ6071)、湖南省协同
创新中心项目(20134486)资助项目
＊＊通讯作者，电子信箱:xialq@ hunnu． edu． cn
剌糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵
后能产生对多种害虫具有很好的杀灭效果的次级代谢
产物———多杀菌素(spinosad)。多杀菌素是一种大环
内酯类化合物，由一个四环结构连接两个不同类型的
六碳糖———福乐糖胺和鼠李糖组成。
有报道证实:微生物次级代谢产物的合成受限于
前体和辅助因子，增加聚酮合成前体如乙酰辅酶 A、丙
二酰辅酶 A或甲基丙二酰辅酶 A 的供给，能够提高聚
酮类化合物的合成量［1］。在天蓝色链霉菌(Streptomyce
coelicolor)中同时异源表达二羧酸转运蛋白编码基因和
丙二酰辅酶 A合成酶编码基因，能不断补充辅酶 A 硫
酯的合成量，使得大环内酯化合物的合成量提高了
300%［2］。最近，Luo 等［3-4］通过对刺糖多孢菌比较蛋白
质组学的研究，发现在刺糖多孢菌高产菌株内多杀菌
素合成所需的前体的合成代谢的几个关键酶显著上
调，这为增加前体供给的基因工程策略应用于刺糖多
孢菌的定向遗传改造提供了理论依据。
而前体和辅助因子的合成与微生物细胞内的氮素
代谢有密切联系，微生物细胞中的氮源被分解为氨、铵
离子(NH4
+)或谷氨酸，这些物质是细胞内合成各种核
酸、氨基酸和辅因子等含氮化合物的重要原料。铵载
体蛋白是一类存在于细胞膜上主动转运 NH4
+的载体，
普遍存在于真核生物或原核生物细胞膜上，可将细胞
所处环境中的微量铵离子转运到细胞内，确保细胞内
的铵库稳定和细胞氮代谢的正常运行。第一个被克隆
的铵 载 体 蛋 白 基 因 是 来 自 酵 母 (Saccharomyces
cerevisiae)中的低亲合高容量铵载体基因 mep。研究表
明，mep1、mep2、mep3 这 3 个基因在酵母基因组中表达
铵转运蛋白，它们之间的协同作用能够影响酵母吸收
环境中的铵离子，当外界环境中唯一的氮源只有铵离
子，且铵离子浓度低于 5 mmol /L时，同时缺失这 3 个基
因的酵母突变体不能生长［5］。原核生物中第一个被克
隆的铵载体基因是来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)
中的 nrgA基因。大肠杆菌(E． coli)中的铵载体编码基
因 amtB编码产物由 401 个氨基酸组成，与 NrgA 具有
42% 同 源 性。此 外，从 棕 色 固 氮 菌 (Azotobacter
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 35 No． 2 2015
vinelandii)、巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)和根
瘤菌(Ｒhizobium etli)中也克隆出铵载体蛋白编码基因。
至今未见放线菌中铵载体蛋白的相关报道。
本研究克隆了刺糖多孢菌(S． spinosa)S04-41 菌株
的铵载体蛋白基因(amtS) ，并将该基因导入天蓝色链
霉菌 (S． coelicolor)M145 菌株和变铅青链霉菌
(Streptomyces lividans)TK24 菌株中进行异源表达，通过
比较分析重组菌株的形态、产孢能力、色素产量变化，
初步探讨了 S． spinosa S04-41 菌株中 amtS 基因的功
能，为研究该基因对刺糖多孢菌中多杀菌素合成的作
用奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 菌株和质粒
本实验所用菌株和质粒见表 1。其中，S． spinosa
S04-41 菌株是本研究室选育的刺糖多孢菌野生型菌
株;S． coelicolor M145 菌株和 S． lividans TK24 菌株为
amtS异源表达宿主菌;E． coli Top10 为基因克隆宿主
菌;E． coli ET12567(pUZ8002)为接合转移菌株。pMF
质粒为本研究室构建的 E． coli-Streptomyces 穿梭载体，
为 amtS基因在链霉菌中异源表达载体。
1． 2 培养基及试剂
E． coli培养温度为 37℃，培养基为 LB。链霉菌液
体培养基为 TSBS［6］(TSB培养基另加 10%蔗糖) ，产色
素固体培养基为 Ｒ4C［7］，大肠杆菌-链霉菌接合转移培
养基为 MS［8］，接合子转移培养基为 BHI［9］。在 E． coli
中，氨苄青霉素使用终浓度为 100 mg /L，阿泊拉霉素为
100 mg /L，氯霉素为 25 mg /L，卡那霉素为 50 mg /L;在
链霉菌中，阿泊拉霉素使用终浓度为 50 mg /L，萘啶酮
酸为 40 mg /L。PCＲ试剂、T4 DNA连接酶、限制性内切
酶、pMD-18T载体、DNA分子量标准均购自 TaKaＲa 公
司;生化试剂均购自上海生物工程有限公司。
表 1 菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids
Strains and plasmids Characterization Ｒesource
Strains
E． coli Top10 Cloning host Lab Store
E． coli ET12567(pUZ8002) Dam，dcm，and hsdM containing a nontransmissible oriT mobilizing plasmid Prof． Bibb M． J
S． coelicolor M145 Wild-type S． coelicolor A3(2) Prof． Deng Zixin
S． lividans TK24 Spc-6 SLP2- SLP3- Hopwood et al．
Saccharopolyspora spinosa S04-41 Wild-type derivative with increased yield Lab Store
Plasmids
pMD18-T E． coli cloning vector，AmpＲ TaKaＲa Co．
pMF E． coli-Streptomyces shuttle vector Lab Store
pMF-amtS pMF plasmid carry amtS gene from S． spinosa S04-41 This study
1． 3 刺糖多孢菌 amtS基因的克隆
根据红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)
NＲＲL 2338 中铵载体蛋白基因序列设计引物对扩增
amtS基因:AMTS-F(TCACACATATGGTGAATTCAGGC
GACACCGC)和 AMTS-Ｒ:(TATTATCATGCGCGGCTGC
CCTCCAG)。提取 S． spinosa S04-41 菌株总 DNA 作为
模板，利用引物对 AMTS-F / AMTS-Ｒ 进行 PCＲ 扩增，
扩增条件为:94 ℃预变性 10 min;94 ℃ 1 min，59 ℃ 退
火 1． 5 min，72 ℃ 1min，30 个循环，72 ℃延伸 10 min，20
℃终止 PCＲ反应。纯化 PCＲ 产物，TA 克隆，获得载体
pMD18-amtS。
1． 4 amtS基因链霉菌异源表达载体的构建
用限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ分别对载体 pMF
和质粒 pMD18-amtS进行双酶切，连接，重组获得 amtS
基因链霉菌异源表达载体 pMF-amtS。pMF 和 pMF-
amtS分别转化 E． coli ET12567(pUZ8002) ，获得 E． coli
ET12567(pUZ8002，pMF)、E． coli ET12567(pUZ8002，
pMF-amtS)。
1． 5 amtS基因在链霉菌中的异源表达
E． coli ET12567(pUZ8002，pMF)、E． coli ET12567
(pUZ8002，pMF-amtS)作为供体菌，通过接合转移导入
S． coelicolor 145 和 S． lividans TK24 中。接合子转接到
含 100 mg /L阿泊拉霉素和 50 mg /L 萘啶酮酸的 BHI
62
2015，35(2) 陶文娜 等:刺糖多孢菌中铵载体蛋白基因 amtS的克隆及功能研究
平板上生长，至少转接 2 次，挑取接合子至含 100 mg /L
阿泊拉霉素的 TSB液体培养基中，通过 PCＲ鉴定，获得
重组菌株 M145 /pMF、M145 /pMF-amtS、TK24 /pMF、
TK24 /pMF-amtS。
1． 6 amtS基因表达对链霉菌产孢量及抗生素产量的
影响
将 M145、M145 /pMF、M145 /pMF-amtS、TK24、
TK24 /pMF、TK24 /pMF-amtS 菌株分别接种入 TSBS 培
养基中(按需要添加 50 μg /ml 阿泊拉霉素) ，30 ℃振荡
培养 3 d，取菌液涂布 Ｒ4C 和 GYM 固体培养基，30 ℃
培养 2 d，观察孢子和抗生素的产生情况。
放线紫红素的测定:各链霉菌按 10%的接种量转
接入 50 ml GYM 发酵培养基，培养 5 ～ 8 d，取 20 ml
GYM液体发酵液，加入 1 /10 体积 1 mol /L KOH，混合
均匀后室温下放置 1 h 后离心，取上清液测定 OD633
值［10］。
1． 7 amtS基因在链霉菌工程菌中遗传稳定性检测
将 M145 /pMF-amtS 和 TK24 /pMF-amtS 菌株接种
入 TSB液体培养基中，30 ℃培养 1 d，连续转接入新鲜
TSB液体培养基(无抗生素)中 7 次，取菌液涂布 TSB
固体平板(无抗生素) ，30 ℃培养 2 d 在平板上形成单
菌落，挑取单菌落分别进行阿泊拉霉素抗性检测和
PCＲ扩增 amtS 基因鉴定，研究 amtS 基因在链霉菌工
程菌中的遗传稳定性。
2 结果与分析
2． 1 铵载体蛋白编码基因 amtS 的克隆及表达载体
构建
PCＲ 扩增 S． spinosa S04-41 菌株中的 amtS 基因
(图 1a) ，进行 TA 克隆，挑取转化子进行测序。S．
spinosa S04-41 amtS基因 OＲF为 1284bp，编码 427 个氨
基酸与 S． erythraea NＲＲL2338 菌株中的铵载体编码基
因的 OＲF具有 87%的同源性，氨基酸序列具有 88%的
同源性(图 2)。
对 pMF 和 pMD18-amtS 载体进行 XbaI 和 NdeI 的
双酶切，回收酶切产物，连接，转化大肠杆菌 ET12567
(pUZ8002) ，构建 amtS基因链霉菌异源表达载体 pMF-
amtS(图 1b)。
2． 2 铵载体蛋白的异源表达对链霉菌孢子和抗生素
产生的影响
将 M145、M145 /pMF、M145 /pMF-amtS 和 TK24、
TK24 /pMF、TK24 /pMF-amtS 分别接种到 GYM 和 Ｒ4C
固体培养基上，30 ℃培养 2d，观察孢子和抗生素产生
情况。
图 1 铵载体蛋白基因 amtS的 PCＲ扩增(a)和
链霉菌表达载体 pMF-amtS的双酶切鉴定(b)
Fig． 1 PCＲ product of amtS(a)and restriction
analysis of plasmid pMF-amtS(b)
(a)M:100bp DNA ladder;1:PCＲ product of amt (b)M:DL2000
Marker;1:Ｒestriction analysis of plasmid pMF-amtS
从 GYM 平板和 Ｒ4C 平板正面观察，发现 amtS 基
因的导入使得 M145 菌株的产孢量有所增加。在 GYM
平板上，工程菌株 M145 /pMF-amtS 平板背面颜色明显
深于 M145 /pMF 和 M145 菌株，表明 amtS 基因的转入
提高了 M145 菌株中十一烷基灵菌红素的产量(图
3a)。同样在 Ｒ4C 平板上，M145 /pMF-amtS 菌株背面
颜色深于 M145 /pMF 和 M145 菌株，产孢量也有所提
高，表明 amtS基因的转入也提高了 M145 菌株中放线
紫红素的产量(图 3b)。不同 M145 /pMF-amtS 重组菌
株间产孢能力和次级代谢产物产量统计学上无显著性
差异。
从 GYM平板上，TK24 /pMF-amtS菌株的产孢量和
十一烷基灵菌红素的产量和原始菌株 TK24 比较均没
有明显差异。在 Ｒ4C 平板上，TK24 /pMF-amtS 菌株产
孢量较 TK24 有所增加，而且背面颜色也明显深于对照
菌株，这表明 amtS 基因的转入也提高了 TK24 菌株中
放线紫红素的产量。不同 TK24 /pMF-amtS 重组菌株间
产孢能力和次级代谢产物产量统计学上无显著性
差异。
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 35 No． 2 2015
图 2 S． spinosa中的铵载体蛋白与 S． erythraea中铵载体蛋白的同源性比较
Fig． 2 The homology comparison of ammonium carrier protein between S． spinosa and S． erythraea
图 3 S． coelicolor M145 中异源表达 amtS
基因对孢子和抗生素产生的影响
Fig． 3 Effects of heterologous expression of
amtS gene in S． coelicolor M145 on the
production of spores and antibiotics
(a)Strains were inoculated on GYM agar medium GYM(F):
The front side of plate;GYM(Ｒ) :The reverse side of plate
(b)Strains were inoculated on Ｒ4C agar medium Ｒ4C(F) :
The front side of plate;Ｒ4C(Ｒ) :The reverse side of plate
2． 3 铵载体蛋白的异源表达对链霉菌中放线紫红素
产量的影响
为了定量比较放线紫红素产量，将链霉菌接种到
GYM 液体培养基中培养，取上清液进行 OD633测定。
M145 /pMF空载体对照以及原始菌 M145 相比，其放线
紫红素产量变化不大，M145 /pMF-amtS 放线紫红素产
量比原始菌株提高了 2． 85 倍(图 4a);原始菌株 TK24
和空载体对照菌株 TK24 /pMF 放线紫红素产量极低，
但 TK24 /pMF-amtS 菌株产生了大量的放线紫红素，产
量是原始菌株的 30． 02 倍(图 4b)。
2． 4 链霉菌工程菌的遗传稳定性
工程菌 M145 /pMF-amtS 和 TK24 /pMF-amtS 菌株
在 TSB液体培养基中连续转接培养 7 次，挑取的单菌
落均具有阿泊拉霉素抗性，且菌落 PCＲ 扩增 amtS 基因
都出现阳性信号，表明 amtS 基因在链霉菌工程菌中遗
传稳定性很好。
3 讨 论
多杀菌素是一种新型生物杀虫剂，因其能高效灭
杀靶标害虫，而对非靶标生物低毒，正成为一种环境友
好型生物农药。但是，刺糖多孢菌的多杀菌素含量低。
其野生菌株生长缓慢、发酵生长周期长，限制了多杀菌
素产量的提高和在农田的大面积推广应用。通过常规
理化诱变技术、基因工程技术等，研究关键调控因子，
提高多杀菌素产量、试图缩短其发酵周期是当前一个
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2015，35(2) 陶文娜 等:刺糖多孢菌中铵载体蛋白基因 amtS的克隆及功能研究
图 4 amtS基因的导入对 S． coelicolor M145 菌株
(a)和 S． lividans TK24 菌株(b)
中放线紫红素产量的影响
Fig． 4 Effect of introduction of the amtS gene
on the production of Act in S． coelicolor
M145 (a)and S． lividans TK24 (b)
研究热点。
我们通过本研究分析了刺糖多孢菌中的 amtS 基
因对 M145 菌株和 TK24 菌株的孢子和次级代谢产物产
量的影响。amtS 基因异源表达使 M145 菌株和 TK24
菌株中放线紫红素和十一烷基灵菌红素的产量都得到
提高，其中放线紫红素的产量分别提高了 2． 85 倍和
30． 02 倍，而且 amtS 基因在链霉菌工程菌中具有很好
的遗传稳定性。增加链霉菌细胞内 amtS 的拷贝数，过
量表达铵载体蛋白，改善了细菌的营养状况，提高了对
环境中氮源的利用率，有效保证了次级代谢产物合成
时能量和氮源的充足供应。与放线紫红素生物合成相
似，多杀菌素的合成也属于 PKS合成途径，增加刺糖多
孢菌中 amtS 的拷贝数，有可能增加各类正向调控蛋白
的数量，从而加速多杀菌素的合成。此外，合成多杀菌
素的底物之一———福乐糖胺上连接有一个氨基，加大
细胞内氮源的供应，也有利于福乐糖胺的合成，提高多
杀菌素的产量。
致谢 此研究受到湖南省教育厅一般项目
(13C554)及湖南师范大学青年基金项目(31303)资
助，特表感谢。
参考文献
［1］ Tang Y，Xia L，Ding X，et al． Duplication of partial spinosyn
biosynthetic gene cluster in Saccharopolyspora spinosa enhances
spinosyn production． FEMS Microbiol Lett，2011，325(1) :22-
29．
［2］Waldron C，Matsushima P，Ｒosteck P Ｒ． Cloning and analysis of
the spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora
spinosa． Chemistry and Biology，2001，8(5) :487-499．
［3］Luo Y，Ding X，Xia L，et al． Comparative proteomic analysis of
Saccharopolyspora spinosa SP06081 and PＲ2 strains reveals the
differentially expressed proteins correlated with the increase of
spinosad yield． Proteome Sci，2011，9:40．
［4］Luo Y，Kou X，Ding X，et al． Promotion of spinosad biosynthesis
by chromosomal integration of the Vitreoscilla hemoglobin gene in
Saccharopolyspora spinosa． Sci China Life Sci，2012，55(2) :
172-180．
［5］邓若磊，徐海荣，曹云飞，等．植物吸收铵态氮的分子生物学
基础． 植物营养与肥料学报，2007，13 (3) :512-519．
Deng Ｒ L，Xu H Ｒ，Cao Y F，et al． The molecular basis of
ammonium transporters in plant． Plant Nutrition and Fertilizer
Science，2007，13 (3) :512-519．
［6］Van Wezel G P，Van der Meulen J，Kawamoto S，et al． SsgA is
essential for sporulation of Streptomyces coelicolor A3(2) and
affects hyphal development by stimulating septum formation． J
Bacteriol，2000，182(20) :5653-5662．
［7］Shima J，Hesketh A，Okamoto S，et al． Induction of actinorhodin
production by rpsL (encoding ribosomal protein S12)mutations
that confer streptomycin resistance in Streptomyces lividans and
Streptomyces coelicolor A3(2)． J Bacteriol，1996，178(24) :7276-
7284．
［8］Kesier T，Bibb M J，Butter M J，et al． Practical Streptomyces
Genetics． Norwich (United K) :John Innes Foundation，2000，
488(1) :25-37．
［9］ Chinping Chng，Amy M L，Jonathan A Vroom，et al． A key
developmental regulator controls the synthesis of the antibiotic
erythromycin in Saccharopolyspora erythraea． PNAS，2008，105，
(32) :11346-11351．
［10］Zhang Q，Zhu B Q，Hu H F． Activated antibiotic production by
inducing resistance to capreomycin in Streptomyces lividans and
Streptomyces coelicolor． Chinese Journal of Natural Medicines，
2008，6:57-62．
92
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 35 No． 2 2015
Cloning and Function Study of amtS Gene from Saccharopolyspora spinosa
TAO Wen-na XIA Li-qiu DING Xue-zhi TANG Ying
(College of Life Science，Hunan Normal University，Hunan Provincial Key Laboratory of Microbial Molecular Biology-State
Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology，Changsha 410081，China)
Abstract Objective:Ammonium ion is one of the precursors for biosynthesis of nucleic acids，amino acids
and cofactors． The transportation of NH4
+ through the cell plasma membrane is mediated by ammonium carrier
protein． The ammonium carrier protein encoding gene of Saccharopolyspora spinosa was cloned，and its effects on
the production of secondary metabolites of Streptomyces coelicolor and Streptomyces lividans were evaluated．
Methods:The amtS gene of S． spinosa was cloned into E． coli-Streptomyces shuttle vector pMF and transferred into
S． coelicolor M145 and S． lividans TK24 by conjugation． The phenotypes of the recombinants were compared with
the parental strains，and the effects of amtS overexpression on the production of secondary metabolites were
analyzed． Ｒesults:The yields of actinorhodin and undecylprodigiosin in both M145 /pMF-amtS and TK24 /pMF-
amtS were greatly improved． The yields of actinorhodin were elevated by 2． 85 and 30． 02 times，respectively．
Conclusion:Heterologous expression of amtS from Saccharopolyspora spinosa could improve the production of
secondary metabolites，which provided the important basis for its function study in Saccharopolyspora spinosa．
Key words Ammonium carrier protein Streptomyces Heterologous expression Conjugation
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