全 文 ：蝶兰胚珠发育基因的表达及序列分析
1王　玲　2张宪省 　1钟诲文　2李全梓
1(北京大学生命科学学院　北京　100871)
2(山东农业大学生命科学学院　泰安　271018)
摘要　对从蝶兰(Phalaenopsis sp.)成熟胚珠的 cDNA 文库中获得的 cDNA 克隆 O138 的时空表达特性和序列进行了
分析。Northern 分子杂交结果显示出该基因的mRNA 在成熟胚珠和根中大量积累 , 但在大孢子母细胞时期的胚珠
和子房组织中积累水平很低。 DNA序列分析表明 ,该基因含一个编码 284 个氨基酸 , 分子量为 30 kD蛋白的开放阅
读框架。O138 是一个与成熟胚珠发育相关的基因。
关键词　蝶兰 ,胚珠 , 基因表达 ,序列分析
Expression and Sequence Analysis of a cDNA Relative to
Orchid Ovule Development

1WANG Ling　2ZHANG Xian-Sheng 　1ZHONG Hui-Wen　2LI Quan-Zi
1(College of Life Sciences , Peking University , Beijing 100871)
2(College of Life Sciences , Shandong Agricultural University , Taian 271018)
Abstract　The Phalaenopsis sp.cv.SM 9108 flower provides a good system to isolate ovule-specific genes.
A cDNA library at mature ovule stage has been constructed.A differential screening approach was used to
identify cDNAs representing genes which are expressed in a stage-specific manner during ovule development.
The authors have demonstrated that the expression of a cDNA (O138)was regulated stage-specifically and
tissue-specifically using , Northern blot , and also have analyzed the full sequence of this cDNA.Its further
functional characterization in ovule development will be facilitated.
Key words　Phalaenopsis , Ovule , Gene expression , Sequence analysis
　　胚珠在被子植物的有性生殖过程中起重要作
用 ,因此胚珠的发育一直受到人们的重视。研究胚
珠的发育可以揭示许多有重要意义的发育机制问
题 ,如细胞内极性的建立 、孢子体向配子体的转化 、
孢子体与配子体之间的关系等 。为了解胚珠发育的
分子机制 ,90年代初几个实验室以化学诱变法或 T-
DNA插入诱变法获得了一些胚珠或胚囊发育异常
的突变体 ,并鉴别出一些控制胚珠和胚囊形态发生
的基因[ 1～ 3] 。然而由于材料的原因 ,克隆胚珠发育
基因的工作一直进展较慢 。目前获得的克隆主要来
自拟南芥 、矮牵牛和蝶兰[ 4～ 7] 。由于蝶兰的子房含
有上万枚发育基本同步的胚珠 ,因此它是研究胚珠
发育的理想材料 。它在成熟胚珠时期的 cDNA文库
已被构建 ,并以差异杂交法分离出一批胚珠发育特
异的 cDNA克隆。对 cDNA克隆O108 、O126 、O129等
表达的研究显示 ,它们均为特异性在成熟胚珠中表
达或优势表达的基因[ 4 ,5] 。此外 ,尚有部分 cDNA克
隆的核酸序列及表达特点尚未分析 ,其中包括 cDNA
克隆 O138。本工作详细研究了 cDNA 克隆 O138在
蝶兰不同器官和组织及不同发育时期胚珠中的表达
特性 ,并对其DNA序列进行了分析。Northern blot结
果表明该 cDNA 克隆在成熟胚珠和根中高水平表
达 ,但在大孢子母细胞时期的胚珠和子房组织中表
达量很低 ,是一个与成熟胚珠发育相关的基因。成
熟胚珠是胚珠发育的重要时期 ,涉及配子体向孢子
体的转化 、合子极性的建立 、以及珠被发育成种皮等
一系列重要的发育事件 。我们的工作为从分子水平
上了解这些过程提供了新资料。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　蝶兰(Phalaenopsis sp.cv.SM 9108)　山东

通讯联系人。Author for correspondence.
收稿日期:1997-10-10　接受日期:1998-06-29
＊国家自然科学基金资助项目(No.39470047)。Supported by the Nat ional Natural Science Foundation of China(No.39470047).
植　物　学　报　1999 , 41(3):276～ 279
Acta Botanica Sinica
农业大学温室栽培。
1.1.2　菌株及质粒　转化受体菌 E.coli DH5α。克
隆质粒 pBluescript Ⅱ SK(-)为 Promega公司产品 。
1.1.3　试剂和酶 　DNA 序列分析试剂盒购自
Promega公司 。限制性内切酶和其它工具酶购自华
美生物工程公司 。32P-dATP 为杜邦公司产品。T3 和
T7通用引物由上海生物工程公司合成 。
1.2　方法
1.2.1　总 RNA 分离　总 RNA 的提取按照 Cathala
等[ 8]的方法进行 。
1.2.2　RNA 分子杂交 　取 30 μg 的总 RNA 在
1.2%甲醛变性胶上电泳 6 h后 ,按 Sambrook等[ 9]的
方法将 RNA转移到尼龙膜上。将膜置于预杂交液
(5×SSPE ,5×Danhardt , 0.5%SDS , 50%甲酰胺 , 20
g/L鲑精 DNA)中 , 42 ℃预杂交 6 h 。杂交探针的制
备采用随机引物法[ 9] , 将含有模板 DNA(O138)的
ependarf管置于沸水中变性 3 min ,然后迅速放入冰
水浴中冷却 。依次向 ependarf管中加入 10 μL 反应
缓冲液 、2 μL dNTPs 、1 μL 模板 DNA 、2 μL BSA 、5 μL
32P-dATP 和 5 U的Klenow酶 ,置 37 ℃水浴中反应 3
h 。将标记好的探针于沸水浴中变性 5 min后 ,迅速
置于冰上 , 然后加入预杂交液中 , 42 ℃杂交过夜 。
以洗膜液 1(2×SSPE , 0.1% SDS)和洗膜液 2(1×
SSPE ,0.1%SDS)分别洗膜 2次 ,曝光过夜 。
1.2.3　亚克隆的构建及筛选　采用常规的外切酶
Ⅲ法定向切割 DNA[ 9] 。在 pBluescript Ⅱ SK(-)的
引物结合位点和 O138 的 cDNA之间选择 Sma Ⅰ和
Sac Ⅰ切割。苯酚 、苯酚∶氯仿(1∶1)分别抽提一次 ,
乙醇沉淀并抽干 。用 60 μL 1×的外切酶 Ⅲ缓冲液
溶解 5μg DNA ,置于冰上。在 25个 0.5 mL 离心管
中逐一加入7.5μL SI反应液 ,置于冰床 ,于 37 ℃将
以上制备的DNA温育 5 min。将 2.5μL 溶液移至第
一个内含 SI 反应液的微量离心管中 ,其余 DNA 溶
液中按每 pmol 3′凹端加入 150 U外切酶 Ⅲ ,混匀后
放回 37 ℃水浴中。每隔 30 s从 DNA 溶液中取出
2.5μL 样品 ,放入后续各个含 SI 反应液的离心管
中。取样完毕后 ,于 30 ℃将离心管温育 30 min ,在
各个管中加入 1μL SI终止混合液 ,于 70 ℃温育 10
min ,以使SI酶和外切酶 Ⅲ失活。将离心管置于冰
上 ,每个样品取 2μL通过琼脂糖凝胶电泳分析。并
含所需大小的 DNA片段的各个样品 ,每 10 μL 合并
样品加入 1 μL Klenow 混合液 ,于 37 ℃温育 5 min。
每10 μL合并样品加入 1μL 0.5 mmol/L的 dNTP 溶
液 ,于室温继续温育 15 min。每10μL合并样品加入
40μL连接酶混合液 ,室温温育 2 h。转化适当大肠
杆菌菌株的感受态细胞 ,挑选 20个以上的单菌落 ,
提取质粒 DNA ,用 PCR扩增法筛选亚克隆 。PCR体
系含 T3 和 T7 引物(20 μmol/L)各 1 μL ,浓度为 20
μmol/L 的 dNTP 溶液 2 μL ,10×Taq酶缓冲液 2μL ,
Taq酶 1.0 μL。反应条件:95 ℃60 s ,42 ℃90 s , 72
℃90 s ,35个循环 ,72 ℃继续延伸 7 min ,存于 4 ℃。
琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增出的片段大小 ,获得
12个大小相差 200 bp左右的亚克隆 ,每个亚克隆之
间有 100 bp 左右的重叠区 。对各个亚克隆进行
DNA序列测定。
1.2.4　cDNA序列测定及分析　cDNA序列测定采
用常规的Sanger双脱氧核苷酸终止法[ 9] 。序列的同
源性比较采用 Blast和 Fasta分析软件。
2　实验结果
2.1　基因表达的分析
用Northern blot技术对该基因在植物体的不同
器官和胚珠中的表达进行了研究。其 mRNA在叶 、
花瓣 、授粉后 8周(大孢子母细胞时期)和 12周(成
熟胚珠)的子房壁组织 、以及大孢子母细胞时期的胚
珠组织内积累水平均很低 ,而在根和成熟胚珠的组
织内积累水平相当高(图 1)。
由于该 cDNA 在子房壁组织中表达量很低 ,而
子房壁组织中含有大量叶绿体 ,光合作用强烈 ,表明
该基因不是持家基因(house-keeping gene),而是一个
具有组织特异性表达的基因 。同时由于该基因在胚
珠发育的大孢子母细胞时期的表达量极低 ,显示出
该基因的表达具有时间特异性。目前我们还不了解
为什么它在根组织中的表达量也很高 ,我们推测该
基因参与了成熟胚珠和根组织中所共有的某个发育
事件。
图 1　Northern 杂交分析
Fig.1　Northern hybridization analysis
1.Root;2.Leaf;3.Petal;4.Ovary wall in megasporophyte stage;
5.Ovary wall in mature ovule stage;6.Ovule in megasporophyte
stage;7.Mature ovule.
3 期 王　玲等:蝶兰胚珠发育基因的表达及序列分析 277　
图 2　O138 cDNA克隆的全序列及可能编码蛋白的氨基酸序列
Fig.2　Nucleotide sequence of O138 cDNA clone and the deduced amino acid sequences
278　 植　　　物　　　学　　　报 41 卷
图 3　cDNA克隆的酶切图
Fig.3　Map of cDNA restriction enzyme
1.1 kb DNA ladder;2.The fragment of the plasmid of the cDNA
by Xho Ⅰ and EcoR Ⅰ ;3.The fragment of the plasmid of the
cDNA by EcoRⅠ ;4.Uncutting the plasmid of the cDNA.
2.2　cDNA的序列测定及分析
该 cDNA克隆全长 1 770 bp ,酶切图见图 3。序
列分析表达它含有一个最长的从 591 至 1 449的开
放阅读框架(ORF)。该 ORF 编码了一个含 284个氨
基酸 ,分子量为30 kD的蛋白。用Blast和 Fasta两种
方法将得到的 cDNA 序列(图 2)和目前最新的基因
库中的所有序列进行同源性比较 ,没有发现它和其
他任何基因有显著的同源性 ,我们推测它是一个新
基因 ,其功能可能是参与成熟胚珠和根组织中所共
有的某个发育事件。
值得注意的是用 Blast和 Fasta两种方法均发现
该基因 ORF 的部分区域和基因 FB7-4(floral bud-7
days)[ 10]的 ORF 部分区域有一定的同源性。FB7-4
是从烟草长花芽后 7 d的薄层细胞培养物中克隆到
的 cDNA。用激素诱导的烟草的薄层细胞长花芽后
7 d ,基因 FB7-4在薄层细胞内大量表达 ,然而它在
诱导叶芽生长的薄层细胞中却不表达。它的核苷酸
序列和氨基酸序列和已发表的序列没有显著的同源
性。目前关于 FB7-4的功能亦不清楚。但是它的表
达方式和我们讨论的 O138的 cDNA 有类似之处 ,即
在烟草的根组织中也有较高量的表达。这似乎暗示
着花器官的形成过程中所需要的某些基因也是植物
根发育所必需的 。
　　为了进一步确定该基因的功能 ,必须结合原位
杂交技术分析它在胚珠内的特异性表达 ,并运用反
义 RNA技术 ,观察转基因突变体的表现型。尽管蝶
兰为分离胚珠发育特异基因的良好系统 ,然而它却
不适于进行突变体分析和遗传转化。阐明该基因的
功能 ,需要将该基因转化到某种模式植物(如拟南
芥)中。尽管蝶兰与拟南芥的亲缘关系较远 ,但是其
胚珠的发育过程与拟南芥类似 ,亦为倒生型胚珠[ 2] 。
因此 ,我们希望从这两种植物中获得可以揭示胚珠
发育分子机制的重要资料。
参 考 文 献
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1993 , 5:1291～ 1301
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in wild-type Arabidopsis and two female-sterile mutants.Plant
Cell , 1992 , 4:1237～ 1249
3 　Christopher Gaiser J , Robinson-Beers K , Gasser C S.The
Arabidopsis superman gene mediates asymmetric growth of the
outer integument of ovules.Plant Cell , 1995 , 7:333～ 345
4　Zhang X-S(张宪省), Yan X-X(阎先喜),Ma X-J(马小杰),
Xing S-P(邢树平).Construction of the ovule cDNA library
and gene expression during ovule development in Phalaenopsis
orchid.Acta Biol Exp Sin(实验生物学报), 1995 , 28:227 ～
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5 　 Nadeau J A , Zhang X S , Li J , ONeill S D.Ovule
development: Identification of stage-specific and tissue-
specific cDNAs.Plant Cell , 1996 , 8:213～ 239
6　Elliott R C , Betzner A S ,Huttner E , Oakes M P , Tucker W Q
J , Gerentes D, Perez P , Smyth D R.Aintegumenta , an
APETALA2-like gene of Arabidopsis with pleiotropic roles in
ovule development and floral organ growth.Plant Cell , 1996 ,
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7　Colombo L , Franken J , Koetje E , Went J V , Dons H J M ,
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8　Cathala G , Savouret J-F ,Mendez B ,West B L , Karin M ,Martial
J A , Baxter J D.A method for the isolation of intact
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9　Sambrook J , Fritsch E F , Maniatis T.Molecular Cloning:A
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10　Neale A D ,Wahleithner J A , Lund M , Bonnett H T , Kelly A ,
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3 期 王　玲等:蝶兰胚珠发育基因的表达及序列分析 279