全 文 ：44 卷　1 期
2004 年 2月
微 生 物 学 报
Acta Microbiologica Sinica
Vol.44
February
　No.1
2004
基金项目:湖北省重点科技计划资助项目(952P1007)
作者简介:董洪新(1976-), 男 , 山东高密人 , 硕士 , 助教 , 主要从事应用真菌方面的教学和科研工作。 Tel:86-535-6681053;Fax:86-535-
6014101;E-mail:ytdhx@163.com
收稿日期:2003-05-20 , 修回日期:2003-08-18
阿魏侧耳酸提水溶性多糖的研究
董洪新1 , 2 　吕作舟2
(1 烟台师范学院生命科学学院　烟台　264025)
(2 华中农业大学应用真菌研究所　武汉　430070)
摘　要:从热水浸提过的阿魏侧耳(Pleurotus ferulae)子实体中用3%的三氯乙酸提取出另一种水溶性粗多糖 PFA ,将
PFA经 Sevage法脱蛋白 、透析 、CTAB 络合去沉淀后得多糖 PF3 。苯酚硫酸法测得 PF3 糖含量为 94.1%;用光散射和
GPC 联机测得 PF3 重均分子量为 1.965×106;用 IR和 GC 分析了组成和结构 , PF3 由鼠李糖 、木糖 、葡萄糖 、半乳糖和
甘露糖组成 , 含有α-糖苷键。同时研究了 PF3 对核糖核酸酶的抑制作用 , 表明在浓度 5mg mL 时其抑制率可达
44.4%。
关键词:阿魏侧耳 , 多糖 , 核糖核酸酶 , 抑制
中图分类号:Q935　　文献标识码:A　　文章编号:0001-6209(2004)01-0101-03
　　阿魏侧耳(Pleurotus ferulae lanzi)又名阿魏蘑 、白
灵菇等 ,有较高的食 、药用价值 。我们曾用热水浸提
子实体 ,经分离纯化得到两种具有抗肿瘤活性的多
糖PF1 和 PF2 [ 1] 。从热水浸提过的残渣中用 3%的
三氯乙酸提取 ,经分离纯化得另一水溶性多糖 PF3 ,
同时对PF3 理化特性进行了初步研究 ,并且研究了
PF3 对核糖核酸酶(RNase)的抑制作用 ,国内外尚无
阿魏侧耳多糖这方面的研究报道。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　阿魏侧耳子实体:由北京金信食用菌有限公
司提供。
1.1.2　试剂:D-葡萄糖 、D-甘露糖 、D-半乳糖 、L-鼠
李糖 、L-阿拉伯糖 、D-木糖 、D-核糖 、D-岩藻糖等为生
化试剂(上海试剂二厂);CTAB(溴化十六烷基三甲
基铵)、RNase(核糖核酸酶)为 Sigma 公司产品;RNA
(注射用)由如皋生物化学制药厂生产;透析袋
(D32)为 Bromma公司产品;其他试剂均为国产分析
纯。
1.2　多糖的分离纯化和分析
1.2.1　粗多糖 PFA的提取:将热水浸提过的子实体
残渣加8倍量的 3%的三氯乙酸浸提 , 15℃过夜 ,过
滤 ,离心 ,将提取液用 20%的NaOH中和至 pH 为 7 ,
浓缩 、醇析沉淀 、丙酮洗涤 、真空冷冻干燥得酸提水
溶性粗多糖 PFA[ 2] 。
1.2.2　酸提粗多糖的纯化:将 PFA用 Sevag 法脱蛋
白后 ,加等体积的 0.1mol L CTAB 和硼酸盐缓冲液
(pH8),离心 ,去除沉淀 、上清流水透析 ,乙醇沉淀 、
真空冷冻干燥得白色粉末 PF3 [ 3] 。
1.2.3　糖含量的测定:采用苯酚-硫酸法 ,以葡萄糖
为标准物 ,用 722型光栅分光光度计作比色分析[ 4] 。
1.2.4　紫外分光光度法:将 PF3 配成水溶液 ,采用
UV-160A紫外可见光谱仪扫描(200 ～ 300nm)。
1.2.5　分子量的测定:采用凝胶渗透色谱和光散射
联用法(GPC-LS)测量 。
1.2.6　分子构型分析:采用红外光谱分析 ,用 Nico-
let FT-IR红外光谱仪进行测定 ,以KBr为参照物。
1.2.7　糖组成分析:采用气相色谱法 ,使用 GC-9A
气相色谱仪。
1.3　多糖对核糖核酸酶(RNase)的抑制试验
1.3.1　RNase 的活性测定:参照文献[ 5]进行。
1.3.2 　缓冲液的配制:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液按文献[ 6]配制。
1.3.3　多糖对 RNase 的抑制作用:在系列具塞试管
中 ,分别加入 0.1mol L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液
(pH6.0)1.0mL ,0.06%RNA 1.0mL ,2μg mL RNase 和
不同浓度的多糖 PF3(1mg mL , 2 mg mL , 3 mg mL ,
4mg mL , 5 mg mL)0.5mL , 于 37℃反应 5min , 加入
1.0 mol L HCl 2.5mL , 并在加入 HCl 1min 时读出
DOI :10.13343/j.cnki.wsxb.2004.01.022
OD420值 ,计算抑制率[ 7] 。
2　结果和分析
2.1　多糖的基本物理性质
PF3 为白色粉末 ,较难溶于冷水 ,易溶于热水或
稀酸溶液 ,其水溶液浓度较大时呈胶体状 ,易被醇 、
酮等有机溶剂析出。
2.2　多糖的糖含量分析
以不同浓度的葡萄糖溶液与苯酚-硫酸反应 ,在
490nm处测吸光度 ,得到多糖浓度 x(mg mL)与吸光
度 y 之间线性方程 y =-0.0314+0.2816x ,相关系
数 r =0.9968 , 由此计算出多糖 PF3 的糖含量为
94.1%,可见 PF3 的糖含量较高 。
2.3　紫外光谱分析
多糖 PF3的紫外扫描结果表明 ,PF3 仅在 200nm
显示多糖吸收峰 ,无 260nm 的核酸吸收峰和 280nm
处的蛋白质吸收峰 ,说明 PF3 不含核酸和蛋白质。
2.4　分子量测定
光散射强度在多角度激光散射仪(DAWN ,DSP)
于 632.8nm 波长和 25℃下测量 , 折光指数增量
(dn dc)为 0.140mL g ,溶剂为 0.1mol L 的NaCl ,溶剂
RI值为 1.333。分子量测定结果(表 1)表明 ,PF3 分
布宽度较接近于 1 ,说明其组分比较均一 。PF3 的分
子量与 PF1 和 PF2的分子量(见文献[ 1])相比 ,三者
的分子量各不相同 ,说明 PF3 为另一种多糖组分。
表 1　多糖分子量统计结果
Table 1　Results of molecular weight of PF3
Sample t min Mn (g mol) Mw (g mol) Polydispersity(Mw Mn)
PF3 11.554-23.983 1.418×106 1.965×106 1.385
2.5　红外光谱分析结果
从PF3 的红外光谱图(图 1)可以看出 , PF3 在
1250cm
-1(O-H)、1640cm-1(C=O)和 2925cm-1(C-
H)处显示出多糖的特征吸收峰 ,PF3在 850cm-1有吸
收 ,表示有α-糖苷键吸收峰 ,而在 890cm-1无 β-糖苷
键吸收峰 ,且在 920cm-1 、850cm-1 、760cm-1处有葡萄
吡喃糖特征吸收峰;而 920cm-1吸收峰相对较强 ,表
明含α-D-葡萄糖 。
2.6　多糖的单糖组成分析
将PF3 制成三甲基硅烷衍生物进行气相色谱分
析 ,标准单糖和多糖 PF3 的水解衍生物的气相图谱
见图 2。与标准单糖比较 ,根据气相色谱分析中各
图 1　PF3的红外光谱图
Fig.1　IR spectrum of PF3
峰面积算出单糖组成的百分比。多糖 PF3 的单糖组
成和含量汇集于表 2。从中可以看出 , PF3 由鼠李
糖 、木糖 、葡萄糖 、半乳糖和甘露糖组成 ,其中含有较
多的葡萄糖和半乳糖。PF3 的单糖组成和含量与
PF1和 PF2 的单糖组成(见文献[ 1])相比 ,三者的单
糖组成和含量不相同 ,说明 PF3为不同于 PF1和 PF2
的另一种多糖组分 。
图 2　标准单糖(a)与 PF3 衍生物(b)的气相色谱图
Fig.2　GC traces of standard sugar(a)and PF3(b)
1.Arabinose;2.Ribose;3.Rhamnose;4.Fucose;
5.Xylose;6 , 9.Glucose;7.Galacose;8.Mannose.
表 2　多糖 PF3 的单糖组成和含量
Table 2　Content of components of PF3
Sample
Content %
Rha Xyl Glc Gal Man
PF3 0.82 2.46 37.05 54.74 4.92
Rha:Rhamnose;Xyl:Xylose;Glc:Glucose;Gal:Galactose;Man:Mannose.
102 微　　生　　物　　学　　报 44 卷　
2.7　PF3 对 RNase的抑制结果
不同浓度的 PF3 对 RNase 的抑制作用结果见表
3。从中可以看出 ,当 RNA 浓度为 0.06%,酶浓度为
2μg mL ,反应 5min时 , PF3 对 RNase 的有抑制作用 。
随着多糖浓度的增加 ,抑制率增加 ,在 5 mg mL 较高
浓度时 ,PF3 对 RNase 的抑制率高达 44.4%。
表 3　多糖 PF3对 RNase的抑制率
Table 3　Inhibi tion of PF3 on RNase
Concentration of PF3 (mg mL) 1 2 3 4 5
Inhibition rate % 6.8 18.5 26.8 40.9 44.4
3　讨论
通过对多糖 PF3 的分析测试 ,与已报道的另两
种多糖组分PF1 和 PF2在分子量和单糖组成及含量
等方面相比存在不同 ,说明PF3 为不同于 PF1 和 PF2
的另一种多糖组分 ,表明在经热水浸提出PF1 和PF2
的阿魏侧耳子实体残渣中还可以用酸提取出另一种
多糖 PF3 。多糖的结构测定是非常困难的 ,本研究
通过红外光谱法对其分子构型作了初步分析 ,当然
要彻底弄清楚多糖的结构 ,还需通过其他物理学 、化
学和生物学等方法来进行大量的工作。外源性核糖
核酸(RNA)可促进蛋白质的生物合成 ,调节细胞分
化和基因表达 ,临床上应用较广 ,疗效显著 。为了防
止体内核糖核酸酶(RNase)降解作用 ,本文研究了
PF3对 RNase的抑制作用 ,以期与核糖核酸的治疗
起协同作用 ,提高核糖核酸的疗效进行初步试验 ,其
作用机理及抑制作用最佳条件尚待进一步探讨 。
本文研究了 PF3 的基本理化特性和对 RNase 的
抑制作用 ,PF3 是否有其他生物活性和实用价值仍
需做继续深入研究 。
参 考 文 献
[ 1 ] 　董洪新 ,吕作舟.阿魏侧耳多糖的分离纯化与抗肿瘤活性的
研究.微生物学通报 , 2003, 30(2):16-19.
[ 2 ] 　张丽萍 ,李　森 ,黄丽萍.金顶侧耳酸提水溶性多糖的研究.
真菌学报 , 1993 ,12(2):158-162.
[ 3 ] 　张　欣 ,吕作舟.香菇菌盖多糖的提取纯化及其理化性质的
研究.华中农业大学学报 , 1998 , 17(6):537-541.
[ 4 ] 　张惟杰主编.糖复合物生化研究技术.第二版.杭州:浙江大
学出版社 , 1999 ,1-540.
[ 5 ] 　Roth J S , Milstain S W A.New assay method with P32 labled yeast
ribonucleis acid.J BioChem , 1952 , 196:489
[ 6 ] 　杨新美主编.食用菌研究法 , 北京:中国农业出版社 , 1998 ,
310-314.
[ 7 ] 　李泰明 ,王香琴 ,吴文俊 , 等.几种多糖对核糖核酸酶的抑制
作用.药物生物技术 , 1997, 4(2):109-113.
Study on Soluble Polysaccharide by Acid Extraction from Pleurotus ferulae
DONG Hong-Xin1 , 2＊　LU Zuo-Zhou2
(1College of Life Science , Yantai Normal University , Yantai　264025 , China)
(2 Institute of Applied Mycology , Huazhong Agricultural University , Wuhan　430070, China)
Abstract:The water-soluble polysaccharide PFA isolated by 3% trichloroacetic acid extraction from residues of fruit bod-
ies of Pleurotus ferulae , Proteins were removed from PFA by Sevag method , and dialysed with water , precipitated with
CTAB , and supernatant precipitated with alcohol , PF3 was obtained.PF3 contained 94.1% carbohydrate , the Mw of PF3
was 1.975×106.The components and structure of PF3 were analyzed by IR andGC.PF2 consisted of rhamnose , xylose ,
glucose , galactose , mannose;and PF3 containedα-glucoside.It was found PF3 had inhibition on RNase , inhibition rate
was 44.4% at 5mg mL concentration of PF3.
Key words:Pleurotus ferulae , Polysaccharide , RNase , Inhibition
Foundat ion item:Key Project of Science Technology of Hubei Province(952P1007)
＊ Corresponding author.Tel:86-535-6681053;Fax:86-535-6014101;E-mail:ytdhx@163.com
Received date:05-20-2003
103　1 期 董洪新等:阿魏侧耳酸提水溶性多糖的研究